2.1. 随机突变、克隆活性监测和自动处理

使用简并引物“RDM1”对EcAIII序列进行随机突变（表示我们的第一次随机突变；补充图S1)，在蛋白质序列的206、207、210和211位置引入随机氨基酸。在这个命名方案中，本文中描述的所有变体都被标记为“RDM1”-X（X）'，其中X（X）是筛选出的特定菌落的序数（表1,补充图S2). 根据经典的QuikChange协议进行PCR。将EcAIII基因克隆到pET-11d载体中作为PCR基质。PCR后，用DpnI核糖核酸酶消化基质，PCR产物转化为大肠杆菌BL21金电池。

在补充了100µg ml的培养皿上培养过夜⁻¹随机选择氨苄西林单菌落，转移到1ml液体LB培养基中。过夜生长后，将0.5 ml液体培养物添加到4 ml新鲜LB培养基中，加入氨苄西林，并在37°C下剧烈搅拌4 h。然后，在4°C下培养30 min，然后用2 mM（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）和培养物在18°C下摇晃培养。隔夜培养后，离心每种培养物0.5 ml。将颗粒重悬于90µl 50 m中M（M）Tris–HCl pH 8.0缓冲液，然后添加10µl裂解试剂CelLytic B（Merck）。在室温下进行细胞裂解15分钟，剧烈摇晃。对细胞悬浮液进行离心，并对澄清的细胞裂解液进行L（左）-天冬酰胺酶活性试验。

L（左）-在pH 8.0（50 mM（M）Tris–HCl），使用纳氏试剂和10 mM（M） L（左）-Asn作为基底。将10µl细胞裂解液与底物孵育15分钟后，添加30µl纳氏试剂，观察颜色的变化。所有实验均与阳性对照组一起进行，阳性对照组包括在与分析克隆相同的条件下并行表达的含有野生型（WT）EcAIII的细胞裂解液和阴性对照组，阴性对照组包括未转化的细胞裂解物大肠杆菌BL21金细胞在相同条件下培养。随机EcAIII（以及WT EcAIII）的表达水平和提交的自动处理α/β通过SDS–PAGE监测。在对SDS–PAGE凝胶进行活性测试和分析后，对编码随机蛋白质序列的选定质粒进行分离和测序（Genomed，波兰）。成功测序的克隆受到大规模蛋白质表达和生物物理研究的影响。

2.2. 大规模蛋白质表达和纯化

将起始培养物转移到1 l LB培养基中，并在37°C下培养细胞，直到OD₆₀₀接近1.00。接下来，将培养物冷却至4°C 30分钟，并使用0.5 mM（M）IPTG。在18°C下过夜进行表达。通过离心法收集细胞。细胞颗粒在20 m内重新悬浮M（M）Tris–HCl pH 8.0缓冲液和细胞裂解通过超声波处理，然后离心。澄清的细胞裂解液通过离子交换色谱法（DEAE-Sepharose，默克）。使用2的梯度从色谱柱中洗脱馏分M（M）20米内的氯化钠M（M）Tris–HCl pH 8.0。通过SDS–PAGE分析组分，并将含有所需蛋白质的组分合并、浓缩并装载到尺寸排除色谱法（SEC）柱（Sephadex G75，GE Healthcare）连接至一个Ala KTA FPLC色谱法系统（GE Healthcare）。

2.3. 生物物理测量

在进行生物物理测量之前，在Superdex 75 10/300 GL（GE Healthcare）上使用20 mM（M）磷酸盐缓冲液pH 7.5。在Jasco J-815分光光度计上使用0.5–1.0 mg ml的蛋白质浓度范围记录Far-UV CD光谱⁻¹路径长度为1mm。对缓冲液基线的光谱进行校正，并在222 nm处归一化为相同的值。使用Prometheus NT.48（NanoTemper Technologies）和每毛细管约10µl的样品体积（蛋白质浓度0.5–1.0 mg ml），通过nanoDSF监测热稳定性⁻¹). 初始荧光扫描（330和350 nm发射）表明，所有样品都在可检测浓度范围内。将熔化扫描记录为蛋白质样品在20–95°C温度梯度下1°C min的荧光发射⁻¹.

2.4. 结晶、X射线数据采集和结构细化

蛋白质（浓度范围为10-15 mg/ml⁻¹)在20°C下通过悬挂液滴中的蒸汽扩散结晶。晶体从含有20–30%PEG 4000或PEG 6000，0.2的溶液中生长M（M）氯化镁₂100米M（M）Tris–HCl pH 8.5。使用同步辐射在汉堡DESY的PETRA III储存环的EMBL光束线上收集X射线衍射数据，或使用铜K（K）α家用Synergy-S或Synergy-R XtaLAB（Rigaku）发生器发出的辐射。衍射图像使用CrysAlis公司^赞成（里加库），C人物配对关系4（优胜者等。, 2011)或XDS公司（卡布施，2010年)包。结构的求解方法为分子置换使用相位器（麦考伊等。, 2007)并用REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)使用各向异性或TLS协议。电子密度图在库特（埃姆斯利等。, 2010). 所有晶体结构在单位电池使用ACHESYM公司服务器（Kowiel等。2014年). 表2总结了所有数据收集和结构定义统计数据。使用PyMOL公司与RDM1突变体的一系列晶体结构一起，以1.55Å的分辨率确定了WT蛋白的结构（没有结合配体）。

2.5. 生物信息分析

根据WT和EcAIII所有其他新变体的氨基酸序列，使用AlphaFold公司2代码（跳线等。, 2021). 人工智能（AI）建模是针对单个WT-EcAIII原聚体和二聚体结构进行的。然而，由于AlphaFold公司2算法在应用于寡聚蛋白时，在后一种情况下经常观察到残基之间的冲突。因此，最终这些结果被拒绝，分析仅限于未处理变体的“单体”结构。

3.1. 突变

在诱变实验中，将四个位置的残留物随机化（表1). 突变位点是根据对晶体结构WT EcAIII如下。Gly206位于Arg207之前，这对于α-底物的羧酸基团，而Ser210位于Asp211的前面，它负责底物氨基的结合L（左）-Asn基板（图2). 由于它们参与底物结合，这些残基(即Arg207和Asp211）对于L（左）-天冬酰胺酶活性。然而，它们对高压蒸煮过程的贡献目前尚不清楚。

在我们的研究中，共分析了64个随机克隆，即受到L（左）-天冬酰胺酶活性（纳氏反应）和自蛋白水解（SDS-PAGE）试验(补充图S2). SDS-PAGE分析表明，几乎所有的变异都是在小规模上高效产生的，表达水平相似。奈斯勒的测试表明所有的突变体都不能水解L（左）-阿斯。SDS–PAGE凝胶显示，大多数变体仍以未加工、未成熟的形式存在（没有对应于α/β亚单位）。然而，对于某些克隆，自动处理是显而易见的。在某些情况下，凝胶上具有非典型分子量的单个条带表明，全长蛋白的表达被引入序列的STOP密码子终止(补充图S2). 为了检查缺乏自动处理的起源，随机选择编码21个克隆的基因（12个蛋白质加工成亚单位，9个未加工）进行DNA测序(补充图S2). 最后，分析了15个蛋白质基因（8个加工蛋白质和7个未加工蛋白质）。表1总结了序列分析结果.

3.2. 热稳定性和CD光谱

大多数RDM1突变体保留次级(补充图S3)以及第四纪构造WT蛋白的(补充图S4). 所分析变体的标准化熔化曲线如图3所示，而吨_米表1总结了这些值结果表明，与WT蛋白相比，所有未处理的变体的热稳定性降低了10°C以上。此外，一个多步骤变性对他们中的大多数人都观察到了这一过程。分析吨_米其中的自动处理突变体揭示了它们可以分为两组：减少（RDM1-3、RDM1-8、RDM1-29和RDM1-37）和增加（RDM1-12、RDM10-18、RDM2-24和RDM1-3）的突变体吨_米值（图3，表1). 它们都具有相同的熔化轮廓，在给定的吨_米在结晶实验之前，通过CD光谱分析蛋白质折叠(补充图S3). 一般来说，几乎所有突变体的光谱都与WT蛋白的光谱相似；然而，对于所有未经处理的变体，在195nm处观察到信号强度降低，表明这些变体的系统性结构畸变，这可能是由连接体的动态紊乱引起的。

图3 新EcAIII变体的熔化轮廓。根据表1中的编号，用颜色标记变体. (一)加工成亚单位的突变体α/β; (b条)不能自动处理的变种。

3.3. 突变引起的晶体结构和构象变化

有可能使所有的自动处理突变体结晶，而对结晶条件的广泛筛选并没有产生任何未成熟变体的晶体。加工成亚单位的突变体的晶体质量不同，表明突变体也影响结晶过程。虽然所有晶体的形态都非常相似，但它们对X射线的衍射程度不同。因此，晶体结构的最大分辨率在1.20–2.55℃之间。这个细化统计在表2中反映衍射数据的质量。WT EcAIII和成熟变体（空间群）的同构P（P）2₁2₁2₁)大大方便了结构的比较。一般来说，结构分析表明，位于亲核Thr179几何邻近位置210和211处的取代不会影响该残基的位置或构象，苏氨酸三联体中氢键的典型模式保持不变。

在位置206和207处的取代区域中可以看到更显著的变化。在WT蛋白中，Arg207的侧链负责将底物分子呈现给亲核核弹头，并维持活性位点中氢键连接的模式（图2). 因为它被其他侧链的残留物取代(例如。Thr、Ala、Cys、Gly、Ser或Val；表1)，这些变化解释了L（左）-相应变体的天冬酰胺酶活性，因为没有新插入的残基能够结合α-底物的羧酸基团，从而正确定向L（左）-水解反应的底物。

除了关闭L（左）-天冬酰胺酶活性，Arg207的缺失导致其他结构重排。具体而言，在大多数变体中，His119的侧链向活性位点区域的中心移动约1.5–2.2Å，从而阻断催化中心，而通常与Arg207形成锚定盐桥的Glu234旋转约180°，与Arg238形成类似的盐桥（图4d日). 这些变化还影响了整个环路200–208的位置及其前面的区域。由于所讨论的每个变体都有一个单独的替换模式，因此结构变化的细节在以下小节中分别进行了描述。

图4 RDM1系列突变体的结构变化：RDM1-3（黄色）、RDM1-12（蓝色。WT蛋白为浅灰色，仅供参考。突变位点标记在框架中。氢键显示为虚线，水分子显示为球体。为了便于查看，图中省略了一些侧链。(一)RDM1-3；Thr207与Leu204氢键结合，而His206占据Glu125和Glu81之间的自由空间。(b条)RDM1-3；Gln211参与扩展氢键网络，而Pro210对于相邻残基的构象是中性的。(c（c）)RDM1-12；位置210（D/A）和211（S/A）处的两个非极性取代不会影响相邻侧链的构象。(d日)RDM1-37；His119的转移导致Glu234侧链摆动，迫使其与Arg238形成氢键；在WT蛋白中，Glu234与Arg207和His119氢键结合。(e（电子）)RDM1-8（链条B)；Gln207与蛋白质主链原子形成了几种水介导的氢键。(（f）)RDM1-8（链条D类)；Gln207与Glu234氢键合，其取向与链中不同B. (克)RDM1-24；取代基R207A对相邻侧链的构象是中性的。(小时)RDM1-24；取代D210S和S211T不会影响催化Thr179的位置。(我)RDM1-29；Cys206远离活动站点。(j个)RDM1-29；两个非极性取代，S211V和D210L，位于Thr179附近。(k个)RDM1-38；Cys207在链条中的位置和方向B. (我)RDM1-38；S211V在催化Thr179附近的非极性取代。

3.3.4. 变型RDM1-18

变体RDM1-18的晶体对X射线的衍射非常强烈，使得数据采集分辨率达到1.20º（表2). 由于这是目前沉积在PDB中的最高分辨率EcAIII结构，因此将单独讨论此变体。高质量的电子密度图使我们能够观察到精细的细节，例如Thr179的环境和Na的八面体配位球⁺稳定回路中的离子（图5一–5c（c）). 在突变体RDM1-18中，D211W取代将一个庞大的Trp侧链引入Thr179的紧邻区域亲核剂。然而，这种突变并不影响自动处理。Trp211的侧链填充了苏氨酸三联体和由含有S211P取代基的残基207-210构建的片段之间的可用空间（图5d日). 链中B，在活性位点检测到紊乱，而在亚单位的相应区域D类Trp211的两种可选构象可见。Trp211的双重构象与230–236片段的行为相关，其中还可以看到两种可选构象（图5e（电子）).

图5 突变RDM1-18的结构以1.20Ω分辨率测定。2F类o个−F类c（c）电子密度图（等高线水平1.50σ)附近(一)催化Thr179和(b条)链中的钠结合环B; 钠离子呈紫色。(c（c）) 2F类o个−F类c（c）电子密度图（等高线水平1.50σ)链中突变位点周围B. (d日)链中Trp211的构象B; 粗大的芳香侧链的存在并不影响Thr三联体附近的氢键模式。(e（电子）)Trp211和链中相邻片段Thr232-Glu234的交替构象D类在所有面板中，突变位点都标记在框架中。水分子显示为红色球体，氢键显示为虚线。

3.4. 自动分离和保守的水分子

据报道，至少有两个水分子对自催化反应：一个（w1）参与产生氧阴离子空穴，在高压蒸煮过程中稳定过渡状态，另一个（w1）水解共价酯中间体（Su等。, 2013). 水w1也增强了催化Thr残基的亲核性，但其确切位置在不同的Ntn水解酶中可能不同（冈田等。, 2007; Yoon公司等。, 2004). 虽然w1在晶体结构EcAIII的T179A突变体（Michalska等。, 2008)到目前为止，还没有发现第二个水分子。我们通过C进行了识别保守水分子的练习^α所有RDM1结构的叠加。

分析表明，水1在所有变体中都不存在。水1应与Gly178和Gly199的羰基O原子和O原子氢键合^γ1Thr197（图6)；然而，覆盖残基158–178的片段在RDM1系列的结构中不可见。在大多数结构中，都有一个水分子w2，它与O氢键结合^γ1Thr179和Thr230的原子、水w3（与w2和Gly231的N和O原子氢化结合）和另一水w4（可能时由210和Ser211位置的残基侧链协调）（图6一和6b条). Waters w3和w4在位置211处带有笨重侧链的变体中不存在，例如Gln（RDM1-3）或Trp（RDM1-18）。在RDM1突变体中识别出的其他水分子的位置是可变的，但大多数水都很好地叠加在活性位点（PDB入口）中结合的产物分子上2扎; 图6c（c）). 这一观察结果表明，水w2、w3和w4是在空活性部位而不是在基质中进行配位的。此外，它们距离Thr179太远，无法参与自身蛋白水解。

图6 EcAIII结构中的保守水分子。(一)WT EcAIII和T179A突变体（PDB条目）的重叠3c17年)；水分子w1是在自动处理过程中形成的氧阴离子孔的一部分，而水w2、w3和w4在RDM1系列的几乎所有变体中都是保守的。(b条)本工程中确定的所有结构物的叠加显示了水域w2、w3和w4的位置。(c（c）)来自当前RDM1系列的突变体和EcAIII与L（左）-Asp（PDB条目2扎)；水分子w2和w3与L（左）-Asp，而RDM1-18中的Trp211占据了底物/产物结合所需的空间（以球体表示）。蛋白质着色方案如右图所示。在所有面板中，突变位点都标记在框架中。水分子显示为球体，氢键显示为虚线。

有趣的是，尽管存在替换210和211，但在大多数变体（RDM1-18除外）中仍有底物结合的空间；然而，由于缺少Arg207侧链L（左）-Asn公司/L（左）-活动站点中的Asp。上述分析表明，不存在涉及靠近亲核Thr179的水分子的保守氢键系统，该系统可能参与高压灭菌事件。

3.5. 未成熟前体的结构预测

早期的报告表明，Gly178和Thr179之间的肽键的高度张力构象是高压灭菌的驱动力（Li等。, 2012). 作为晶体结构目前还没有完整定义连接子的未分离WT前体蛋白，可以从预测模型中了解高压蒸煮事件。我们使用AlphaFold公司2 AI算法（跳线等。, 2021)获得WT蛋白未成熟前体的3D模型（作为参考）和RDM1系列中未切割成亚单位的变体。

EcAIII（五个最佳预测）的模型结构与晶体结构WT蛋白，C的r.m.s.d.s为～0.44Ω^α原子和所有非H原子的~1.00Ω。因此，可以放心地对待这些预测。对于连接体区域（残基156–178），观察到轻微不同的构象（图7一). 因此，包括剪刀键Gly178-Thr179在内的片段的位置也发生了变化，这表明连接物的灵活性可能是影响高压灭菌效率的重要因素，影响剪刀键在亲核攻击中的最佳呈现程度。此外，预测模型和未分离的T179A突变（PDB条目）的叠加3c17年)结果表明，水1是使剪切键稳定在适当的解理取向所必需的。预测结构中缺乏水分子可能意味着这些模型不能反映物理现实，因此在比较分析中的应用有限。

图7 WT EcAIII及其变体的结构预测AlphaFold公司2. (一)WT EcAIII及其五种最佳模型的叠加预测AlphaFold公司2（插图中的颜色图例）；虽然所有的核心结构都得到了正确的预测，但每个模型中连接体的构象是不同的。(b条)Thr179在WT EcAIII预测模型中的位置叠加在晶体结构T179A突变株（PDB条目3c17年)；预测模型中缺少水分子可能导致Thr179侧链和scisile键的构象不正确。(c（c）)在一些模型中，Thr179和Ser211之间的距离很近，足以表明存在氢键。(d日)和(e（电子）)显示变体RDM1-41和RDM1-63中Arg211和Thr179之间的预测氢键。(（f）)Glu211和Thr179之间具有氢键的突变体RDM1-61。在所有面板中，突变位点标记在框架中，氢键标记为虚线。

尽管有这些限制，我们还是使用了AlphaFold公司2对未切割成亚基的突变体进行建模(补充图S5). 在每次人工智能建模过程中，为每个未分离变量生成五个模型。模型随连接体位置的变化而变化，但保留了活性位点和键区残基的位置和构象。在图7中和补充图S5对于每种情况，只给出了一个有代表性的预测。在变体RDM1-41、RDM1-61和RDM1-63的情况下，预测的结构清楚地回答了为什么不可能进行自动处理。突变体63和41在211位具有Arg。Arg残留物与O形成两个氢键^γThr179的原子亲核剂，从而阻止其运动并防止其攻击之前的可剪断键。更重要的是，作为带正电的氢键供体，精氨酸大大降低了Thr179的亲核性。此外，在变种RDM1-41的情况下，Thr179的侧链旋转到一个新的位置，这与对可拆键Gly178-Thr179的亲核攻击不相容（图7d日). 突变体RDM1-61在211位有Glu，Glu也与O氢键结合^γThr179的原子。尽管带负电的Glu可能增强Thr179的亲核特性，从而促进自动处理，但没有观察到这种效果。

在其余变体RDM1-42、RDM1-43、RDM1-4和RDM1-64的模拟前体中，未发现突变残基与Thr179之间的特定相互作用(补充图S5)这些模型并没有解释为什么它们的自动处理被废除。特别令人感兴趣的是RDM1-43，它与突变型RDM1-37具有相同的D210S替代，但与后者相比，后者失去了自动清洗的能力(补充图S6). 在RDM1-43和RDM1-37中，211位的Ser被保留（表1). 突变体RDM1-37和RDM1-43在206和207位的取代类型不同（分别为206→S/V和207→T/G）。这两种差异可能改变了连接体的流动性（构象紊乱），并显著降低了在剪刀键处正确构象和取向的概率。

4.1. 第1课：整个EcAIII褶皱很好地适应了新的替换

本研究中提出的EcAIII蛋白的随机突变是首次尝试研究原型Ntn-水解酶对活性位点中多个同时替换的耐受性。之前已经对类似酶进行了一些单位点定向突变实验，以阐明催化和自动蛋白水解机制（Nomme等。2014年; 米查尔斯卡等。, 2008; 阿杰沃勒等。, 2018). 我们的测序分析表明，所选突变位点的残基频率并不均匀，但这是使用简并密码子进行局部随机化的典型结果（Tang等。, 2012).

在2类细菌中L（左）-天冬酰胺酶、残基（EcAIII编号）Gly206、Arg207、Asp201和Ser211高度保守。在211位置，除了最常见的Ser、Thr或Ala外，还可以找到（Zielezinski等。, 2022). 我们的研究表明，即使EcAIII的高度保守区域也可以被修饰，尽管CD光谱表明，对于未裂解为亚单位的变体（例如RDM1-42），观察到一些蛋白质折叠的扰动(补充图S3). 在完全处理的EcAIII变异体的活性位点区域引入的各种取代，极性（Thr、Gln、Ser）、非极性（Ala、Val、Cys、Leu、Pro）或芳香族（Tyr、His）残基，表明EcAIII的结构能够很好地适应多种突变。尽管发生了局部构象变化和原子位移，但所有突变体均以可溶性形式产生，大多数突变体保留了正确的二级结构和50℃以上的热稳定性。

在设计药用蛋白质时，热稳定性是一个需要考虑的重要因素。最佳吨_米用于酶的制造、运输、储存和管理（Krause&Sahin，2019; 班萨尔等。, 2012, 2021; 亚洲人等。, 2013; 莫达雷斯等。, 2016). 通常，Ntn水解酶的前体在可剪断的肽键上具有高度紧张的构象（Wang&Guo，2003)，表现为整个蛋白质的热稳定性较低。这个吨_米未切割成亚单位的RDM1变体的测定值比WT蛋白的测定值低11–15°C。这些观察结果与李报告的数据一致等。(2016)对于HSAII。未经处理的HSAII前体具有吨_米～61°C，而全自动处理将其热稳定性提高至～70°C。对于加工成亚单位的EcAIII变体，我们可以观察到吨_米取决于变体。

然而，由于RDM1系列中同时存在多个取代，因此无法详细讨论每个单个突变对整个EcAIII折叠的热稳定性的贡献，因为一些取代的稳定/不稳定作用可能是互补的。另一方面，之前已经显示了脑膜败血性黄杆菌²天冬氨酸葡糖苷酶（fAGA），EcAIII的结构同源物（图8一)活性位中的单次取代，例如D183N，可以显著降低热稳定性（Liu等。, 1998). 这些观察结果表明，EcAIII折叠足够灵活，可以接受不同类型的突变，同时保持其结构和稳定性。这是未来EcAIII工程的一个非常有前途的特性。

图8 (一)EcAIII（灰色）和结构同源物的叠加，脑脊膜炎AGA（fAGA，粉红色）和人类AGA（hAGA，绿色），与选定EcAIII残基的对应物显示为棒状：Arg207（fAGA/hAGA中的Arg180/234）、Asp210（fAGA/hAGA的Asp183/237）和Ser211（fAGA/hAGA中的Ser184/238）。黑色箭头表示导致AGA前体加工错误或减少加工的fAGA（洋红色）和hAGA（绿色）的点突变类型。青色补丁和框架标记了本研究中突变的EcAIII位点，而粉红色补丁标记了亲核Thr残基。(b条)启动Ntn-氨基水解酶成熟所必需的结构要求，并根据缺乏自动处理的原因对EcAIII的RDM1变体进行分类。标记为粉红色的突变体不会分裂成亚单位，而标记为蓝色的突变体是成熟的，但不能水解L（左）-阿斯。

4.2. 第2课：L（左）-EcAIII的天冬酰胺酶活性由Arg207的存在决定

这个L（左）-EcAIII的天冬酰胺酶活性取决于底物的正确定位，这需要与活性位点中的几个残基进行相关的相互作用（图2). 本研究中的实验表明，Arg207对EcAIII中的底物结合至关重要。其缺失，被Ala、Gly或其他具有小（Thr、Ser、Cys和Val）、大的非极性（Ile和Pro）或极性（Gln和Asp）侧链的残基取代，总是导致L（左）-天冬酰胺酶活性。因此，本研究中分析的所有变体无一例外都无法水解L（左）-天冬酰胺，产生负纳氏结果。然而，对于fAGA，已经证明其变体，其中Arg180（EcAIII中Arg207的对应物）被Lys、Gln和Ile取代，可以慢慢加工成成熟形式（图8一)酶活性降低，但未被取消（刘等。, 1998). 这些发现表明，fAGA可以在没有Arg180的情况下结合其底物。然而，这种情况下的基板与L（左）-阿斯。此外，由于所有EcAIII变异体裂解为亚单位也携带其他替代物L（左）-天冬酰胺酶活性可能是几种突变的累积效应。有趣的是，这种影响总是负面的，因为所有分析的残留物组合都无法稳定EcAIII底物，使其水解至L（左）-天冬氨酸。

新变体的活性测试总是与阳性和阴性对照一起进行（参见第2节). 在阴性对照组中，我们从未观察到黄色或变化的颜色，尽管在裂解液中存在大量的天然大肠杆菌 L（左）-天冬酰胺酶EcAI（1类）、EcAII（1类”）和EcAIII（2类）。这表明这些酶的生理浓度过低，无法干扰过度生产的重组蛋白的活性。这一观察为设计更复杂的实验提供了可能性，例如需要高通量活动筛选的定向进化。

4.3. 第3课：自动处理不需要严格定义的残差网络

由于本工作中描述的所有变体都有其L（左）-由于缺乏Arg207，天冬酰胺酶活性被消除，其结构可用于研究成熟过程的细节。一般来说，210和211位残基的化学性质不影响自催化成熟。Asp210和Ser211可以单独替换（仅变异RDM1-37，D210S突变）或同时替换（变异RDM1-3，RDM1-8，RDM1-12，RDM10-18，RDM2-24，RDM1-29和RDM1-38），而不会失去任何自催化活性。此外，替换类型（表1),即极对极（RDM1-24）、极对非极（RDM10-12、RDM1-18和RDM1-29）或极对极/非极（混合组合；RDM1-3、RDM1-8和RDM10-38）也不影响自动清洗的能力。虽然位置210和211处的侧链类型确实会影响苏氨酸三联体附近的水分子数量和氢键网络，但这种模式似乎并不影响自饱和过程，至少对于测试的取代基而言（表1).

先前的实验表明，EcAIII同源物HSAII活性位点区域的替换确实影响了自身蛋白水解活性（De Morais和De Souza，2021). Ala替代亲核Thr完全废除了高压蒸煮（Li等。, 2016)，并且对于EcAIII（Michalska等。, 2008). 三联体中剩余苏氨酸的取代降低了HsAIII的自分泌率，但甘氨酸可以恢复加工（Nomme等。2014年; 锂等。, 2016). 我们还测试了添加甘氨酸是否会启动未成熟RDM1变异体的高压蒸煮，但结果为阴性。当负责基板锚固的Arg196/207（HSAII/EcAIII）被HSAII（Li）中的Gln取代时等。, 2016)，仍然可以进行自动处理。同样，在我们的变异体RDM1-8中，R207Q突变并没有消除高压灭菌。

EcAIII其他结构同源物中Arg207对应位置的单取代分析（图8一)尤其是人类和脑脊膜炎AGAs表明，这种残留物对高压灭菌很重要。fAGA中的单个突变R180K、R180Q和R180L（图8一)显著降低了自溶率（Xu等。, 1999; 关等。, 1998). 在人类AGA（hAGA）中，突变R234Q、R234K和R234A（图8一)导致前体处理错误（Tikkanen等。, 1996). 这些数据表明，Arg207在稳定前体结构方面发挥了作用。我们的数据表明，即使没有Arg207，EcAIII的一些变体也能够成熟（表1)，这意味着Arg207缺失的负面影响可以通过其他同时存在的取代来补偿，这些取代可以稳定前体的正确几何结构。

没有数据显示Gly206在成熟过程中的作用。由于该残基位于溶剂暴露环中Arg207的旁边，并且与EcAIII中的亲核苏氨酸相对较远（图1)，可以假设它在稳定前体方面的作用很小。只有一项研究报告在EcAIII中对应Ser211的位置发生突变。观察到hAGA中的取代S238A（图8一)延迟（但没有废除）前体加工（萨雷拉等。, 2004).

人类AGA含有Asp237，对应于EcAIII中的Asp210（图8一). 已经证明，hAGA的D237A突变体的高压蒸煮速率受损，而D237S变异体被加工成WT蛋白（Saarela等。, 2004). 类似地，在fAGA中用Ala（D183A）取代Asp184（图8一)使其自残率降低了一半，而D183E和D183N突变仅略微降低了自残率（Liu等。, 1998). 最后，我们得出结论，Asp210的对应物可能在正确的蛋白质折叠中发挥作用，并参与维持高压蒸煮所需的水分子的正确位置（Saarela等。, 2004; 线路接口单元等。, 1998). 这些发现表明，极性残基优先出现在EcAIII中对应于Asp210的位置，而非极性残基如Ala会降低成熟率（图8一). 然而，这些观察结果并不直接适用于EcAIII，因为在裂解为亚单位的EcAIII变体的210位观察到不同类型的替换，其中包括非极性Ala、Pro或Leu（表1).

4.4. 第4课：自动处理的启动是一个复杂的过程

一项文献调查使我们能够确定并分类Ntn-氨基水解酶必须通过的几个“检查点”，以进行正确的亚单位加工并开发酶活性（图8b条). 有效表达式（1；数字参考图8b条)前体的正确折叠（2）和适当二聚（3）是自催化活化（Saarela等。, 2004; 莫利斯等。, 2020; 锂等。, 2012). 适当的折叠与有效的二聚化一起在剪切键处引入了扭转应变（4），这是引发自剥离反应的驱动力。另一个因素是连接子（或间隔肽；5）的定位，因为它影响了剪接区残基的构象（休伊特等。, 2000). 连接物的正确姿势对于水分子（6）靠近亲核Thr和可剪断键（Michalska）的定位也是必要的等。, 2008; 萨雷拉等。, 2004; 线路接口单元等。, 1998). 在大多数Ntn-水解酶结构中，有一个明确选择的水分子（w1；图6一)这是引发自催化裂解所必需的。去除水w1导致结构重排，导致亲核羟基旋转到催化不利位置（Yoon等。, 2004). 启动自动处理攻击还需要正确定位科学键（7；Nomme等。, 20122014年; 米查尔斯卡等。, 2008; 锂等。, 2016)以及亲核Thr（8）的侧链。研究表明，亲核Thr可以在“非活性”之间波动(反式)和“活动”(顺式)状态，但这种转换需要活性位点及其邻近区域的适当灵活性，包括形成氧阴离子孔的残基的适当排列（9；Buller等。, 2012; 施密茨伯格等。2003年). 为了发起亲核攻击，Thr的侧链亲核剂必须极化（10）。有人认为水w1是造成这种极化的原因（Yoon等。, 2004)；然而，也有报道表明，亲核苏氨酸是由空间上紧密的Thr邻域激活的，而不是由溶剂分子（Pica等。, 2016).

要进行自蛋白水解裂解，Ntn-水解酶前体必须满足所有要求（通过图8中编号为1-10的“检查点”b条). 该列表中收集的观察结果表明，即使是负责维持自身蛋白水解中心脆弱结构的任何元件的微小变形，也可以消除或显著损害高压蒸煮过程。如图8所示(b条)，在自动处理的RDM1变体中引入的突变（表1)对敏感仪器无害，甚至变型RDM1-18中Trp211的大侧链也无害（图5)位于亲核Thr179附近，不会干扰自动处理。然而，这些变体没有酶活性（图8b条)尽管在所有成熟变体中（RMD1-18除外；图6c（c）)底物结合仍有空间。Arg207的缺失以及突变位置210和211很可能是活性位点底物稳定性差的原因。

预成熟要求分析（图8b条)提供了一个可能的解释，解释了为什么一些RDM1突变体没有被加工成亚单位。如SEC所示(补充图S4)和CD光谱(补充图S3)突变体RDM1-42以可溶性形式产生，但存在结构畸变（由于折叠受损），并有聚集倾向（二聚化受损）。对其前体结构的建模表明，这种畸变可能是G206P突变的结果，该突变影响了整个200-208环的构象(补充图S5). 前体RDM1-41、RDM1-61和RDM1-63的预测结构（图7)表明这些变体的自动处理因Thr179的错误定位和极化而被废除（图8一). 虽然建模表明RDM1-43、RDM1-46和RDM1-64突变体的活性位点没有任何重要变化(补充图S5)，可以假设它们是正确折叠的，并且第四纪构造(补充图S3和S4)；因此，中止自动处理的原因可能与连接子和松驰键的位置不正确或水分子或氧阴离子孔的排列不正确有关。由于目前尚不清楚内在无序连接子的确切作用（Loch&Jaskolski，2021）)，应在未来的实验中详细研究其对自动处理的影响。迄今为止，没有晶体数据可以对连接体的构象进行全面分析：即使在未分离的EcAIII突变体T179A（PDB条目）的结构中也是如此3扎)或未结清HSAII（PDB条目4个)在电子密度图中无法追踪到大部分连接体（米查尔斯卡等。, 2008; 苏等。, 2013).

所有这些发现都表明，自催化成熟的启动是一个非常复杂的过程。我们的结果表明，即使似乎与高压灭菌无关的突变也能显著改变酶在这一过程中的性能。这些观察结果对EcAIII的未来工程非常重要，因为结合囊内的突变可能会改善L（左）-天冬酰胺酶的活性也可以永久性地消除该酶的自催化活性。以上讨论的结果与之前报道的观察结果一致，即自溶蛋白和L（左）-天冬酰胺酶活性是独立的分子事件（Li等。, 2016). 而L（左）-只有在高压蒸煮过程中才能产生天冬酰胺酶活性（图8b条)，自动处理独立于L（左）-天冬酰胺酶活性，并且也可以有效地发生在具有用于底物结合和/或催化的功能失调的装置的变体中。

4.5. 第5课：EcAIII可以采用类似于钾依赖酶的构象状态

在大多数分析结构中，Arg207被较小的残基取代，这伴随着Glu234的构象变化和His119的位移（图4). 这些运动类似于钾依赖性2类中观察到的钾诱导的变化L（左）-天冬酰胺酶来自菜豆，PvAIII（K）（贝杰等。2014年). 在PvAIII（K）的结构中，除了稳定环（或钠结合环）外，亚基中还有另一个碱金属结合环（活化环）α（Val111–Ser118）。激活回路起着由碱金属交换触发的“催化开关”的作用。K的协调⁺阳离子将酶切换到（催化活性）ON状态。然而，当较小的Na⁺阳离子被配位，酶被重置为（催化失活）OFF状态（Bejger等。2014年).

ON（PDB项中PvAIII（K）结构的叠加4磅6)和OFF（PDB入口4伏3)具有RDM1变体结构的状态显示，EcAIII突变体中的构象重排类似于钾依赖性酶中残基的移动，导致开启和关闭状态之间的切换。在WT EcAIII中，Glu234与Arg207进行氢键连接，将其与His119锁定在基板协调所需的位置（如ON状态；图9). 在RDM1-8变异体的一个亚单位中观察到Glu234的相同取向（图4（f）)而在所有其他变体中发现Glu234的替代取向（图4). 该方向与PvAIII（K）对应物Glu250的OFF方向相同。在关闭状态下，Glu250离开活动站点，而His117像EcAIII对应的His119一样，进入阻止活动站点。

图9 处于ON/OFF状态的酶的结构。(一)WT EcAIII在ON状态下的叠加，准备协调底物分子（灰色，PDB入口2扎)和突变RDM1-38（绿色）处于OFF状态，由Glu234的旋转表示。(b条)第二亚单位β具有Glu234的RDM1-38结构在典型的开/关状态的两个交替方向上；处于ON状态的Glu234被与His119和Cys207的氢键锁定。(c（c）)突变RDM1-38（绿色）在OFF状态下的叠加和PvAIII（K）在ON（橙色，PDB入口）中的结构4磅6)和OFF（紫色，PDB进入4伏3)状态。在所有面板中，突变位点标记在框架中，氢键标记为虚线。

这些观察结果表明，EcAIII也可以被设置为OFF状态；然而，这种状态是通过Arg207的基因截肢来实现的，这对亚状态结合至关重要。虽然EcAIII中也存在活化环的对应物（残基113-120），但它不能与金属离子（Ajewole等。, 2018). 由于Arg238似乎对稳定催化非活性RDM1变体中的OFF状态至关重要，因此出现了EcAIII是否也可以在ON和OFF状态之间切换的问题。触发因素可能不是碱金属配位，而是另一个改变Glu234和His119电离状态的因素，例如pH值。由于EcAIII在pH值约为8时具有活性，这可能是影响其pH依赖性活性的机制。然而，这种推测需要进一步的实验验证。

4.6. 第6课：EcAIII亚单位的作用不相等

对RDM1结构的详细分析表明，二聚体的两个部分的结构变化是不相等的。突变体之间的差异不同，但在以下三个区域最为明显：α-螺旋残基147–159位于柔性连接体前面，环200–208携带底物结合所需的残基，环116–120与His119结合。差异显而易见，例如，在变型RDM1-8的结构中(补充图S7)其中涉及Gln207的氢键模式在两个亚单位中不同（图4e（电子）和4（f）). 在这种情况下，导致结构差异的一对残基是His119和Glu234。如图2所示和9His119与Glu234共同负责Arg207的稳定，由二聚体的另一个亚单位提供。如果Glu234在一个亚单位中采用OFF构象，这与His119和第二个亚单位的整个116-120片段的运动有关。

在其他变体中，例如RDM1-12，在以下区域中可以看到差异α-螺旋线147–159、环200–208和环116–120，而在RDM1-38中，仅在以下区域观察到差异α-螺旋线147–159(补充图S7). 虽然晶体堆积也可能产生稍有不同的亚单位构象（在同晶RDM1系列中不太可能出现），但这些差异似乎并非偶然：在PDB中沉积的EcAIII的所有晶体结构中，在非对称单元。这可能表明亚基在本质上是非等效的，因此回避了晶体对称性。