2.1、。质粒的构建及定点突变

构建质粒pProEX N-His-TEV-YxaL，利用编码成熟YxaL（残基45–415）的PCR片段表达野生型YxaL天鹅绒双歧杆菌菌株GH1-13（Kim等。, 2019). 用位点特异性引物T175W_F、T175W_R、W215G_F、S213G/W215A_F和W215G-R进行定点突变，构建双突变体T175W/W215G和三突变体T175 W/S213G/W215A。所有定点突变均通过DNA测序确认。引物的核苷酸序列列于补充表S1.

2.2. YxaL蛋白的过度表达和纯化

野生型和突变型YxaL表达质粒被转化为大肠杆菌BL21（DE3）菌株用于未标记蛋白质或大肠杆菌用于硒代蛋氨酸（SeMet）标记蛋白的B834（DE3）菌株。使用Ni–NTA纯化未标记的野生型和突变型YxaL蛋白亲和层析然后用TEV蛋白酶进行切割，如之前的研究所述（Kim等。, 2019). 六组氨酸标记的裂解蛋白尺寸排除色谱法使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱（GE Healthcare）在20米内M（M）Tris–HCl pH 8.0缓冲液，含150 mM（M）氯化钠。使用Vivaspin 20（德国Sartorius）浓缩纯化的蛋白质，并将其储存在−80°C下。根据280 nm处计算的消光系数确定蛋白质浓度。

对于SeMet标记蛋白质的生产，大肠杆菌B834（DE3）细胞在补充有我-SeMet公司。使用Ni–NTA琼脂糖树脂（德国希尔登市齐根）纯化蛋白质，该树脂用TEV蛋白酶以1:100的比例处理，以切割六组氨酸标签，如其他地方所述（Raran-Kurussi等。, 2017). 然后从Ni–NTA琼脂糖柱中洗脱TEV蛋白酶处理的蛋白质，并将其装入HiTrap Q柱（GE Healthcare，USA）。将增加NaCl浓度的线性梯度应用于HiTrap Q柱。将含有YxaL蛋白的组分合并、浓缩，并进行尺寸排除色谱法使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg列（GE Healthcare）。通过SDS-PAGE检测最终蛋白质样品的大小和纯度。

2.3. YxaL蛋白的结晶

SeMet标记的野生型YxaL蛋白在16°C下通过坐滴蒸汽扩散法结晶，沉淀液由0.1M（M）CHES–NaOH pH 7.0，1M（M）柠檬酸钠。晶体在−196°C的液氮中闪蒸冷却。所有突变蛋白在16°C下使用吊滴蒸汽扩散法结晶。T175W/W215G突变蛋白使用沉淀剂溶液结晶，该沉淀剂溶液包含0.1M（M）HEPES–NaOH pH 7.0，1.5M（M）一水硫酸锂。T175W/S213G/W215A突变蛋白使用0.2的沉淀剂溶液结晶M（M）柠檬酸钠pH 5.8，15%(w个/v（v）)聚乙二醇4000，20%(v（v）/v（v）)2-丙醇。将T175W/W215G和T175W/S213G/W215A突变蛋白的晶体浸入12.5%的低温保护剂溶液中，在液氮中进行闪蒸冷却(v（v）/v（v）)二甘醇，12.5%(v（v）/v（v）)乙二醇，12.5%(v（v）/v（v）)MPD，12.5%(v（v）/v（v）)1,2-丙二醇，12.5%(v（v）/v（v）)二甲基亚砜，12.5米M（M）NDSB 201。

2.4. YxaL蛋白的数据收集和结构测定

在浦项加速器实验室的5C和11C光束线上收集X射线衍射数据集，并用香港（HKL）-2000年包装（Otwinowski&Minor，1997). SeMet标记的野生型YxaL蛋白晶体属于空间组 P（P）三₂21.结构由单个反常色散使用SeMet标记晶体数据集的（SAD）方法凤凰（利布施内尔等。, 2019). 该模型是使用库特（埃姆斯利等。, 2010). YxaL的最终结构通过R（右）16%的系数和R（右）_自由的19%使用凤凰利用野生型蛋白的坐标作为搜索模型，通过分子置换（MR）方法确定突变体的结构。表1提供了更多详细信息结构测定和精细化。

2.5. 治疗拟南芥YxaL的种子和培养拟南芥

拟南芥种子用2%次氯酸钠和0.05%Triton-X消毒10分钟，并在4°C下用无菌水冲洗数次。然后用1µg ml处理消毒种子⁻¹磷酸盐缓冲盐水（PBS；8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na）中的YxaL或其突变蛋白₂高性能操作₄和0.24克千赫₂人事军官₄在1 l去离子水中），在4°C的旋转振动器（20转/分）上放置20小时⁻¹). 浸透的种子在25°C的黑暗条件下，在含有1%蔗糖的0.5×Murashige和Skoog基本培养基（Sigma，目录号M5519）中的0.5%NuSieve GTG琼脂糖平板（FMC Bio­Products，Rockland，USA）上培养。在体视显微镜下测量了0.1%亚甲基蓝染色后2周龄幼苗的主根长和侧根数。

2.6. 使用胰蛋白酶进行有限的蛋白质水解

野生型和突变型YxaL蛋白，浓度为9.5 mg/ml⁻¹，分别用0.5 mg ml和不含0.5 mg ml培养⁻¹20m内的胰蛋白酶（蛋白质单体与胰蛋白酶的摩尔比为12:1）M（M）Tris–HCl缓冲液pH 8.0，含150mM（M）NaCl和2米M（M） β-巯基乙醇在60°C下放置45分钟等分的稀释后用SDS–PAGE监测。

2.7条。T型_米热位移法测量

使用蛋白质热转移染料试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）在QuantStudio 5实时PCR系统中进行热转移分析。用50µM（M）野生型、T175W/W215G和T175W/S213G/W215A突变体YxaL蛋白中的每一个在20 mM（M）含150m的Tris pH 8.0缓冲液M（M）NaCl从13至99°C，间隔0.1°C。

2.8. 统计

至少三个独立重复的实验数据被报告为平均值和标准偏差。统计数据通过执行Mann–Whitney进行分析U型测试和t吨-测试，使用第页小于0.05的值被认为存在显著差异。

3.1.晶体结构野生型YxaL蛋白的八叶片β-螺旋桨折叠

为了获得野生型YxaL蛋白的成熟形式（残基45-415），我们在大肠杆菌胞浆。大量蛋白质被成功纯化成同质性。 尺寸排除色谱法与多角度相结合光散射（SEC-MALS）表明，成熟的YxaL蛋白在溶液中是单体的(补充图S1一). 这个晶体结构YxaL的测定分辨率为1.8º反常色散（SAD）使用SeMet标记晶体（表1). 这个非对称单元晶体中含有两个短暂分子接触的分子，表明YxaL是单体蛋白，与SEC-MALS结果一致。

整体结构为近似圆环形状，宽度为～50º，深度为～30º。YxaL结构显示出八叶片β-螺旋桨褶皱域（残基87–415），除了N末端环区（残基45–86）。中的每个刀片β-螺旋桨褶皱域是由扭曲的β-由四个反平行面组成的薄板β-从中心轴放射出的线。YxaL的结构表现出Velcro般的闭合，如典型的β-螺旋桨折叠蛋白。最外面的β-第一片叶片的股线是N端β-钢绞线，稳定了尼龙搭扣中第一和第二叶片之间的环形排列（图1一和补充图S2).

图1 野生型YxaL蛋白的晶体结构。(一)野生型YxaL的结构显示在正交视图的功能区表示中（俯视图位于顶部，侧视图位于底部）。这个β-YxaL的螺旋桨褶皱颜色从蓝色（N端）到红色（C端）。注释了叶片的N端（N）、C端（C）和顺序。宽度和深度由底部的虚线箭头显示。(b条)静电着色YxaL的表面表征表面电位。顶视图位于顶部，底视图位于底部。

在标准方向上，顶部区域是N端区域，底部区域是C端尾部区域。将连接第一和第二叶片的环插入圆环体的底部区域，从而在圆环体底部形成一个平面（图1一). 顶部区域的中心轴像插头一样被N端环路区域覆盖（图1b条). N末端环区被删除的突变蛋白在大肠杆菌系统，表明N端区域有助于β-YxaL蛋白的螺旋桨折叠。

3.2. 保守的GXXX（XXX）色氨酸锁相互作用中的W基序

每个叶片由四个反平行的叶片组成β-股，命名为A–D，其中β-A股最靠近中心轴β-绞线D位于外表面。与其他由连续残留物组成的叶片不同，第一个叶片是N端和C端区域的组合。β-股线A–C来自C端区域，而β-链D来自N末端区域(补充图S2). GXXX（XXX）W基序（不变的Gly和Trp残基位于G和W位点，任何氨基酸位于X（X）位置）在外部保存β-PQQ系列中每个叶片的D股β-螺旋桨折叠蛋白。守恒GXXX（XXX）W基序在稳定β-相邻叶片之间形成色氨酸锁相互作用的螺旋桨结构（Anthony&Ghosh，1998; 詹森等。, 2012). 与典型PQQ系列不同β-螺旋桨折叠蛋白，YxaL在GXXX（XXX）第三和第四叶片上的W图案(补充图S3).

相邻G之间的色氨酸锁相互作用XXX（XXX）W基序是在G中的色氨酸残基之间形成的XXX（XXX）W基序和G中的甘氨酸残基XXX（XXX）W图案以循环排列的方式从下一个叶片（图2一). 在色氨酸键相互作用中，色氨酸的吲哚环被安装在后一叶片的疏水袋中。色氨酸残基的芳香吲哚环使π甘氨酸残基和平面肽键的相互作用XXX（XXX）下一个叶片中的W图案（图2b条). G介导的色氨酸锁相互作用XXX（XXX）因此，W图案对于稳定β-螺旋桨折叠。

图2 保守G的结构比较XXX（XXX）野生型YxaL蛋白第三和第四叶片中的W基序及其修饰基序。(一)保守G中的所有色氨酸和甘氨酸残基XXX（XXX）W图案强调为紫罗兰枝。修改后的图案中的Thr175、Ser213和Trp215显示为天蓝棒模型。(b条)保守G的特写XXX（XXX）W图案框在(一). 这个πTrp380和Gly87之间的相互作用显示为虚线。(c（c）)年红色框框中第三和第四叶片的修改图案特写(一). Thr175和Ser213之间以及Thr175和Trp215之间的距离如虚线箭头所示。

3.3. 第三和第四叶片中的修改图案

使用YxaL氨基酸序列进行结构预测无法识别GXXX（XXX）第三和第四叶片上的W图案。A G公司XXX（XXX）在第二个和第五个显式G之间的序列中没有显式发现W序列XXX（XXX）W图案。这个晶体结构YxaL的研究表明，第三片叶片中的Gly171与G中的Trp133有色氨酸键合作用XXX（XXX）第二个叶片上的W图案，导致GXXX（XXX）T型序列作为G的变体XXX（XXX）第三片刀片上有W图案。该结构进一步揭示了第四叶片中的Trp219与G的Gly256的色氨酸键相互作用XXX（XXX）第五把刀刃上的W图案，导致了一种变体W公司XXX（XXX）第四个叶片中的W序列（图2c（c）,补充图S2和S3).

G中的Thr175XXX（XXX）T型第三片叶片的序列不涉及任何色氨酸锁相互作用（图2c（c）). Trp215的吲哚环W公司XXX（XXX）第四片叶片的W序列似乎通过与疏水残基Phe165、Val177、Pro178和Ile207的相互作用而固定，类似于保守的G序列XXX（XXX）W图案。然而π由于缺乏Trp215介导的相互作用π电子合作伙伴。由于缺乏这种相互作用，YxaL的结构稳定性似乎降低。变体G中的Thr175和Trp215XXX（XXX）W序列占据了β-螺旋桨比典型色氨酸和甘氨酸残基（图2）b条和2c（c）). 修改后的图案也影响了上部区域，延伸β-股C4和D4明显位于β-螺旋桨（图2一和2c（c）).

3.4. 基于结构的蛋白质设计促进色氨酸锁相互作用

我们注意到Thr175在G中的存在XXX（XXX）T型第三片叶片的顺序提高了YxaL的结构稳定性。假设第三和第四叶片中恢复了典型的色氨酸锁相互作用。在这种情况下，Trp残留物将占据Thr175位点，并使π与甘氨酸残基的相互作用。因此，我们决定将Thr175改为色氨酸，以恢复典型的色氨酸锁相互作用。Thr175到Ser213和Trp215的相似距离代表了两种情况，用于选择将转变为甘氨酸的残基。

我们首先创建了一个T175W/W215G双突变体，以恢复保守的GXXX（XXX）修正G中的W序列XXX（XXX）W图案。在保守G中XXX（XXX）W基序，G中的Thr175位点XXX（XXX）T型序列和Trp215位点W公司XXX（XXX）W序列分别变成色氨酸和甘氨酸。我们预计G的突变Trp175之间会发生色氨酸锁相互作用XXX（XXX）W公司第三片叶片中的序列和突变的Gly215G公司XXX（XXX）第四个叶片中的W序列。T175W/W215G突变体的第三和第四叶片中产生的序列模拟了保守的GXXX（XXX）W图案。

接下来，我们根据第三和第四叶片的结构特征设计了一个T175W/S213G/W215A三重突变体。这个晶体结构YxaL的结果表明，第三叶片中的Thr175和第四叶片中的Ser213接近4°（图2c（c）). Thr175变为色氨酸，Ser213变为甘氨酸将模拟假定的色氨酸锁相互作用。Trp215与T175W/S213G模型结构中突变的Trp175过于接近。因此，我们进一步将Trp215改为丙氨酸，以防止与突变的Trp175发生冲突。创建T175W/S213G/W215A三重突变体以模拟Trp175和Gly213之间的典型色氨酸锁相互作用。

尺寸-排除色谱法与多角度相结合光散射（SEC-MALS）表明这两个YxaL突变体在溶液中是单体的，类似于野生型蛋白质(补充图S1b条和S1c（c）). 因此，突变蛋白有望正确折叠，显示出与野生型YxaL相似的整体结构。我们以高分辨率测定了这两种晶体结构，以在随后的研究中检查突变如何在分子水平上影响3D结构（表1).

3.5. T175W/W215G突变体YxaL蛋白的结构分析

在晶体结构在T175W/W215G突变体中，两个分子存在于非对称单元，在一个环连接中显示出不同的构象β-股C4至β-链D4（残留物211-214）。在一个分子中非对称单元连接回路定义不明确(补充图S4一). 在另一个分子中，第四个叶片中回路的Pro212π与第三叶片中突变的Trp175相互作用(补充图S4b条). 这两种分子之间的差异表明，环是柔性的，可能暴露在结构之外。突变Trp175的吲哚环没有π与任一分子中突变的Gly215的相互作用（图3一). 在T175W/W215G突变体中未观察到第三和第四叶片之间预期的色氨酸锁相互作用。有趣的是，连接β-股C4至β-链D4位于非对称单元从β-螺旋桨结构（图3一). 一个原单体中这个环的残基似乎与对称配偶中另一个原双体的底部相互作用(补充图S4b条).

图3 突变YxaL蛋白的晶体结构。(一)T175W/W215G突变型YxaL（绿色）和野生型YxaL（灰色）在带状表示中的重叠结构。叶片的顺序在左侧面板中标注。左侧面板中的方框区域在右侧面板中被放大。恢复基因中突变的Trp175171G公司XXX（XXX）W公司175第三片叶片上的图案和修复后叶片上的突变Gly215215G公司XXX（XXX）W公司219第四把刀刃上的图案用棍表示。(b条)T175W/S213G/W215A突变型YxaL（青色）和野生型YxaL（灰色）在带状表示中的重叠结构。左侧面板中的方框区域在右侧面板中放大，视图旋转45°。在右下面板中，为了清晰起见，仅显示了突变结构。恢复基因中突变的Trp175171G公司XXX（XXX）W公司175第三把刀刃上的图案用棍表示。改性后的甘氨酸213和丙氨酸215突变213G公司X（X）A类XXX（XXX）W公司219第四个叶片中的图案显示为棒状模型。这个π突变的Trp175和突变的Gly213之间的相互作用用虚线表示。

3.6. T175W/S213G/W215A YxaL突变蛋白的结构分析

在晶体结构在T175W/S213G/W215A突变体中，我们发现Trp175和Gly213之间存在假定的色氨酸锁相互作用（图3b条). 第三叶片中的突变残基Trp175也被第三和第四叶片中的疏水残基Phe165、Val177和Ala215包围。正如我们预期的那样，第四个叶片中的Trp175和Gly213导致π在保守G中观察到的相互作用XXX（XXX）W图案。有趣的是，Trp215处去除的吲哚环为色氨酸锁相互作用中突变的Trp175留出了空间（图3b条).

在色氨酸残基的侧链构象中发现了恢复的色氨酸与典型色氨酸键相互作用之间的差异。G中色氨酸残基的吲哚环XXX（XXX）前一个叶片的W图案埋在前一个和后一个叶片之间。然而，突变Trp175的吲哚环指出β-螺旋桨结构与G相比XXX（XXX）W图案。这一结果似乎归因于Phe165的侧链构象，它似乎通过疏水相互作用固定Trp175。此外，最外层β-由于πTrp175和Gly213之间的相互作用（图3b条). 尽管Trp175的侧链构象不同，但T175W/S213G/W215A突变体恢复了修饰G的色氨酸锁相互作用XXX（XXX）T175W/W215G突变体中未发现的W基序。

3.7. 工程化三突变蛋白提高了结构稳定性，具有更好的根系生长活性

我们比较了熔化温度(T型_米)蛋白质的值。T175W/S213G/W215A突变体YxaL蛋白表达量较高T型_米值大于野生型和T175W/W215G突变YxaL蛋白（图4). 与我们测试的其他突变体相比，三重突变体在根系发育方面也很有效。与野生型YxaL蛋白相比，用胰蛋白酶处理纯化蛋白时，三突变型T175W/S213G/W215A对蛋白水解的敏感性更低(t吨-测试，第页< 0.05;补充图S5).

图4 野生型和工程YxaL蛋白结构稳定性的比较。这个T型米用热位移法测定野生型（WT；黑线）、T175W/W215G突变体（蓝线）和T175W/S213G/W215A突变体（红线）YxaL蛋白的值。线形图显示在左侧面板中，平均值T型米野生型和突变型YxaL蛋白的值显示在右边的表格中。每个温度下显示的单个荧光原始数据点代表三个端点读数的平均值。

最后，我们研究了野生型、双突变体或三突变体YxaL蛋白在种植前处理种子对发芽和根系生长的影响拟南芥作为模型。未经处理的对照种子与所有野生型和突变型YxaL处理的种子之间的发芽率没有显著差异。值得注意的是，用1µg ml浸泡所有种子组⁻¹在野生型中，与未处理种子组相比，种植前2小时的双突变体或三突变体蛋白质显示两周龄幼苗的主根长度显著增加（图5一和补充图S6一和S6b条). 此外，与未处理的种子相比，用T175W/S213G/W215A突变体处理显著增加了侧根的数量（图5b条和补充图S6b条). 这些结果表明，基于结构的蛋白质工程可能通过增加结构稳定性来提高YxaL的根系生长-繁殖活性。

图5 野生型或突变型YxaL蛋白对2周龄大鼠主根长和侧根数的影响拟南芥幼苗。显示了主根长度的方框图(一)和侧根数(b条)添加或不添加1µg ml处理2小时后种植的两周龄幼苗−1野生型、T175W/W215G或T175W/S213G/W215A突变蛋白到浸泡溶液中。未处理对照组和处理种子组数据之间的统计显著差异由双尾Mann–Whitney确定U型测试，使用第页小于0.05的值。