2.1. DNA克隆和蛋白质制备

人类VASH1由364个氨基酸组成，分子量为40 825 Da。从pcDNA3.1和表达载体（Kadonosono）中扩增出人类VASH1c核心区（氨基酸56–310）和人类SVBP（氨基酸2–66）的基因等。, 2017). PCR片段被克隆到改良的pMalc2x载体（新英格兰生物实验室）。为了获得可溶的化学计量比VASH1–SVBP复合物，我们创建了一个融合蛋白，该融合蛋白包含N末端MBP标签、六组氨酸标签、5×TEV蛋白酶再认识序列、VASH1（氨基酸56–310）、2×TEV酶再认识位点和SVBP（氨基酸2–66）。

为了表达蛋白复合物，将质粒（CSBP255）转化为一次性BL21-Star（DE3）pLysS大肠杆菌活性细胞（Invitrogen），在100µg ml的LB板上选择⁻¹氨苄西林。将转化后的菌落接种在100µg ml的LB培养基中⁻¹在30°C下培养至OD_600纳米达到0.5。通过添加0.2m诱导蛋白质表达M（M）IPTG并再培养48小时。通过离心法收集细菌细胞。将细菌颗粒重新悬浮在缓冲液A500（10 m）中M（M）Tris–HCl，500米M（M）NaCl），并使用Sonicator XL2020超声波均质器（Misonix）在冰上进行超声处理。裂解液在12000下离心克在HisTrap FF柱（GE Healthcare）上放置15分钟。用洗脱缓冲液线性梯度洗脱（10 mM（M）Tris–HCl，500米M（M）氯化钠，250米M（M）咪唑）。这个洗脱液稀释至100米M（M）NaCl带缓冲液A0（10 mM（M）Tris–HCl pH 8.0），应用于SP Sepharose柱（GE Healthcare）上，并使用缓冲液A1000（10 m）以盐浓度梯度洗脱M（M）Tris–HCl pH值8.0，1M（M）氯化钠）。使用自制的TEV蛋白酶对复合物进行裂解。用缓冲液A0稀释裂解产物，并使用如上所述的SP Sepharose进一步纯化洗脱液应用于Superdex 200色谱柱（GE Healthcare），用缓冲液A500进行预平衡。使用Amicon Ultra-15离心过滤装置（30 kDa分子量截止值；默克）。对蛋白质进行10 m透析M（M）CHES pH 9.4。

2.2. VASH1–SVBP复合物的结晶和结构测定

通过混合等量的蛋白质溶液（17.7 mg ml）使VASH1–SVBP复合物结晶⁻¹)和来自JCSG Core Suite II结晶筛选试剂盒（Qiagen）的解决方案。在20°C和0.16的条件下，使用坐滴蒸汽扩散法获得最佳晶体M（M）硫酸铵，0.08M（M）醋酸钠pH 4.6，20%(w个/v（v）)聚乙二醇4000，20%(v（v）/v（v）)甘油。在结晶溶液中收集晶体，并在氮气流下进行闪蒸冷却。在光子工厂同步加速器设施（KEK）的BL1A上收集了X射线衍射数据。衍射数据由处理XDS公司（卡布施，2010年). 结构由以下因素决定分子置换使用凤凰包（Liebschner等。, 2019). 人体VASH1–SVBP复合体的坐标（PDB条目6nvq（无电压）; 阿达莫普洛斯等。, 2019)被用作搜索模型。使用迭代建模和精炼在里面凤凰和库特（埃姆斯利等。, 2010). 最终模型包含VASH1（链A类，氨基酸56–304），SVBP（链B类，氨基酸26-53），四个硫酸根离子和76个水分子。数字是使用库特,BIOVIA探索工作室（法国维利兹·维拉库布莱达索系统公司）和供应商管理部（汉弗莱等。, 1996).

2.3. VASH1–SVBP复合体的MD模拟

VASH1–SVBP复合物的X射线晶体结构（PDB条目6j7b号和6立方英尺本研究中解决的异四聚体；廖等。, 2019; 锂等。, 2019)用于MD模拟。为了制备配合物的模拟体系，去除了溶剂和小配体，包括抑制剂。使用特莱普中的程序琥珀色（案例等。, 2018)，用Cl中和复杂系统⁻离子，并使用TIP3P水模型在盒子中溶解，其中水盒子壁和蛋白质原子之间的距离在x个,年和z（z）指示。周期边界条件适用于所有模拟系统。这个琥珀色ff14SB力场参数用于蛋白质（Maier等。, 2015). 首先用最速下降法将制备的体系最小化1000步，然后用共轭梯度法最小化1000步。然后，系统的温度在1 atm压力下以100 ps的速度从1线性增加到310 K。在310 K和1 atm下进行额外的100 ps MD平衡模拟后，进行100 ns MD模拟以分析配合物的结构特性。范德瓦尔斯和短程静电相互作用的截止距离为12º，而长距离静电相互作用则使用粒子-米什-埃瓦尔德求和法进行计算。所有MD模拟均使用2 fs时间步长，其中所有含氢键均受SHAKE（震动）算法（Ryckaert等。, 1977). 结构和能量每2 ps取样一次。温度由朗之万恒温器（Loncharich）控制等。, 1992)1.0 ps⁻¹ 碰撞频率。压力由贝伦森气压调节器（贝伦森等。, 1984)压力释放时间为1.0 ps。对于每个VASH1–SVBP复合物，使用不同的随机种子对Langevin恒温器进行了三次独立的MD模拟。为了进行分析，删除了前10 ns的轨迹。C的平方根波动（r.m.s.f.）_α在将采样结构叠加在平均结构上之后计算每个络合物的原子。对于异四聚物络合物，链的r.m.s.f.值A类（VASH1）及其对称链D类（VASH1）被独立计算，以消除它们之间的相对运动对局部波动的影响。所有MD模拟和分析均使用琥珀色18和琥珀色工具18个包装（箱等。, 2018).

2.4. PDB沉积

人类VASH1c–SVBP复合体的结构已作为入口存放在PDB中6液化石油气.

3.1.晶体结构VASH1c–SVBP复合体

为了了解VASH1c–SVBP的结构基础，我们结晶了纯化的人VASH1c-SVBP复合物。该复合物结晶于空间组 P（P）6₁22，其结构在2.3º分辨率下通过分子置换（图1一,补充图S1，表1). VASH1c–SVBP二聚体的整体构象与参考结构高度相似，根-平方偏差（r.m.s.d.）为0.42º（图1b条). 在结构中，四个硫酸根离子结合在VASH1–SVBP的基本表面。一些报告的VASH–SVBP结构包含结合到基本表面的硫酸盐或磷酸盐离子（Li等。, 2019; 王等。, 2019). 有趣的是，在靠近催化三联体的位置发现了一个硫酸盐离子，并与Tyr134、Ser221和Arg222相互作用（图1c（c）). 这三个氨基酸残基在直接识别微管蛋白中很重要肽类和epoY抑制剂（Liao等。, 2019; 锂等。, 2019). 已知血管抑制素结合于α-微管蛋白，富含谷氨酸残基。因此，结合的硫酸根离子可能模拟肽-抑制剂的相互作用。

图1 VASH1c–SVBP复合物的晶体结构。(一)VASH1c–SVBP晶体结构在中非对称单元。VASH1c为绿色，SVBP为浅绿色。四个硫酸盐离子显示为球体，并标记为A–D。九α-VASH1c的螺旋线从N端编号到C端。(b条)VASH1c–SVBP结构的比较。VASH1c–SVBP结构叠加在报告的晶体结构（PDB条目6j7b号，灰色）。(c（c）)硫酸根离子（SO42−A） 绑定在催化三联体附近。与硫酸根离子接触的三个残基（Tyr134、Ser221和Arg222）突出显示为棒状模型，水O原子显示为红色球体。(d日)VASH1c–SVBP异四聚体结构在两个正交视图中。相邻的晶体二重对称相关分子显示为带状表示。链A类和D类（分别为绿色和洋红色）对应VASH1c。链B类和E类（分别为浅绿色和粉红色）对应于SVBP。链的Arg76A类链的（VASH1c）和Glu28E类与对称性相关分子形成氢键的（SVBP）显示为棒状模型。

虽然整体结构特征与报告的结构一致，但我们注意到N末端区域（氨基酸56–67）没有很好地排列，并且从VASH1c–SVBP核心突出（图1b条). 我们的结构与之前报道的结构进行了比较，结果表明，没有一个报道的结构具有相同的方向。令人惊讶的是，N末端区域被插入相邻的晶体对称性相关的VASH1c–SVBP分子中以形成异四聚体（图1d日). 异四聚体是由结晶双轴形成的；因此，另一个分子的N末端区域被插入到对称性相关分子中。

VASH1结构的叠加揭示了N末端区域构象的变化。甚至有一些结构中没有这个区域。在包含这个N末端区域的结构中，我们选择了两个结构（PDB条目6j7b号和6立方英尺)这最能代表构象变化。三种结构的叠加表明Gly65的位置差异很大，Arg64的侧链朝向相反的方向（图2一). 前面的N末端区域顺式-Pro68显示出较大的构象变化，而Pro68之后的区域同样形成α-螺旋线和叠合良好。当我们测量C的角度时_αGlu71、Pro68和Arg64的原子，异四聚体延伸最大，角度为112°。异二聚体形成的角度更为锐利（PDB入口为95°6立方英尺PDB入口中为74°6j7b号)、和PDB条目6j7b号显示了一个急转弯。扭转角的比较表明Gly65和Gly66的差异很大，表明肽翻转（表2). 由于这种结构变化，从Gly56到Arg64的区域被插入VASH1–SVBP核心域的缝隙中（图2b条).

图2 三种不同的VASH1c–SVBP复合物结构中VASH1c N-末端区域的构象。(一)VASH1 N末端区域（Arg64–Pro68）的特写视图，显示为彩色棒状模型：异四聚体（链A类)，绿色；PDB条目6j7b号，灰色；PDB条目6立方英尺，浅灰色。(b条)VASH1 N末端区域（Gly57–Arg64）的特写视图，显示为彩色棒状模型：异四聚体（链D类)，洋红；PDB条目6j7b号，灰色；PDB条目6立方英尺，浅灰色

为了仔细分析差异，我们使用国际学生成绩评估服务器(https://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/)和BIOVIA探索工作室异四聚体和异二聚体的界面面积相似，但与异二聚体相比，异四聚体具有更多的相互作用，这可能导致较低的溶剂化自由能（图3和表3). 在异四聚体中，Val62–Gly66与对称相关分子的相同区域形成氢键。插入的N末端区域也与VASH1核心区域的Val69、Met77、Phe142和Phe141相互作用（图3一). 在异四聚体和异二聚体中也观察到了类似的其他相互作用。Phe60、Phe61和Arg64参与相互作用（图3一, 3b条和3c（c）). 值得注意的是，PDB条目6立方英尺通过与VASH1核心区域的最小交互作用稳定（图3c（c）). 因此，我们的四聚体晶体结构揭示了N末端区域的意外变化及其通过广泛相互作用的稳定性。

图3 VASH1c N末端区域的相互作用图。(一)异四聚体。VASH1链条D类显示为结构公式红色洋红。链A类和D类是VASH1和链E类是SVBP。(b条)PDB条目6j7b号异二聚体。VASH1链条A类显示为结构公式深灰色。链条B类是SVBP。(c（c）)PDB条目6立方英尺异二聚体。VASH1链条A类显示为结构公式浅灰色。链条B类是SVBP。分析了N-末端区域的分子内和分子间相互作用，并在2D图中显示。相互作用的氨基酸显示在带有链ID和残数的圆圈中。圆圈按照以下方案着色。吸引电荷相互作用，橙色；氢键，绿色；π–σ相互作用，紫色；π–πT型相互作用，洋红；烷基–π-烷基相互作用，粉红色。原子蓝色阴影的大小或氨基酸残基对应于溶剂可及性的程度。

3.2. VASH1c–SVBP复合物的MD模拟

在发现N末端结构的差异后，我们对异四聚体和异二聚体（PDB条目）进行了100 ns MD模拟6j7b号和6立方英尺)以表征N末端的构象灵活性和稳定性。C类_α在整个模拟时间内，三种配合物初始结构的VASH1的r.m.s.d.s小于3.5º(补充图S2)表明VASH1的整体结构对于所有配合物都是稳定的。VASH1在N-末端区域有五个连续的疏水性残基，VPFFV在残基58–62处（VPFFV_58–62)有助于形成VASH1的疏水核心。我们计算了VPFFV的溶剂可及表面积（SASA）_58–62在链条中A类和D类PDB条目中的异四聚体6年7月和6立方英尺作为模拟时间的函数（图4一, 4b条和4c（c）). 有趣的是，SASA值在350º左右波动²PDB条目在100 ns内6j7b号和6立方英尺另一方面，异四聚体的SASA值保持在150Å左右²对于100ns，除了第二次模拟中的一条链。在这种例外情况下，VASH1链的N末端在模拟的早期阶段从VASH1的疏水核心分离，并在整个模拟过程中大幅波动(补充图S3和电影S1). 当我们计算C的r.m.s.f.时_α在配合物中VASH1 N末端的原子，除第二个模拟中的链外，异四聚体的值略低于异二聚体的数值，异二聚物有多个峰，而异四聚物没有这些峰。当我们分析相互作用的差异时，环区中Arg64-Gly65处的峰值可能被异四聚体中对称相关分子相同区域中Val62和Gly66主干之间形成的氢键所抑制（图3一). 相邻SVBP的Arg76和Glu28之间的氢键可能抑制了Glu71和Arg76的其他两个峰值（图1d日). 此外，在异四聚体中，我们观察到两个二聚体的取向在模拟过程中发生了变化(补充电影S2). 由于这两个二聚体主要通过N末端区域连接，因此可能存在一个关键的旋转运动。MD模拟的结果表明，异二聚体和异四聚体在N-末端区域的灵活性上存在差异。

图4 三种不同VASH1c–SVBP复合结构的三个独立100 ns MD模拟。(一,b条,c（c）)疏水部分VPFFV溶剂可及表面积的时间演化58–62. (d日,电子,如果)C的平方根波动（r.m.s.f.s）α根据MD模拟计算出的N末端区域中的原子。

N末端区域（氨基酸56-69）的作用和构象变异的意义是什么？一种可能是SVBP结合、微管蛋白结合和切割、分泌和激活/失活所必需的。之前在Arg76观察到的VASH1处理可能是由该区域的塑性引起的（Sonoda等。, 2006). 有几种VASH1–SVBP晶体结构没有这个区域；因此，VASH1可以独立结合SVBP，不参与复杂的形成（Liao等。, 2019). 此外，VASH1截断结构（氨基酸77–365）可以抑制新生血管的形成，这表明该复合物具有功能性，并排除了分泌作用（Sonoda等。, 2006). 这可能是因为N末端区域的流动性和四聚体的形成可能会对VASH1的蛋白酶活性产生负面控制。肾素过程中观察到这种自动抑制/处理，它结合并形成β-带有蛋白酶结构域的薄板，用于阻断活性位点（莫拉莱斯等。, 2012). 有趣的是，在VASH1–SVBP–epoY结构中，N末端区域的Phe60与epoY抑制剂（Liao等。, 2019)但在其他结构中，相同的Phe60侧链旋转异构体的取向不同（Li等。, 2019). 在VASH2–SVBP–epoY中晶体结构，相应的Phe49也接近epoY（王等。, 2019). 相反，缺少该区域的截断VASH1用于微管蛋白复合物（Liao等。, 2019)，并且在VASH2–SVBP–微管蛋白复合物中，Phe49的侧链是无序的，并且没有建模。此外，N-末端区域的柔性被异源四聚体的形成部分抑制，其中相邻的SVBP接触该区域。这种构造可能会阻止Arg76的处理。正如我们在MD模拟中观察到的那样，当N末端区域被裂解时，异四聚体发生了关键的运动，那么VASH1–SVBP复合物可能是全功能异二聚体形式。因此，四聚体的形成和N末端的柔韧性可能会将VASH1锁定为一种不活跃的构象，阻止底物结合，催化或周转。

有一些关于VASH1–SVBP和VASH2–SVBP复合物的生化报告。内源性全长VASH1–SVBP和VASH2–SVBP复合物显示微管蛋白羧肽酶活性，该活性被炔烃-环氧乙烷（Aillaud）抑制等。, 2017)或基因突变（Nieuwenhuis等。, 2017). 重组全长VASH1和VASH2的活性需要SVBP的存在，并且通过突变VASH1或VASH2中的催化半胱氨酸（Aillaud等。, 2017; 尼文会斯等。, 2017). 截短的VASH1（52–310）–SVBP复合物的生化分析揭示了VASH1c–SVBP复合体的酶特性，具有K（K）_米7.9µM（M）和ak个_猫44.5分钟⁻¹对抗微管蛋白肽类（李等。, 2019). 全长复合物和截短复合物之间的差异尚未报道。此外，还没有报道对异二聚体和异四聚体的活性进行比较。未来的生化特征，包括N末端区域的突变体，应揭示N末端在血管抑制素功能中的作用。