1.简介

识别调节蛋白质功能和活性的小分子是药物开发的关键一步。基于片段的药物发现（FBDD）已成为一种有效和高效的方法，用于确定开发先导化合物的有希望的化学支架（Erlanson等。, 2016). FBDD是高通量筛选（HTS）的替代品，HTS使用生化或生物物理分析在拥有数万到数百万成员的大型库中搜索先导化合物（Fox等。, 2006). 这些图书馆的规模带来了巨大的后勤挑战，但它们仍然只能对可能的组合化学空间中的一小部分进行采样（Hann&Oprea，2004)并经常扩展以解决新的目标。HTS可以有效地识别与靶蛋白紧密结合的化合物，但这些分子由于高亲脂性或不利的药代动力学特性。从一个不完美且过于复杂的起点来看，优化（或保留）命中物的效力和选择性，同时提高生物利用度可能是极具挑战性的。在过去的二十年中，HTS的这些固有困难引发了FBDD的发展，这引起了学术界和工业界越来越多的兴趣（埃尔兰森等。, 2016).

与高温超导相比，FBDD利用简单分子（摩尔质量<300 Da，c（c）日志P（P）<3，<3个可旋转键，<3氢键供体或受体；康格里夫等。, 2003). 对于简单的分子，一个小的库可以有效地对各个化学空间进行采样。片段通常与靶蛋白结合较弱(K（K）_d日= 10⁻²–10⁻⁴ M（M）)但配体效率较高。为了向高亲和力化合物发展，可以通过偶联片段（“链接和合并”）或衍生单个片段（“生长”）来提高点击的结合亲和力。与高温超导撞击的发展相比，这一过程可以更好地理解和控制由此产生的先导化合物的结合模式和药代动力学特性。迄今为止，FBDD项目产生的候选药物取得了相当大的成功，有六种药物获得美国食品和药物管理局（USFDA）批准，超过15种候选药物目前正在进行临床试验（Erlanson等。, 2016; 杨克等。, 2020;https://practicalfragments.blogspot.com/2021/11/fragments-in-clinical-2021-edition.html).

片段-布雷筛选期间的结合检测仅限于具有可观吞吐量的分析，该分析可以检测高微摩尔至毫摩尔范围内的离解常数结合。在这些分析中，必须使用高浓度的碎片来实现明显的结合饱和，因此必须使用共溶剂（通常是DMSO）来增加溶解度。常用的碎片筛选技术包括表面等离子体共振、核磁共振、热变性中点偏移分析和质谱法。在评估碎片撞击的发展潜力时，其他低通量技术，如等温滴定热量测定，微尺度热泳、生化分析和X射线晶体学可用于提供有关结合亲和力和热力学以及结合位置和方向的信息。

除了使用X射线晶体学验证和表征其他技术识别的碎片击中的结合外，X射线结晶学作为主要筛选方法取得了巨大成功。它是检测结合最灵敏、最可靠的技术之一，并提供了有关碎片平衡的关键结构信息。此外，X射线晶体学FBDD（xFBDD）可以是“位点识别”，识别和定位结合在已知活性位点和变构位点的碎片。因此，它允许在没有假设的情况下，在不存在已知的高亲和力粘合剂的情况下，对整个可接触的蛋白质表面进行药物可药用性评估。1997年首次证明了X射线结晶学在FBDD初级筛查中的应用（Verlinde等。, 1997). 自那时以来，该方法的明显优势使其成为多家公司药物发现平台的组成部分（Spurlino，2011）; 哈伯德等。, 2007; 戴维斯等。, 2006; 价格等。, 2017). 在过去五年中，这种方法得到了更广泛的采用。MX束线在仪器、束流强度和机器人技术方面的技术进步使同步辐射源专用筛选平台得以发展。这种方法是由钻石光源（DLS）的XChem率先提出的，它为同步加速器用户（Douangamath）提供了第一个基于提议的全xFBDD（数百个碎片）平台等。, 2021; 克罗杰等。, 2017). 平行或随后，xFBDD平台在其他同步加速器源（Wollenhaupt等。, 2021; 利马等。, 2021; 西普里亚尼等。, 2012; 利马等。, 2020).

瑞士光源（SLS）高分子晶体学（MX）小组最近开发了自己的xFBDD平台，称为快速碎片和化合物筛选（FFCS）平台。在本出版物中，我们介绍了这个新建立的FFCS管道，重点是硬件和软件解决方案。

2.FFCS管道概述

FFCS管道是在SLS的MX集团内开发的。FFCS项目的主要目的是开发用于晶体浸泡、处理、数据收集和分析的下一代集成管道，这将有助于制药行业和学术实验室的高通量药物发现过程。FFCS管道包括以下步骤（图1).

图1 FFCS管道示意图。初始晶体在SWISSCI MRC-3板中进行优化，并测试DMSO弹性。板材以4°C或20°C的温度储存在岩石成像仪系统中，并定期成像。使用Echo液体处理装置，将选定的碎片从小体积储备溶液中非接触地转移到预选的晶体液滴中。随后，在水晶移动机器人的支持下，半自动水晶采摘可以有效冻结浸泡的水晶。

这一过程涉及处理数百个晶体和碎片/化合物，需要创造工具，使其更快、更高效、更自动化。FFCS管道的关键组件是硬件设置和内部开发的专用软件、FFCS公司软件套件，允许简单的实验设计、高效的簿记和链接FFCS管道的所有步骤。与霍亨海姆大学Günter Fritz小组的密切合作，使初始数据处理和结构解决方案能够通过其小组开发的先进数据评估管道进行扩展（Stegmann等。，准备中）。

3.硬件设置

为了容纳新设备，SLS大分子结晶设备（CF）进行了重大重组，该设备位于MX光束线附近。专门为FFCS设备创建了一个单独的空间，并进行了相应的调整。FFCS硬件设置在很大程度上受到DLS的XChem碎片筛选设施的启发，该设施是为学术用户量身定制的最大的高通量晶体碎片筛选设施。

结晶设备配备了机器人结晶筛分设备，使用坐滴式蒸汽扩散（或脂质立方相）和蚊子机器人（SPT Labtech）进行结晶筛分，该机器人可在4°C和RT两种温度下使用。结晶板在专用的4°C或RT Rock Imager（Formulatrix）平板酒店中进行条形码存储和成像。Echo 550非接触式液体处理器（Labcyte）安装在专用的无振动工作台上，以防止声滴注入实验过程中的任何干扰。为了确保寿命和保持高质量，FFCS片段和化合物库存储在专用存储系统中的条形码Echo Qualified 384孔或1536孔COC板（Labcyte）中。Storage­Pod系统（Roylan Developments）由储存碎片库的储存舱和用干氮气净化储存舱的控制器单元组成。这使得碎片和化合物库能够在惰性、无水分和无氧环境中储存，防止其稀释、沉淀和损坏。由于二甲基亚砜溶解物质的反复冻融循环与化合物降解有关（Kozikowski等。, 2003). 为了进一步延长其耐用性，FFCS库存储板采用PlateLoc Thermal Microplate Sealer（Agilent）热密封，使用铝基材料密封。

碎片/复合浸泡晶体的采集由晶体移位器（CS）机器人（牛津实验室技术公司）协助。CS设备是电动的xy公司显微镜工作台配有计算机软件，可以手动进行半自动错误减少的晶体拾取，同时防止结晶液滴干燥。采集站还配备了一个冰球扫描站（DLS工作人员与我们分享了其3D打印设计），该扫描站配备了两个专用摄像机，可以扫描冰球和（可选）pin条形码。

FFCS实验室设计投入了大量精力，以确保空间的人体工程学使用，并确保最佳工作流程。装置靠近实验程序中的步骤。液体搬运器无振动工作台和专用图书馆存储系统等解决方案为管道提供了坚固性和可靠性，并改进了现有设施。

4FFCS公司软件套件

内部开发的FFCS公司软件套件有助于FFCS管道中的实验设计和无缝逐步进展，同时代表用户高效地保存记录。这个FFCS公司该套件由FFCS数据库（FFCS DB）和四个图形界面组成：FFCS公司GUI中，Xi（希）图形用户界面，浸湿了我GUI和shiftMe公司GUI（图2). 专用实验FFCS用户控制台（Red Hat Enterprise Linux 7操作系统）以及Echo PC（Windows 10操作系统）和Crystal Shifter PC（Windows操作系统）均位于结晶设施实验室内，属于同一网络的一部分。用户在FFCS公司图形用户界面（GUI），选择水晶浸泡在Xi（希）图形用户界面；这些都可以在用户控制台上访问（也可以通过以下方式以完整的图形用户会话的形式进行远程访问无机器;https://www.nomachine.com/). 这个FFCS公司GUI发送Echo和Crystal Shifter实验的输入文件，而浸湿了我（Echo PC）和shiftMe公司（Crystal Shifter PC）GUI向FFCS公司图形用户界面。

图2 的示意图FFCS公司软件套件。用户控制台允许设计和控制实验通过这个FFCS公司图形用户界面。相关实验元数据存储在FFCS专用数据库中，并直接传输通过Echo和Crystal Shifter控制器PC的网络。Rock Maker和中央通用并行文件系统（gpfs）数据存储（以绿色显示）安装在用户控制台上；gpfs数据存储也安装在波束线控制台上。

4.1. FFCS数据库和FFCS公司图形用户界面

FFCS数据库系统接收并存储用户在整个FFCS活动中生成的所有元数据。FFCS DB部署在专用虚拟机（Linux OS）上，作为docker容器(https://www.docker.com/). FFCS数据库受益于MongoDB(https://www.mongodb.com/)无模式设计，不强制执行严格的元数据格式。目前实施的FFCS数据库集合为“Plates”、“Wells”和“Libraries”。每个集合都包含一个已实现的验证器，用于检查每个插入操作所需的关键字。此外，如果其中一个关键字不存在或关键字类型错误，则不允许操作。所有需要访问FFCS数据库中数据的Python软件都使用一个专用客户端，该客户端可根据数据库的要求检索特定数据。

这个FFCS公司GUI是一个前端PyQt5（Python 3.6）应用程序，用于与FFCS数据库中存储的文档交互。它可以通过一个专用的FFCS用户控制台访问，该控制台使用相同的组帐户（非个人电子帐户）来验证波束线控制台上的用户。这样可以将所有FFCS项目相关文件存储在用于X射线衍射数据采集的同一工作空间中。电子账户FFCS文件夹包括（i）结晶滴图像的副本，（ii）Echo和Crystal Shifter输入文件（在.csv文件格式），（iii）与电话GUI，控制TELL自动样本变换器的用户软件（Martiel等。, 2020)，（iv）自动化数据处理管道的结果(adp程序和调光器)，（v）包含FFCS实验报告和（vi）碎片库文件的电子表格（in.sdf文件格式）。

启动后FFCS公司GUI中，用户会看到一个菜单，列出与给定电子账户相关的所有正在进行的FFCS活动（活动名称作为唯一标识符）；或者，用户可以开始新的活动（图3一). 这个FFCS公司GUI选项卡表示给定活动的连续阶段，即“盘子”、“冷冻”、“浸泡”、“重新溶解”和“钓鱼”。结晶板可以添加到“板”选项卡中正在进行的FFCS活动中。板ID可以手动输入，也可以使用连接到用户控制台的条形码阅读器进行扫描。与给定FFCS活动相关的结晶板列表由Xi（希）GUI并在选择分配位置后更新。Cryo选项卡是FFCS管道的可选步骤，必须在最终浸泡实验之前执行。浸泡选项卡允许将所选碎片列表与目标结晶滴相结合（图3b条). “导出到Soak”按钮触发ZeroMQ(https://zeromq.org/)将浸泡定义文件传输到Echo PC，将打捞定义文件传输至Crystal Shifter PC。它还启动浸泡持续时间计时器，该计时器在“浸泡持续时间”列中每分钟自动刷新一次。浸泡完成后，Echo实验报告被发送到FFCS数据库，浸泡选项卡计时器停止，浸泡状态显示在FFCS公司GUI会相应更新。“Redissolve”选项卡是FFCS管道的可选步骤，该管道是根据需要创建的，用于需要无DMSO浸泡（Bedi等。, 2020). 最后的“打捞”选项卡显示使用水晶移动机器人进行水晶采集的结果，并包含“导出数据采集Excel表”按钮，可导出与SLS数据采集软件兼容的数据采集样本电子表格。

图3 这个FFCS公司GUI。(一)带有中央弹出消息的启动视图。为了清晰起见，放大了表示FFCS活动步骤的选项卡。(b条)浸泡选项卡显示碎片浸泡步骤的状态；这里的例子来自FFCS内毒素胃蛋白酶运动。

4.2.Xi（希）图形用户界面

这个Xi（希）GUI是一个PyQt5接口（Python 3.6），它允许使用合适的晶体轻松识别液滴，并精确定义碎片-悬浮位置，以进行目标浸泡实验。启动后，GUI（i）连接到FFCS数据库并为给定用户识别FFCS活动（基于电子帐户名称），（ii）提取分配给选定活动的结晶板的条形码，（iii）将图像从Rock Maker存储复制到专用FFCS活动文件夹。结晶液滴图像显示在中央Xi（希）GUI窗口和分配位置可以通过单击鼠标进行分配（图4). 可以通过鼠标左键/右键单击添加/删除分配位置，而移动到下一个/上一个图像则通过键盘左键/右键控制。给定板的井总数以及目标井的数量显示在GUI的左下角。选定的油井位置作为以下列表导出到FFCS数据库x个,年坐标，显示在FFCS公司GUI浸泡选项卡。

图4 这个Xi（希）GUI显示内毒素胃蛋白酶结晶滴。红点表示为DMSO中溶解碎片的靶向声学传递选择的位置。

5.数据收集和初步分析

在三条SLS MX光束线（PXI X06SA、PXII X10SA和PXIII X06DA）中的一条上手动或自动采集X射线衍射数据。使用SLS MX执行手动数据采集陆军部+数据采集（daq）软件GUI，即陆军部+GUI（沃伊迪拉等。, 2018)和电话GUI，用于控制TELL自动样本变换器（Martiel等。, 2020). 或者，使用智能数字用户(SDU（同步数字单元）)自动化软件包可用于所有三条MX光束线（Wojdyla等。，正在准备中）。SDU（同步数字单元）是用户控制实验的替代软件陆军部+GUI，是SLS MX分布式数据采集软件堆栈的组成部分，与许多其他软件实例进行通信，例如电话GUI和mxdb数据库。SDU（同步数字单元）用户可以在示例电子表格中定义数据收集和处理选项（模板可以从SLS MX网页下载）；或者，应用波束线特定的默认参数。自动数据处理(adp程序)对收集的数据子集（第一个“fastxds”步骤）以及总角度范围的完全处理数据提供即时反馈。在第二个“完成”步骤中，用户可以选择以下处理管道之一：内部开发的猫鼬,自动PROC（冯海因等。, 2011)或夏2拨号盘（冬季等。, 2018). 示例电子表格包括一列，用于指示在酒窝管道（沃迪尔等。, 2013)在专用范围内运行调光器守护程序包装器。如果使用FFCS管道浸泡晶体调光器守护进程从FFCS数据库中提取片段的SMILES（简化分子输入线路输入系统）代码，并使用肘部来自凤凰套房（莫里亚蒂等。, 2009). 产生的结果调光器输出保存在一个专用的FFCS文件夹中（按每个设计和每个样本组织），便于进一步的下游数据分析。

6.实施FFCS

为了评估FFCS管道在现实条件下的有效性和可靠性，我们进行了一系列内部活动。从溶菌酶和嗜热菌蛋白酶的初始测试开始，我们发展到内毒素胃蛋白酶，经典的片段筛选靶点（Köster等。, 2011; 哈希曼等。, 2016; 席贝尔等。, 2016; 沃伦豪普特等。, 2020). FFCS的第一个学术合作项目之一是对两种同源细菌酶的蛋白晶体进行研究。这些系统为我们的管道提供了具有挑战性的“真实”测试用例。这两个晶体系统依赖于不同的沉淀剂PEG和高盐，这两个结晶系统都必须通过不同的后结晶处理进行调整，以应对浸泡过程中大量DMSO的添加（Stegmann、Sharpe等。，正在准备中）。对于这两个项目，从FFCS管道碎片库（Maybridge Library Ro3，Thermo Fisher）中选择了500个最多样化的碎片（根据结构描述符FragFP选择）和50个特定于项目的碎片。成功优化浸泡条件后，对于每个研究的晶体系统，两到三天的间歇实验室工作足以进行浸泡和晶体采集（每天约250颗晶体）。使用水晶移动机器人进行辅助收割，两个测试系统平均每小时捕捞50-60颗水晶。考虑到这两个项目都显示结晶液滴顶部有一些皮肤形成，对于训练有素的用户来说，这些数字可能更高。在光束线PXI X06SA和PXIII X06DA上手动或使用SDU（同步数字单元）软件。手动数据收集和SDU（同步数字单元）产生了12–14个数据集，每小时旋转360°。优化后，在报告的项目中收集的衍射数据的分辨率平均为1.7和1.5Å（分辨率截止值由猫鼬中的协议adp程序软件；沃伊迪拉等。, 2018)对于项目1和项目2，所有数据集的分布范围都很窄（图5一和5b条). 使用处理的数据集adp程序（与内部XDS公司-基于猫鼬管道）被送入调光器计算的工人F类_o个−F类_c（c）差异密度映射并生成碎片坐标。随后的数据分析步骤是使用Günter Fritz小组开发的数据评估管道进行的。简而言之，管道包括以下步骤：（i）为每个碎片创建化学约束AceDRG公司（长等。, 2017)，（ii）碎片自动拟合到不同密度罗非特（智能等。, 2014)，（iii）后精制，包括适当放置侧链和水分子REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011),库特（埃姆斯利等。, 2010)和菲尼克斯定义（利伯施纳等。, 2019)和（iv）通过评分函数评估结合片段的结合亲和力斯米纳（科尔斯等。, 2013)和SmOG公司（诺埃尔等。, 2016). 执行分析管道步骤的bash脚本依赖于一个电子表格，该电子表格包含数据集的名称和浸泡片段的相应SMILES代码（输入可以从从FFCS公司GUI）。交互式助手脚本定义数据源和目标路径，并支持计算的并行化。整个拟合和评估方法将在其他地方详细描述和举例（Stegmann、Vering、Steuber&Fritz，正在准备中）。两个示例项目的命中率非常相似，分别为6.2%和6.4%，并且显示出定义明确、紧密结合的片段（表1).

图5 FFCS活动由两个合作项目产生。(一)项目1数据集的分辨率直方图显示，大多数晶体衍射到约1.7°（总范围为1.3至2.4°）。(b条)项目2数据集的分辨率直方图显示，大多数晶体衍射到1.5Å（总范围为1.1–2.4Å）。(c（c）)–(（f）)绑定碎片的示例。碎片由自动放置FLYNN公司(https://www.eyesopen.com/)进入F类o个−F类c（c）电子密度来自酒窝跑。这个F类o个−F类c（c）电子密度在1.5时以绿色显示σ.碎片是(c（c）)CD04232，N个-（2,6-二氟苯基）乙酰胺，PDB条目7平方米, (d日)BTB00030，3-[（呋喃-2-基）甲基]-1-（2-甲基苯基）硫脲，PDB条目7个, (e（电子）)Z26333434，4-[（1H（H）-1,3-苯并二唑-1-基）甲基]苯甲腈，PDB入口7平方米和(（f）)AC14079，5-甲基恶唑-2-酮，PDB条目7平方米5。图形是使用自动生成的PyMOL公司(https://pymol.org/)通过评估管道。

7.总结

随着MX自动化的最新进展和xFBDD的普及，我们在SLS实施了FFCS管道，为用户提供了一种使用X射线晶体学快速生成和评估潜在客户开发起点的额外途径。尽管FFCS管道的硬件设置基于现有XChem解决方案FFCS公司软件套件是内部开发的。SLS MX FFCS管道自2019年开始运营，有许多成功的学术合作和行业客户项目。在新冠肺炎疫情爆发时，严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）蛋白靶点（Sutanto）扩大了项目组合等。, 2021). 第一次FFCS活动的经验明确强调了管道的两个关键方面的重要性：（i）DMSO优化和（ii）软件灵活性。

在执行大规模浸泡步骤之前，我们首先优化浸泡条件，以获得最佳数据质量，该步骤可以在几小时内使用数百个片段或化合物进行。在这里，我们改变二甲基亚砜的浸泡时间和浓度，以确定合适的浸泡参数。这通常需要两到三轮迭代（与X射线数据采集相结合的实验室部分）。对于需要冷冻保护的晶体系统，需要完成额外的几轮测试。为了成功实施xFBDD活动，必须了解DMSO优化步骤的重要性（Wollenhaupt等。, 2021; 柯林斯等。, 2018)尤其是在具有挑战性的结晶系统的情况下，如上文所述的合作项目。

灵活的内部开发优势FFCS公司软件套件在人类YTHDC1领域的一个协作项目中得到了明确的演示。二甲基亚砜优化显示，活性位点被一个紧密结合的溶剂分子占据，阻止了阳性对照的结合。根据初始优化的结果，我们进行了无二甲基亚砜浸泡，其中预先选择的溶解在二甲基亚磺酸盐中的碎片通过Echo装置沉积在结晶板上，通过空气干燥去除溶剂并在结晶缓冲液中重新溶解。随后，将70个YTHDC1畴晶体手动转移到结晶液中进行浸泡和收获（两个步骤都由晶体移位器辅助），得到30个碎片结合结构（Bedi等。, 2020). 此特定项目的专用Redissolve选项卡是根据需要在FFCS GUI中创建的，可以跟踪FFCS数据库中的无DMSO浸泡实验。

近年来，在束线自动化、数据采集和自动数据处理方面取得了很大进展。这使得开发专用xFBDD筛选管道成为可能，现在许多同步加速器设施都提供了该管道。高通量的实验室设置与易于使用的软件相结合，为专家和无经验用户提供了更先进的早期药物发现实验程序。与此同时，同步加速器设施已广泛扩展其服务范围，远远超出标准X射线数据采集，提供了样品制备和数据分析等实验前和实验后步骤，所有这些都在同一同步加速器环境中进行。