Single-support serial isomorphous replacement phasing

Foos, N.; Rizk, M.; Nanao, M.H.

doi:10.1107/S2059798322003977

研究论文

结构
生物学

国际标准编号：2059-7983

第78卷| 第6部分| 2022年6月| 第716-724页

https://doi.org/10.107/S2059798322003977

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单支撑系列同晶置换阶段划分

尼古拉斯·福斯,^一马哈茂德·里兹克 ^一和马克斯·纳奥 ^一 ^*

^一结构生物学，欧洲同步辐射设施，法国格勒诺布尔烈士大道71号，38000
^*通信电子邮件：最大值：anao@esrf.fr

美国斯坦福大学S.Wakatsuki编辑(收到日期：2021年8月24日； 2022年4月11日接受； 2022年5月9日在线)

单体的使用同晶置换由于样品制备和同构原生和衍生数据集识别方面的困难，（SIR）已变得不太普遍。在系列实验中，非同构现象变得更加困难，因为它将自然晶间非同构添加到了重原子引发的非同构中。在这里，提出了一种能够成功解决这些问题的方法（实际上可以从重原子占用率的差异中受益），并大大简化了SIR实验。将单个重原子浸泡到微晶浆料中，然后自动收集部分数据集的串行数据。这产生了一组具有重原子占用率梯度的数据集合，反映在差异合并统计中。这些差异可以通过优化遗传算法将数据集池分离为“本地”组和“派生”组，然后可用于SIR实验成功确定相位。

关键词：单一同构替换;系列晶体学;遗传算法;微晶照相术;机器学习.

类似文章

1.简介

原子分辨率结构信息对我们理解基本生物过程至关重要，在药物和化学生物探针的开发和改进中发挥着越来越重要的作用。高分子晶体学（MX）是获取此类信息的最有效方法之一。然而，MX可能受到相位问题（泰勒，2003年 )以及为了数据收集而生长大单晶的必要性。传统上，晶体学数据的定相需要重原子浸泡或衍生，且晶体尺寸大于100µm。使用较小的1–20µm样品具有许多优点，包括减少晶体优化所需的时间和材料，特别是对于具有挑战性的项目，如膜蛋白项目。它还可以更均匀地浸泡重原子或配体，并在光泵-探针实验中提供更完整的照明。微焦点同步辐射束线的增殖（南澳等。, 2022 ; 长谷川等。, 2013 ; 埃文斯等。, 2007 )先进的数据收集/分析方法有助于从这些较小的晶体进行测量；然而，辐射损伤使得从单个微晶收集完整、高质量的数据集极为困难（Holton&Frankel，2010 ). 这个问题的答案似乎是串行/多晶体方法，如同步加速器串行晶体学（SSX），其中来自多个晶体的数据被合并成一个单一的数据集（Gati等。, 2014 ; 斯特拉托等。, 2014 ; 博塔等。, 2015 ; 赞德等。, 2015 ; 长谷川等。, 2017 ). 事实上，近年来，将串行方法与强微束相结合，使晶体尺寸的界限得以突破。然而，多晶体方法确实付出了巨大的代价：晶体之间的自然变化（“非同构”）会降低最终合并数据集的质量（佐丹奴等。, 2012 )这对于分阶段应用程序来说是一个特殊的挑战。

实验大分子晶体学定相的最早方法之一是单一的同晶置换（SIR）方法（克里克和马多夫，1956 ; 绿色等。, 1954 )，其中数据收集自重原子浸泡的晶体和未浸泡的“天然”晶体。强度之间的差异用于确定重原子的位置，然后可用于实验确定天然蛋白质数据的相位。SIR提供了潜在的非常大的强度差异的优点，这反过来又可以提供非常大的定相功率。然而，由于天然和重原子诱导的非同构现象，其在多晶体方法中的应用非常复杂。事实上，由于非同构引起的强度差异通常大于重原子结合引起的信号。因此，迄今为止，SIR在多晶体实验中相对少见，而现有工作主要针对自由电子激光器（Botha等。, 2015; 山下等。, 2015 ; Nakane公司等。, 2016 ; 张等。, 2015 ). 除了非同构问题外，SIR的实际局限性是，成功的SIR实验通常需要从许多样品中制备和收集衍射数据，以便识别重原子占有率和同构性足够高的晶体组，同时保持足够的衍射质量。此过程通常会消耗大量人力和波束时间。

配体浓度的时空梯度已经过模拟和实验证明（科尔等。, 2014 ; 杰雷米亚等。, 2006 ; 潘迪等。, 2021 ; 水谷等。, 2014 ; 施密特，2013 ). 我们推断，如果可以建立不同重原子占用率的人口，我们可以使用遗传算法基于（GA）的分组技术（Zander等。, 2016 ; Foos公司等。, 2019 ; Cianci公司等。, 2019 )区分衍生数据集和本地数据集。事实上，这里我们报告了一种方法，在SSX数据采集之后进行单重原子浸泡。A类遗传算法然后用于分组数据集，这些数据集可用于通过SIR实验成功确定相位。

2.方法

2.1. 样品制备

分析了四种不同重原子衍生的蛋白质微晶。批量生长大小在5至20µm之间的溶菌酶晶体：40 mg ml⁻¹溶菌酶溶液是在含有1.5M（M）氯化钠，0.1M（M）乙酸钠pH 4.6，30%聚乙二醇5000。采用吊滴蒸汽扩散法获得蛋白酶K、胰岛素和嗜热菌蛋白酶晶体。以50 mg ml制备蛋白酶K晶体⁻¹50米M（M）HEPES pH 7.0，含0.5–1.5的良好溶液M（M）硝酸钠，100米M（M）柠檬酸盐pH 6.5。将胰岛素溶解至15 mg ml⁻¹50米M（M）纳₂高性能操作₄pH值10.4，1mM（M）EDTA pH 8.0，在350–450 m内结晶M（M）纳₂高性能操作₄pH值10.4，10 mM（M）EDTA公司。以50 mg ml制备嗜热菌蛋白酶⁻¹在50米内M（M）MES pH 6.0，含45%二甲基亚砜，井液含35%(周/v（v）)溶于水中的硫酸铵；将蛋白质溶液与微孔溶液以1:1的比例（马歇尔等。, 2012 ). 所有晶体均在20°C下获得。在硅化盖玻片之间压碎大的（100–500Å）晶体，以获得5至20µm的微晶尺寸范围。Gd-HPDO3A储备溶液（钆替啶；Girard等。, 2002 )、醋酸汞（II）、硝酸钐（III）和碘化钠在25 m的水中生成M（M），20米M（M），5米M（M）和1M（M）分别是。将这些储备添加到甘油（最终浓度为25%）和井液中，以获得最终重原子浓度为2 m的浸泡缓冲液M（M），5米M（M）, 667 µM（M）和400米M（M）分别是。使用具有10µm开口的700µm直径微孔将微晶浆料转移到2µl这些浸泡溶液中（MiTeGen）。由于非结晶蛋白质对重原子结合的竞争，晶体转移可能比直接向结晶液滴中添加重原子更好。根据以往对较大晶体进行非系列SIR实验的经验，重原子浸泡时间分别为5分钟、4分钟、1分钟和30秒。实际上，可以通过为多个筛孔设置足够数量的浆液，然后在几个时间点去除浆液，再在微孔上收集浆液并在液氮中闪蒸冷却来确定浸泡时间。

2.2. 数据收集和合并

在固定能量ESRF束线ID23-EH2（Nanao）上收集数据等。, 2022)14.2 keV，配备PILATUS3 2M探测器和MD3Up衍射仪（Maatel）。数据采集在100 K下进行Mx CuBE公司（奥斯卡森等。, 2019 )使用网格和集合工作流程（赞德等。, 2015)（表1). 衍射图像和元数据(XDS公司输入文件）已上传至Zenodo，ID为5111402(https://doi.org/10.5281/zenodo.5111402). 数据最初使用自动处理XDS公司和手榴弹（摩纳哥等。, 2013 ). 整体〈最高的部分数据集我/σ(我)〉被用作重新整合的参考数据集XDS公司（卡布施，2010年b条 )为了解释索引的模糊性。值得注意的是，即使在这些表现良好的测试用例中，整个数据集池中的单元间参数的范围通常约为1–2%，这表明存在大量不可否认的非同构。事实上，在他们对非同构的开创性分析中，克里克和马多夫（1956)据估计，只有0.5%的单位-细胞变化会导致3度时无中心反射强度的15%变化。合并R（右）当合并所有数据时，值通常相当高（表2).

表1
数据收集参数

	溶菌酶Gd	胰岛素I	嗜热菌Sm	蛋白酶K Hg
光束尺寸（水平×垂直半高宽）（µm）	7 × 5	7 × 5	7 × 5	7 × 5
光子通量（光子⁻¹)	8.3 × 10¹⁰	5 × 10¹¹	5 × 10¹¹	7 × 10¹⁰
每张图像的曝光量	0.1	0.03	0.01	0.03
每个数据集的图像数	100	100	100	100
每张图像的振动范围（°）	0.1	0.1	0.1	0.1
部分数据集的数量	67	149	53	91
环形模式，电流	16束，74 mA	4束，35 mA	16束，84毫安	7/8多束，195 mA

表2
所有数据、本地和派生数据集以及部分数据集的统计信息

括号中的值用于外壳。请注意，一些部分数据集未分配给本地组或派生组。

	溶菌酶Gd			胰岛素I
	全部	本地	导数	全部	本地	导数
波长（Ω）	0.873	0.873	0.873	0.873	0.873	0.873
分辨率范围（Ω）	39.02–1.50 (1.55–1.50)	39.02–1.50 (1.55–1.50)	39.02–1.50 (1.55–1.50)	55.47–1.60 (1.66–1.60)	55.47–1.60 (1.66–1.60)	55.47–1.60 (1.66–1.60)
“空间”组	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	我2₁三	我2₁三	我2₁三
单位-细胞平均值和[范围]
一(Å)	77.97 [76.95–78.50]	78.04 [77.53–78.23]	78.04 [77.63–78.33]	78.53 [78.06–78.74]	78.46 [78.06–78.61]	78.56 [78.36–78.74]
b条(Å)	77.97 [76.95–78.50]	78.04 [77.53–78.23]	78.04 [77.63–78.33]	78.53 [78.06–78.74]	78.46 [78.06–78.61]	78.56 [78.36–78.74]
c（c）(Å)	38.46 [37.80–38.95]	38.57 [38.02–38.95]	38.57 [37.80–38.76]	78.53 [78.06–78.74]	78.46 [78.06–78.61]	78.56 [78.36–78.74]
α(°)	90	90	90	90	90	90
β(°)	90	90	90	90	90	90
γ(°)	90	90	90	90	90	90
反射总次数	912946 (86831)	328389 (31081)	467234 (44672)	1690273 (169635)	328587 (33071)	476936 (47848)
独特反射次数	19625 (1917)	19623 (1917)	19625 (1917)	10773 (1077)	10773 (1077)	10773 (1077)
多重性	46.52 (45.30)	16.73 (16.21)	23.81 (23.30)	156.90 (157.51)	30.50 (30.71)	44.27 (44.43)
完整性（%）	100.00 (100.00)	99.99 (100.00)	100.00 (100.00)	100.00 (100.00)	100.00 (100.00)	100.00 (100.00)
〈我/σ(我)〉	10.9 (1.3)	6.7 (0.6)	10.1 (1.1)	54.8 (12.0)	24.1 (4.5)	29.1 (6.4)
威尔逊B类系数（Ω²)	12.45	12.45	12.45	13.17	13.17	13.17
R（右）_合并	0.370 (7.501)	0.344 (7.020)	0.261 (4.021)	0.110 (0.956)	0.094 (0.912)	0.119 (0.989)
R（右）_测量	0.374 (7.585)	0.355 (7.248)	0.267 (4.111)	0.110 (0.959)	0.096 (0.928)	0.120 (1.000)
R（右）_下午。	0.054 (1.114)	0.086 (1.778)	0.054 (0.841)	0.009 (0.076)	0.018 (0.166)	0.018 (0.149)
科科斯群岛_1/2	0.998 (0.520)	0.996 (0.227)	0.999 (0.459)	1.000 (0.991)	0.995 (0.944)	0.999 (0.970)
部分数据集统计
部分数据集的数量	67	24	34	149	29	42
平均完成率（%）	44.21 (42.96)	44.3 (42.53)	44.38 (43.62)	67.07 (66.93)	67.86 (67.90)	67.20 (66.27)
平均值〈我/σ(我)〉	2.72 (0.19)	2.68 (0.15)	3.19 (0.28)	7.05 (1.12)	7.19 (1.00)	6.70 (1.10)
平均值R（右）_测量	0.52 (1.75)	0.33 (3.91)	0.35 (7.88)	0.09 (0.80)	0.08 (0.96)	0.11 (0.49)
平均CC_1/2	0.92 (0.05)	0.97 (0.05)	0.95 (0.09)	0.99 (0.50)	1.00 (0.47)	0.98 (0.49)

	嗜热菌Sm			蛋白酶K Hg
	全部	本地	导数	全部	本地	导数
波长（Ω）	0.873	0.873	0.873	0.873	0.873	0.873
分辨率范围（Ω）	80.74–1.60 (1.66–1.60)	80.74–1.60 (1.66–1.60)	80.74–1.60 (1.66–1.60)	57.43–1.40 (1.45–1.40)	57.43–1.40 (1.45–1.40)	57.43–1.40 (1.45–1.40)
“空间”组	P（P）6₁22	P（P）6₁22	P（P）6₁22	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2
单元格平均值和[范围]
一(Å)	93.10 [92.24–93.48]	92.96 [92.94–93.02]	93.10 [92.93–93.20]	67.95 [67.58–68.22]	67.93 [67.76–68.03]	67.93 [67.79–68.06]
b条(Å)	93.10 [92.24–93.48]	92.96 [92.94–93.02]	93.10 [92.93–93.20]	67.95 [67.58–68.22]	67.93 [67.76–68.03]	67.93 [67.79–68.06]
c（c）(Å)	129.33 [127.60–130.88]	129.04 [129.03–129.06]	129.05 [128.84–129.29]	107.60 [106.17–108.51]	107.57 [106.89–108.12]	107.66 [107.09–107.97]
α(°)	90	90	90	90	90	90
β(°)	90	90	90	90	90	90
γ(°)	120	120	120	90	90	90
反射总次数	2337994 (232519)	134562 (13566)	223412 (22425)	3190131 (301988)	772620 (72946)	561441 (53061)
独特反射次数	44378 (4362)	31848 (3133)	43712 (4315)	50269 (4940)	50238 (4939)	50243 (4938)
多重性	52.68 (53.31)	4.23 (4.33)	5.11 (5.20)	63.46 (61.13)	15.38 (14.77)	11.17 (10.75)
完整性（%）	100.00 (100.00)	71.76 (71.82)	98.49 (98.92)	100.00 (100.00)	99.94 (99.98)	99.95 (99.96)
〈我/σ(我)〉	10.6 (2.4)	7.2 (1.5)	6.3 (1.5)	9.9 (2.3)	6.4 (1.3)	5.0 (1.0)
威尔逊B类系数（Ω²)	13.87	13.87	13.87	13.20	13.20	13.20
R（右）_合并	0.436 (3.548)	0.106 (0.775)	0.141 (0.910)	0.553 (3.049)	0.362 (2.055)	0.393 (2.305)
R（右）_测量	0.441 (3.582)	0.121 (0.883)	0.157 (1.009)	0.558 (3.074)	0.375 (2.128)	0.412 (2.422)
R（右）_下午。	0.061 (0.486)	0.056 (0.411)	0.066 (0.423)	0.070 (0.391)	0.094 (0.544)	0.123 (0.732)
科科斯群岛_1/2	0.997 (0.790)	0.996 (0.583)	0.993 (0.618)	0.995 (0.806)	0.993 (0.570)	0.987 (0.402)
部分数据集统计
部分数据集的数量	53	三	5	91	22	16
平均完成率（%）	57.82 (58.78)	68.82 (69.10)	56.52 (57.76)	48.05 (47.03)	47.49 (47.05)	50.84 (48.80)
平均值〈我/σ(我)〉	2.58 (0.38)	4.53 (0.93)	4.34 (0.96)	1.86 (0.31)	2.30 (0.40)	2.16 (0.36)
平均值R（右）_测量	0.33 (4.22)	0.13 (0.84)	0.15 (1.01)	0.51 (4.68)	0.42 (1.03)	0.45 (0.33)
平均CC_1/2	0.96 (0.16)	0.99 (0.51)	0.99 (0.46)	0.90 (0.14)	0.94 (0.18)	0.93 (0.16)

然后将部分数据集提交给CODGAS公司（赞德等。, 2016)遗传算法将其分为四组，然后进行缩放和合并XSCALE公司（卡布施，2010年一 )（图1). 由于重原子诱导的非同构现象的预期增加以及天然和衍生数据的潜在存在，基团数量的选择被设定为比通常更大的数量。原生和衍生数据集中的部分数据集数量如表2所示虽然建立一个普遍有用的指南将有助于在网格和集合工作流程中，此参数可能会随着重原子占有率、衍射分辨率和对称性的函数而变化。的确，表2显示了包含最终本地和派生数据集的数据集数量的巨大范围。很可能我们收集的数据集总数远远超出了必要的数量。当从溶菌酶数据池中删除部分数据集时，我们发现在67个部分数据集中，只有20个部分数据集可用于确定相位。149个数据集中的75个数据集和53个数据集的40个数据集中，胰岛素和嗜热菌素阶段化成功。然而，蛋白酶K数据集的数量只能从收集的91个数据集中减少到85个。然而，应该注意的是，工作流的速度使得收集100个部分数据集的速度非常快，因此在收集更大的池时没有什么缺点。改进遗传算法原则上可以进一步减少对数据集总数的要求。

图1
阶段划分的程序工作流。数据集从单个支架上的多个晶体中收集，并在XDS公司。然后将这些部分数据集提交给CODGAS公司对于分组，每个组在两个“方向”上成对提交给谢尔克斯/D类/E类用于阶段化。

默认参数用于尾气目标函数。执行CODGAS公司已提交给ESRF SLURM集群。运行时间随数据集参数、集群负载和分配的特定机器的不同而不同，但作为一个示例，在十个2.4 GHz Intel Xeon E5-2680内核上，共有67个部分数据集的溶菌酶数据集的执行时间为133分钟。与整个池的范围相比，原生和衍生数据集的单位-细胞参数范围显著缩小，表明成功识别了同构群（表2).

2.3. 结构解决方案

生成的数据集来自尾气然后成对提交给谢尔克斯/D类/E类（Sheldrick，2010年 )对于下部结构和SIR相位测定（不包括异常散射），（图1). 因为在这项工作中只考虑了同构差异，所以无法确定先验的无论一组是原生的还是衍生的。因此，每对安全气囊系统都在两个“方向”上执行（图1). 通过目视检查电子密度图来确定相位成功库特（埃姆斯利等。, 2010 )和相关系数中自动生成的部分模型（“部分CC”）的SHELXE公司一般来说，大于25%的部分CC被视为成功结构解决方案的证据，但对于嗜热菌蛋白酶，一些值较低（低至18%）的溶液仍然可以生成易于解释的电子密度图。相位后分析F类_o（o）−F类_c（c）计算每个蛋白酶K数据集的差异图CODGAS公司 子组使用不含重原子的蛋白酶K模型中的相。有趣的是，这些地图显示，“本地”数据集（第3组）也部分衍生化了(补充图S1)，但该组和第2组之间的重原子占有率明显存在足够大的差异，可以通过实验确定相位。天然产物和衍生物的峰高分别比平均值高80和48个标准偏差。分析F类_o（o）−F类_c（c）其他系统中的地图也显示了“原生”数据集中的重原子。嗜热溶血素、胰岛素和溶菌酶的天然峰高与衍生峰高分别为43对51、31对37和29对36个标准偏差，高于平均值。成功的本地和派生数据集的合并统计如表2所示.

3.结果

3.1.从头开始阶段划分

通过这种方法，嗜热菌蛋白酶、溶菌酶和蛋白酶K都是可溶解的，产生的最大部分CCs分别为32%、25%和37%，并且具有易于解释的图谱（图2). 对GA轨迹中间代的检查表明，随着算法的进展，成功阶段化结果逐渐丰富（图2). 相反，碘浸泡的立方胰岛素不容易以相同的方式溶解（图3一，上部面板）。因为组的分离依赖于合并统计数据和算法参数，所以我们提交了多个CODGAS公司运行时两者都不同。然而，改变遗传算法目标函数项的相对权重和遗传算法的代数或种群大小并没有产生任何改善。虽然对尾气即使是用分数阶乘方法探索参数空间，也会耗费大量的时间和计算。这一点，再加上没有观察到哪怕是微小的改进，促使我们采取不同的做法。我们推断，修改目标函数以包含一些同构度量可能有助于群识别。因此，我们在GA目标函数中引入了一个附加项。在经典的SIR实验中，通常要检查合并R（右）本地和派生数据集的值，并将其与R（右）两个数据集之间的值（并确认R（右）数据集之间的值不是过高）。此分析使用户可以了解实验中出现的信号和噪声量。我们在一个新术语中编码了这个启发式分析的简单版本，基于数据内：数据间的比率R（右）值，

$[{\rm ISO}=w_{\rm-ISO}（R_{\rma int}/R_{\orm inner\_individual\_average}），\eqno（1）]$

哪里R（右）_整数= $[\textstyle\sum F_{\rm o}^{2}-\langle F_{\rm o}^{2}\rangle|/]$ $[\textstyle\sum F_{\rm o}^{2}]$ 根据计算谢尔克斯,R（右）_{个人_平均}是平均内壳R（右）_测量，根据计算XDS公司、和周_{国际标准化组织}是与此术语关联的权重。将该术语添加到前面描述的健身术语中，以生成R（右）+我+抄送+C类+M（M）+ISO，其中R（右）= (100 −R（右）_测量整体）周_R（右）,我= 〈我/σ(我)〉_总体的周_我/σ(我)，立方厘米= $[{\rm CC}_{\rm1/2\，整体}w_{\rma CC{1/2}}]$ ,C类=完整性_总体的周_完整性,M（M）=多重性_总体的周_多重性ISO如上所述。然后，我们使用周_{国际标准化组织}=1、10、100、1000和10 000。因为遗传算法依赖于种群的伪随机初始化，以消除不同启动条件造成的任何影响CODGAS公司已修改，以便使用显式设置的随机数种子运行。这个种子随后被底层GA代码库使用(DEAP公司;https://deap.readthedocs.io/en/master/). 以这种方式运行，改变周_{国际标准化组织}术语显著增加了成功的结构解决方案的数量（图3). 的值周_{国际标准化组织}大于10的结果相同，表明该项与其他GA项之间的权重并不特别重要。

图2
自然和同晶数据集的分离可用于溶菌酶Gd（上面板）、蛋白酶K Hg（中面板）和嗜热菌素Sm（下面板）的SIR阶段化。算法进度显示在x个轴，部分CC显示在年轴。代表性电子密度来自SHELXE公司右侧显示为1.5σ。该图形是使用生成的ggplot图2 (网址：https://ggplot2.tidyverse.org/),R（右）(https://www.r-project.org/)和PyMOL公司（薛定谔）。

图3
(一)通过在遗传算法胰岛素I的适应度函数。部分模型的CC频率如下所示周_{国际标准化组织}0、1、10、100、1000和10 000。每条链<11个残基的平均链长用红色表示，≥11的平均链长度用青色表示。(b条)实验电子密度SHELXE公司1.5等高线σ.

4.总结与展望

在这里，我们将最新的分析方法应用于单个同晶置换，从而产生了一种具有独特优势的方法。该方法可以使用单个重原子浸泡和样品架的数据来执行，大大简化了SIR实验。样品制备后，使用现有的自动化工作流进行数据收集，例如网格和集合（赞德等。, 2015). 这样的数据收集策略需要某种方法来分离原生数据集和派生数据集。为此，我们使用了CODGAS公司GA，事实上已经证明，这种方法可以用于识别两组内部同构数据集，并且这些数据集之间的强度差异可以成功用于从头开始SIR相位测定。值得注意的是，我们使用了性能良好的测试系统，这种方法的局限性还有待观察，尤其是在最小分辨率和较低对称性方面。

已经设想了几项改进。当前目标函数仅适用于合并统计信息，但也可以使用下游阶段化步骤中的度量。例如，首次尝试使用SHELXD公司 下部结构已经研究了解决方案。然而下部结构适用于目标函数的正确性尚未确定。例如，通常使用的CC（all）和CC（weak）指标似乎无法在虚假解决方案和真实解决方案之间提供足够的区分。此外，与此方法相关的计算成本很高。在这项工作中，我们只关注同构相位，但通过组合序列反常散射（梅尔尼科夫等。, 2017 )使用SIR（SIRAS）也可以提高成功率，这一点目前正在研究中。如果存在异常信号，也可以用于确定哪些数据集是原始数据集，哪些是派生数据集。然而，强异常信号并不总是可用的，这取决于元素和波束线的特性。

在这项工作中，我们通过使用相对低的剂量，在很大程度上忽略了辐射损伤效应。在某些情况下，特定辐射损伤可用于相位调整（Banumathi等。, 2004 ; 南澳等。, 2005 ; 希尔茨等。, 2004 ; 拉韦利等。, 2003 ; Nanao&Ravelli，2006年 ; de Sanctis&Nanao，2012年 ). 这项技术可以大致视为“反向”SIR实验。我们之前已经证明，辐射损伤诱导的相位调整在系列实验中是可能的（Foos等。, 2018 ). 这项工作采用了网格和集合重复从同一晶体收集数据以获得高剂量和低剂量数据集的工作流程。然而，晶体之间的差异辐射损伤也可能与此处使用的重原子占用率梯度类似。这将取消对同一晶体进行多次收集的要求。

适用性聚类分析（CA）基于强度和/或单位-细胞参数的相关性（佐丹奴等。, 2012; 圣托尼等。, 2017 ; 福迪等。, 2013 ; 线路接口单元等。, 2011 )或使用更复杂的方法XSCALE_ISOCLUSTER（XSCALE_隔离群集）和XDSCC公司12（阿斯曼等。, 2020 )尚未针对SIR进行研究。然而，遗传算法和CA方法可能是互补的，也可能是结合的。例如，使用CA对数据进行预分组，然后在GA中进行微调，可以改进“本地”和“派生”数据集的分离和质量。由于“本地”数据集包含一些重原子，因此在这方面显然还有改进的余地。

最后，虽然所有系统都很容易解决，但与结合动力学和晶体尺寸相关的重原子占有率分布可能是该技术成功的关键因素。在本研究中，我们采用了相对温和（培养时间短，浓度低）的重原子浸泡方案。然而，也许可以通过改变晶体尺寸、光束尺寸、重原子浓度和浸泡时间来改善重原子占用率的分布。尽管如此，我们已经证明了一种极易使用的实验阶段化协议，以及相关的计算分析工具，以振兴MX实验中SIR的常规使用。

5.相关文献

以下参考文献引用于支持信息本文作者：Adams等。(2010 ).

支持信息

链接https://doi.org/10.5281/zenodo.5111402
衍射图像和元数据。

补充图S1。内政部：https://doi.org/10.107/S2059798322003977/wa5134sup1.pdf

致谢

作者希望感谢ESRF MX波束时间分配小组为ESRF的这一项目和其他正在进行的SSX项目分配波束时间（“SSX BAG”）。作者还要感谢乌尔里希·赞德博士和蒙特塞拉特·索勒·洛佩斯提供的晶体样品。Python代码位于https://sites.google.com/site/codgas1网站/.

工具书类

Adams，P.D.、Afonine，P.V.、Bunkóczi，G.、Chen，V.B.、Davis，I.W.、Echols，N.、Headd，J.J.、Hung，L.-W.、Kapral，G.J.、Grosse-Kunstleve，R.W.、McCoy，A.J.、Moriarty，N.W.、Oeffner，R.、Read，R.J.、Richardson，D.C.、Richards，J.S.、Terwilliger，T.C.和Zwart，P.H.（2010）。《水晶学报》。D类66, 213–221. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Assmann，G.M.、Wang，M.和Diederichs，K.（2020年）。《水晶学报》。D类76, 636–652. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Banumathi，S.、Zwart，P.H.、Ramagopal，美国、Dauter，M.和Dauter，Z.（2004）。《水晶学报》。D类60, 1085–1093. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Botha，S.，Nass，K.，Barends，T.R.M.，Kabsch，W.，Latz，B.，Dworkowski，F.，Foucar，L.，Panepucci，E.，Wang，M.，Shoeman，R.L.，Schlichting，I.&Doak，R.B.（2015）。《水晶学报》。D类71, 387–397. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Cianci，M.、Nanao，M.和Schneider，T.R.（2019年）。《水晶学报》。D类75, 192–199. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 科尔，K.，罗斯勒，C.G.，穆勒，E.A.，本森-苏，E.J.，马伦，J.D.，勒，B.A.，蒂曼，A.M.，比隆，C.，布朗，M.，埃尔南德斯，J.，内夫，S.，威廉姆斯，D.，阿莱尔，M.、奥维尔，A.M..，斯威特，R.M.和索尔斯，A.S.（2014）。公共科学图书馆一号,9，编号：e101036科学网交叉参考公共医学谷歌学者
 Crick，F.H.C.和Magdoff，B.S.（1956年）。《水晶学报》。 9, 901–908. 交叉参考中国科学院 IUCr日志科学网谷歌学者
 Emsley，P.、Lohkamp，B.、Scott，W.G.和Cowtan，K.（2010年）。《水晶学报》。D类66, 486–501. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Evans，G.、Alianelli，L.、Burt，M.、Wagner，A.和Sawhney，K.J.S.（2007年）。AIP确认程序。 879, 836–839. 交叉参考中国科学院谷歌学者
 Foadi，J.、Aller，P.、Alguel，Y.、Cameron，A.、Axford，D.、Owen，R.L.、Armour，W.、Waterman，D.G.、Iwata，S.和Evans，G.（2013年）。《水晶学报》。D类69, 1617–1632. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Foos，N.、Cianci，M.和Nanao，M.H.（2019年）。《水晶学报》。D类75, 200–210. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Foos，N.、Seuring，C.、Schubert，R.、Burkhardt，A.、Svensson，O.、Meents，A.、Chapman，H.N.和Nanao，M.H.（2018年）。《水晶学报》。D类74, 366–378. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Gati，C.、Bourenkov，G.、Klinge，M.、Rehders，D.、Stellato，F.、Oberthür，D.、Yefanov，O.、Sommer，B.P.、Mogk，S.、Duszenko，M.，Betzel，C.、Schneider，T.r.、Chapman，H.N.和Redecke，L.（2014）。IUCrJ大学,1, 87–94. 科学网交叉参考中国科学院公共医学 IUCr日志谷歌学者
 Geremia，S.、Campagnolo，M.、Demitri，N.和Johnson，L.N.（2006年）。结构,14, 393–400. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Giordano，R.，Leal，R.M.F.，Bourenkov，G.P.，McSweeney，S.&Popov，A.N.（2012年）。《水晶学报》。D类68, 649–658. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 埃利桑那州吉拉德。，Chantalat，L.、Vicat，J.&Kahn，R.（2002）。《水晶学报》。D类58, 1–9. 交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Green，D.W.、Ingram，V.M.、Perutz，M.F.和Bragg，W.L.（1954年）。程序。R.Soc.伦敦A,225, 287–307. 中国科学院谷歌学者
 长谷川（Hasegawa，K.）、清水（Shimizu，N.）、大村（Okumura，H.）、水野幸男（Mizuno，N。J.同步辐射。 20, 910–913. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 长谷川（Hasegawa，K.）、山下幸之助（Yamashita，K。J.同步辐射。 24, 29–41. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Holton，J.M.和Frankel，K.A.（2010年）。《水晶学报》。D类66, 393–408. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Kabsch，W.（2010年一).《水晶学报》。D类66, 133–144. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Kabsch，W.（2010年b条).《水晶学报》。D类66, 125–132. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Liu，Q.，Z.和Hendrickson，W.A.（2011）。《水晶学报》。D类67, 45–59. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Marshall，H.、Venkat，M.、Hti Lar Seng，N.S.、Cahn，J.和Juers，D.H.（2012）。《水晶学报》。D类68, 69–81. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Melnikov，I.、Polovinkin，V.、Kovalev，K.、Gushchin，I.和Shevtsov，M.、Shevchenko，V.和Mishin，A.、Alekseev，A.、Rodriguez-Valera，F.、Borshchevskiy，V.以及Cherezov，V.，Leonard，G.A.、Gordeliy，V.&Popov，A.（2017年）。科学。副词。 三电话：e1602952科学网交叉参考公共医学谷歌学者
 Mizutani，R.、Shimizu，Y.、Saiga，R.、Ueno，G.、Nakamura，Y.、Takeuchi，A.、Uesugi，K.和Suzuki，Y.（2014）。科学。代表。 4, 5731. 科学网交叉参考公共医学谷歌学者
 Monaco，S.、Gordon，E.、Bowler，M.W.、Delagenière，S.、Guijarro，M.、Spruce，D.、Svensson，O.、McSweeney，S.M.、McCarthy，A.A.、Leonard，G.和Nanao，M.H.（2013）。J.应用。克里斯特。 46, 804–810. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Nakane，T.，Hanashima，S.，Suzuki，M.，Saiki，H.，Hayashi Bashi，M.，Inoue，T。，Nureki，O.、Iwata，S.、Murata，M.和Mizohata，E.（2016）。程序。美国国家科学院。科学。美国,113, 13039–13044. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Nanao，M.，Basu，S.，Zander，U.，Giraud，T.，Surr，J.，Guijarro克拉维尔，C.&Leonard，G.（2022年）。J.同步辐射。 29, 581–590. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Nanao，M.H.和Ravelli，R.B.G.（2006年）。结构,14, 791–800. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Nanao，M.H.、Sheldrick，G.M.和Ravelli，R.B.G.（2005）。《水晶学报》。D类61, 1227–1237. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Oscarsson，M.，Beteva，A.，Flot，D.，Gordon，E.，Guijarro、楠、，J.、Eguiraun，M.、Bolmsten，F.、Nardella，A.、Milàn-Otero，A.、Thunnissen，M.、Hellmig，M.、Kastner，A.、Schmuckermaier，L.、Gerlach，M.、Feiler，C.、Weiss，M.S.、Bowler，M.W.、Gobbo，A.、Papp，G.、Sinoir，J.、McCarthy，A.、Karpics，I.、Nikolova，M.、Bourenkov，G.、Schneider，T.、Andreu，J.、Cuní，G.、Juanhuix，J.、Boer，R.、Fogh，R.、Keller，P.、Flensburg，C.、Paciorek，W.、Vonrhein，C.、Bricogne，G.和de Sanctis，D.（2019年）。J.同步辐射。 26, 393–405. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Pandey，S.、Calvey，G.、Katz，A.M.、Malla，T.N.、Koua，F.H.M.、Martin-Garcia，J.M.、Poudyal，I.、Yang，J.-H.、Vakili，M.、Yefanov，O.、Zielinski，K.A.、Bajt，S.，Awel，S.和Doerner，K.、Frank，M.，Gelisio，L.、Jernigan，R.、Kirkwood，H.、Kloos，M.和Koliyadu，J.、Mariani，V.、Miller，M.D.、Mills，G.，Nelson，G.和Olmos，J.L.、Sadri，A.、佐藤、，T.、Tolstikova，A.、Xu，W.、Ourmazd，A.、Spence，J.H.C.、Schwander，P.、Barty，A.、Chapman，H.N.、Fromme，P.，Mancuso，A.P.、Phillips，G.N.，Bean，R.、Pollack，L.&Schmidt，M.（2021年）。IUCrJ大学,8, 878–895. 科学网交叉参考中国科学院公共医学 IUCr日志谷歌学者
 Ravelli，R.B.G.、Leiros，H.K.S.、Pan，B.、Caffrey，M.和McSweeney，S.（2003）。结构,11, 217–224. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Sanctis，D.de和Nanao，M.H.（2012年）。《水晶学报》。D类68, 1152–1162. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Santoni，G.、Zander，U.、Mueller-Dieckmann，C.、Leonard，G.和Popov，A.（2017年）。J.应用。克里斯特。 50, 1844–1851. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Schiltz，M.、Dumas，P.、Ennifar，E.、Flensburg，C.、Paciorek，W.、Vonrhein，C.和Bricogne，G.（2004）。《水晶学报》。D类60, 1024–1031. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Schmidt，M.（2013）。高级康登斯。物质物理。 2013, 167276. 科学网交叉参考谷歌学者
 Sheldrick，G.M.（2010年）。《水晶学报》。D类66, 479–485. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Stellato，F.、Oberthür，D.、Liang，M.、Bean，r.、Gati，C.、Yefanov，O.、Barty，A.、Burkhardt，A.、Fischer，P.、Galli，L.、Kirian，r.A.、Meyer，J.、Panneerselvam，S.、Yoon，C.H.、Chervinskii，F.，Speller，E.、White，T.A.、Betzel，C.、Meents，A.和Chapman，H.N.（2014）。IUCrJ大学,1, 204–212. 科学网交叉参考中国科学院公共医学 IUCr日志谷歌学者
 Taylor，G.（2003）。《水晶学报》。D类59, 1881–1890. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Yamashita，K.，Pan，D.，Okuda，T.，Sugahara，M.，Kodan，A.，Yamaguchi，T.、Murai，T.和Gomi，K.、Kajiyama，N.、Mizohata，E.、Suzuki，M.、Nango，E.、Tono，K.和Joti，Y.、Kameshima，T。科学。代表。 5, 14017. 科学网交叉参考公共医学谷歌学者
 Zander，U.、Bourenkov，G.、Popov，A.N.、de Sanctis，D.、Svensson，O.、McCarthy，A.A.、Round，E.、Gordeliy，V.、Mueller-Dieckmann，C.和Leonard，G.A.（2015）。《水晶学报》。D类71, 2328–2343. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Zander，U.、Cianci，M.、Foos，N.、Silva，C.S.、Mazzei，L.、Zubieta，C.、de Maria，A.和Nanao，M.H.（2016）。《水晶学报》。D类72, 1026–1035. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Zhang，T.、Yao，D.、Wang，J.、Gu，Y.和Fan，H.（2015）。《水晶学报》。D类71, 2513–2518. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者