X-ray and UV radiation-damage-induced phasing using synchrotron serial crystallography

Foos, N.; Seuring, C.; Schubert, R.; Burkhardt, A.; Svensson, O.; Meents, A.; Chapman, H.N.; Nanao, M.H.

doi:10.1107/S2059798318001535

研究论文

结构
生物学

国际标准编号：2059-7983

第74卷| 第4部分| 2018年4月| 第366-378页

https://doi.org/10.1107/S2059798318001535

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同步辐射连续晶体学研究X射线和UV辐射损伤诱导相位

^一结构生物学小组，欧洲同步辐射设施，71 Avenue des Martyrs，38000 Genoble，France，^b自由电子激光科学中心，德国汉堡Notkestrasse 85，22607，Deutsches Elektronensynchrotron，^c（c）汉堡超快成像中心，Luruper Chaussee 149，22761 Hamburg，Germany，^d日欧洲XFEL（XBI）综合生物基础设施生命科学设施，德国施奈费尔德Holzkoppel 4，22869，^{e（电子）}汉堡大学生物化学和分子生物学研究所，德国汉堡诺克斯特拉街85号，邮编：22607，^（f）德国汉堡Notkestrasse 85，22607，Deutsches Elektronensynchrotron，Photon Science，以及^克汉堡大学物理系，Luruper Chaussee 149，22761 Hamburg，Germany
^*通信电子邮件：max.nanao@esrf.fr

德国康斯坦茨大学K.Diederichs编辑(2017年7月28日收到； 2018年1月23日接受； 2018年4月6日在线)

特定辐射损伤可用于确定相位从头开始来自高分子晶体。这种方法被称为辐射损伤诱导相位（RIP）。该方法的一个局限性是必须将单个数据集的剂量降至最低，这反过来又导致数据集的多重性较低。解决这个问题的方法是使用来自多个晶体的数据。然而，由于晶体之间缺乏同构性，产生的信号可能会降低。在这里，研究表明，串联同步辐射晶体学结合选择性合并数据集可用于确定胰岛素和索马丁的高质量相，增加的多重性可大大提高实验的成功率。

关键词：同步辐射连续晶体学;辐射损伤诱导相位;实验定相;辐射损伤;遗传算法.

类似文章

1.简介

辐射引起大分子晶体的许多变化。其中包括原子占用率或运动的减少，这被称为特定辐射损伤。X射线或紫外线可引起特定辐射损伤，并影响金属S^γ二硫化物中的原子、硫醇键和羧酸盐中的末端O原子（后者仅由X射线诱导；Ravelli和McSweeney，2000 ; 伯梅斯特，2000年 ; 魏克等。, 2000 ; Pattison&Davies，2006年 ). 特定的辐射损伤可能是大分子晶体学（MX）从业者的主要关注点，但在某些情况下，这种损伤可以用于实验确定相位（拉维利等。, 2003 , 2005 ; 兹瓦特等。, 2004 ; 巴努马蒂等。, 2004 ; 韦斯等。, 2004 ; 希尔茨等。, 2004 ; 拉马戈帕尔等。, 2005 ; de Sanctis&Nanao，2012年 ; 德桑克提斯等。, 2016 ). 这种技术被称为辐射损伤诱导相位（RIP），通过与单一同构替换（SIR）类似的方式，使用两个数据集计算结构因子的差异（受损状态和较少受损状态之间）。然而，与SIR不同，不需要浸泡重原子。如果特定地点的入住率下降幅度足够大，并且全球辐射损害已经最小化，则可以确定辐射损害的位置。与X射线RIP相比，紫外线RIP通常具有诱导较少一般性全球辐射损伤的优势（Nanao&Ravelli，2006 ; 德桑克提斯等。, 2016). 当在单晶上或实际上在单晶的相同位置上执行时，RIP具有损坏和未损坏数据集之间相对较高同构的优点。这是RIP和传统同构方法之间的一个关键区别，在这种方法中，实验是在不同的晶体上进行的，并且引入重原子经常会导致非同构。根据特定损害与全球损害的比率、场地数量及其敏感性，可以预计强度会发生广泛的相对变化。基于Crick&Magdoff（1956）对最大信号的初步估计 )这表明，即使六个二硫化物S原子的占有率降低26%，也可能导致在2θ=0（克里克和马多夫，1956年; 拉韦利等。, 2003). 实际上R（右）已经观察到受损和未受损数据集之间的值：尽管胰蛋白酶的内部含量较低（~4%），但总的来说高达14%R（右）值（南澳等。, 2005 ). 这将RIP与另一种基于内源化学基团的主导定相方法区分开来：长波长硫SAD。因此，潜在的高信号和对晶体化学修饰的需求不足为传统同晶和反常方法提供了一种潜在有用的替代方法。然而，X射线和UV RIP方法的一个关键限制是，通常必须至少收集两个完整的数据集。针对这一局限性的两种解决方案是收集一个大数据集，并在“分段RIP”分析中将其细分为两个子数据集（de Sanctis&Nanao，2012）)或将特定损伤建模为剂量的函数，如夏普（席尔茨等。, 2004; Schiltz&Bricogne，2008年 , 2010 ). 在分段RIP中，采集一个大的高总剂量数据集，采集的第一幅图像被视为低损伤数据集，最后一幅图像被处理为损伤数据集。最后，在大晶体的情况下，可以从单个晶体中收集多个位置，以便在紫外线/X射线照射之前测量一个完整的低损伤数据集。然而，这种方法的实用性受到较小晶体趋势以及晶体内非同构的限制。在UV RIP实验中，损伤量取决于UV源，取决于单位电池在晶体体积上。特别是，大分子晶体中有限的光穿透深度对较大晶体的均匀照明是一个重大挑战。因此，如果能够收集到完整的数据集，那么使用小晶体具有显著的优势。While期间穿透深度对于X射线损伤而言，这不是一个问题，如果能够收集到高多重性数据集，则可以预期相位会得到改善。为此，我们采用了同步加速器串行晶体学（SSX）的最新发展，通过组合来自多个晶体的数据，在给定剂量下大大增加了记录的信号（Diederichs&Wang，2017 ). 实现SSX-RIP的一个主要挑战是有效处理晶体之间的非同构。自由电子激光系列飞秒晶体学（SFX）的模拟衍射图案表明，这种方法是可能的，但尚未通过实验证明（Galli，Son，White等。, 2015 ; 加利、儿子、酒鬼等。, 2015 ). 在这里，我们首次表明SSX可以用于成功地制备索马丁和胰岛素的大分子晶体从头开始通过X射线RIP和紫外RIP，探讨剂量、多重性与RIP信号的关系。

2.方法

2.1. 结晶

用于X射线RIP实验的索姆丁晶体按Nanao所述制备等。(2005). 用于UV RIP实验的立方胰岛素晶体是从Sigma–Aldrich（目录号I-5523）购买的猪胰岛素中获得的。生长出立方无锌胰岛素晶体通过通过混合4.5µl浓度为1.5mg ml的蛋白质溶液进行悬浮滴蒸气扩散⁻¹0.05英寸M（M）磷酸钠，0.01M（M）乙二胺四乙酸三钠盐（Na_三EDTA），pH 10.4–10.8，1.5µl储液罐溶液[0.05]M（M）磷酸钠缓冲液，0.01M（M）纳_三乙二胺四乙酸，20%(v（v）/v（v）)乙二醇pH值10.4]。将混合物与500µl储液罐溶液进行平衡。在298 K温度下1–2天后，获得了大小为～6×6×6µm的单晶。

2.2. 晶体采集

使用甘油作为最终浓度为20%的冷冻保护剂的缓冲液制备Thaumatin样品，然后用微孔膜（具有10µm孔的微孔膜；MiTeGen目录号M3-L18SP-10）。在硅片上直接获得立方胰岛素（补充图S1；Roedig等。, 2016 , 2017 ).

2.3. 数据收集

使用Dectris PILATUS3 2M探测器在欧洲同步辐射设施（Flot等。, 2010 ). 如德桑克提斯所述，使用高功率UV-LED对胰岛素晶体进行紫外线照射等。(2016). 使用网格和集合工作流（Zander等。, 2015 ). RIP工作流程使用这种方法，但在衍射图确定的每个位置执行多个采集。在该工作流程中未实施显式X射线灼伤，数据采集参数为100帧0.1°振荡，曝光时间为30 ms，曝光时间8.74×10¹⁰ 光子⁻¹和0.8728¦Μ波长，光束尺寸为10×8µm，选择时应确保在六次数据收集过程中，近似剂量范围将达到1–4 MGy。剂量方案用放射性核素三D类基于晶体尺寸和光子通量（泽尔丁等。, 2013 ). 该特定范围是根据之前的工作选择的，这表明RIP信号在～2 MGy时是最佳的（Bourenkov&Popov，2010 ; de Sanctis&Nanao，2012年). 在每次连续曝光中，收集100帧0.1°振荡，形成10°子数据集。每个子数据集使用相同的振荡范围。然后将第一次曝光用作“之前”数据集，随后的曝光用作“之后”数据集。“之前”数据集虽然不是无损伤的，但剂量最低。“后”数据集是剂量最高、损坏最严重的数据集。

2.4. 数据处理

数据缩减使用XDS公司（Kabsch，2010年 )通过格伦纳德ESRF的自动化管道（摩纳哥等。, 2013 )并使用参考数据集关键字。所有衍射图像都是用Zenodo沉积的(https://doi.org/10.5281/zenodo.1035765). 因为即使在这些模型系统中，子数据集之间的数据质量和同构也可能存在一些差异，所以只选择了一些用于合并的子数据集。这是使用CODGAS公司 遗传算法（GA；赞德等。, 2016 ).CODGAS公司应用生物自然选择原理，根据由合并统计组成的目标函数，选择要合并的子数据集[例如〈我/σ(我)〉,R（右）_测量，抄送_1/2和完整性]。使用默认目标函数权重随机生成不同的潜在合并解决方案，然后通过最大化目标函数进行轮次优化。

2.5.下部结构决心

然后将每对数据集（“之前”和“之后”）视为标准RIP实验，改变缩放比例(K（K）)中的前后数据集SHELXC公司，它提供了RIP分阶段策略的本地实现，如Nanao中所述等。(2005)拉韦利等。(2005)和Sheldrick（2010年 ). 改变缩放比例(K（K）)和运行SHELXC公司/D类/E类是使用Perl脚本执行的。The sampling ofK（K）从0.97到1.01，增量为0.00211。下部结构测定是在SHELXD公司使用5000分,壳牌500 2.2和查找9索姆丁，以及NTRY 5000元,壳牌500 2.0和查找6用于胰岛素。根据〈d日′/σ(d日'）〉降至1.5以下。

2.6. 阶段化和阶段改进

在搁架使用溶剂压平和五个自动建造周期（Sheldrick，2010; Thorn&Sheldrick，2013年 ).

2.7.精炼和后部分析

阳极（Thorn&Sheldrick，2011年 )用于确定F类_o个−F类_o个模型相RIP差异电子密度图峰值高度。对于这种计算和相位误差的评估，使用了改进的原子模型。这个精炼程序如下。分子替换使用执行MOLREP公司（Vagin&Teplyakov，2010年 )带有PDB条目5英尺/小时用于thaumatin和PDB入口9英寸用于胰岛素。模型是在中手动重建的库特然后使用巴斯特（埃姆斯利等。, 2010 ; 布里科涅等。, 2011 ). 决赛精炼使用PDB_REDO公司Web服务器（Joosten等。, 2014 )在这两种情况下。这个加权平均数相位误差（wMPE）使用SHELXE公司使用-x个选项和中使用的相同优化模型阳极（谢尔德里克，2010年). 这个下部结构正确性计算方法为菲尼克斯埃玛（使用默认参数，但“tolerance”除外，它被设置为1.5º），使用参考伪原子下部结构由生成阳极使用F类_A类数据来自SHELXC公司RIP模式下（Adams等。, 2010 ; Thorn&Sheldrick，2011年).

3.结果

3.1. 数据质量

每个数据集都是从thaumatin和胰岛素微晶中获得的网格和集合工作流已使用合并CODGAS公司以获得完整的数据集。高分辨率限制是根据带有CC的箱子选择的_1/2高于25%（Karplus和Diederichs，2012年 ). 合并统计数据表明，所有“之前”和“之后”数据集都具有高质量、高完整性、高CC_1/2，高〈我/σ(我)〉和低R（右）_测量值（表1和2). 为每个案例选择的子数据集数量的变化（Expo）。X（X）或之前_X（X），之后_X（X）)遗传算法初始化的随机性导致的结果。在索马丁案例中，用于获取完整数据集的子数据集数量的增加可能是由于非特定辐射损伤导致单个子数据集质量下降，即为了获得同等的数据质量，需要更多的子数据集。世博会低分辨率（内壳）缺乏完整性。5和世博会。由于所使用的样品架以及只进行了小幅度振荡的事实，索姆丁的6可能归因于晶体的取向偏差。根据上一个数据集的统计数据（“Expo.6”用于thaumatin，“After_UV”用于胰岛素）选择高分辨率限值，并对所有其他数据集使用相同的分辨率限值。

表1
Thaumatin X射线RIP子数据集数据收集统计

曝光（博览会）1-6是通过连续数据采集获得的，数据采集通过由网格和收集工作流。

数据集名称	博览会。1	博览会。2	博览会。三	博览会。4	博览会。5	博览会。6
“空间”组	P（P）4₁2₁2	P（P）4₁2₁2	P（P）4₁2₁2	P（P）4₁2₁2	P（P）4₁2₁2	P（P）4₁2₁2
一,b,c（c）(Å)	58.31, 58.31, 150.98	58.33, 58.33, 151.13	58.42, 58.42, 151.06	58.43, 58.43, 151.21	58.52, 58.52, 151.34	58.31, 58.31, 150.96
α,β,γ(°)	90, 90, 90	90, 90, 90	90, 90, 90	90, 90, 90	90, 90, 90	90, 90, 90
每个子数据集的累积剂量（MGy）	0.72	1.16	1.74	2.32	2.90	3.48
子数据集数量（收集了100个晶体）	22	25	24	36	33	32
分辨率范围（Ω）
总体	100–1.40	100–1.40	100–1.40	100–1.40	100–1.40	100–1.40
内壳	100–6.26	100–6.26	100–6.26	100–6.26	100–6.26	100–6.26
外壳	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40
反射总数
内壳	9601	10575	10527	15744	14777	13935
总体	806228	915459	878916	1324552	1219289	1172721
外壳	57767	65557	62992	94768	87347	83749
独特反射次数
总体	52243	50116	50825	52478	48493	48745
内壳	706	653	677	707	548	632
外壳	3788	3656	3670	3798	3708	3535
完整性（%）
内壳	99.9	92.4	95.6	99.6	76.9	89.4
外壳	100	96.2	96.3	99.7	96.8	93.4
总体	99.9	95.7	96.8	99.8	91.9	93.3
多重性
内壳	13.59	16.19	15.55	22.27	26.96	22.04
外壳	15.25	17.93	17.16	24.95	23.55	23.69
总体	15.34	18.26	17.29	25.24	25.14	24.06
R（右）_合并†(%)
内壳	5.6	5.4	6.1	5.5	5.6	5.2
外壳	224	218.2	222.6	262.7	262.4	276.1
总体	18.1	21.2	17.6	20.3	18.7	20.5
R（右）_测量†(%)
内壳	5.8	5.5	5.6	5.6	5.8	5.3
外壳	231.8	224.4	229.2	268	268	281.8
总体	18.7	21.8	18.1	20.7	19.1	20.9
〈我/σ(我)〉
内壳	36.61	39.29	41.91	45.28	55.72	48.90
外壳	1.06	1.22	1.22	1.10	1.16	1.10
总体	10.59	11.87	12.15	12.71	13.58	13.38
科科斯群岛_1/2‡(%)
内壳	99.9*	99.9*	99.9*	99.9*	99.9*	99.9*
外壳	28.1*	35.2*	38.7*	28.2*	31.6*	33.1*
总体	99.8*	99.7*	99.9*	99.8*	99.9*	99.9*
异常相关系数
内壳	9	14	三	13	5	14
外壳	0	−2	0	−1	三	−1
总体	−1	−2	0	0	1	1
SigAno公司
内壳	0.800	0.893	0.844	0.945	0.896	0.978
外壳	0.660	0.663	0.682	0.664	0.688	0.651
总体	0.769	0.773	0.784	0.780	0.790	0.785

†R（右）_合并= $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_}|i_{i}（hkl）-\langle i（hk1）\rangle|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_{i} 我_{i} （香港）]$ 和R（右）_测量= $[\textstyle\sum_{hkl}\{N（hkl）/[N（hk l）-1]\}^{1/2}\sum_{i}|i_{i}（hk1）-\langle i（hkl）\rangle|/]$ $[\textstyle\sum_｛hkl｝\sum_{i} 我_{i} （香港）]$ .
CC（立方厘米）_1/2在0.1%水平上有效的值用星号标记。

表2
立方胰岛素UV RIP子数据集数据收集统计

Before_UV.1是在紫外线照射之前获得的第一个数据集。Before_UV.2是第二个数据集，没有紫外线来控制X射线损伤的影响。After_UV是紫外线照射后获得的数据集。请注意，并非所有数据集都来自网格和集合采用程序。对于每个最终数据集，使用遗传算法选择要合并的子数据集。

数据集名称	在_UV.1之前	在_UV之前。2	之后_UV
“空间”组	我2₁三	我2₁三	我2₁三
一,b,c（c）(Å)	78.92, 78.92, 78.92	78.78, 78.78, 78.78	78.88, 78.88, 78.88
α,β,γ(°)	90, 90, 90	90, 90, 90	90, 90, 90
每个子数据集的累积剂量（MGy）	0.43	0.86	1.29
子数据集数量	91	76	88
分辨率范围（Ω）
总体	100–1.4	100–1.4	100–1.5
内壳	100–6.26	100–6.26	100–6.71
外壳	1.44–1.40	1.44–1.40	1.54–1.50
反射总数
内壳	18850	15562	14660
总体	1616572	1333165	1219845
外壳	121080	98710	91770
独特反射次数
内壳	355	356	295
总体	31315	31275	25409
外壳	2358	2336	1926
完整性（%）
内壳	99.7	100	100
外壳	100	100	100
总体	100	100	100
多重性
内壳	53.09	43.71	49.69
外壳	51.34	42.25	47.65
总体	51.62	42.62	48.08
R（右）_合并(%)
内壳	12.7	13.5	18
外壳	318.4	394.6	522.6
总体	22.5	25.1	50
R（右）_测量(%)
内壳	12.8	13.7	18.2
外壳	321.6	399.4	528.1
总体	22.7	25.4	50.5
〈我/σ(我)〉
内壳	52.63	47.62	36.45
外壳	2.21	1.64	1.62
总体	18.67	16.47	13.45
科科斯群岛_1/2†(%)
内壳	100.0*	99.7*	99.8*
外壳	71.0*	58.6*	57.1*
总体	99.9*	99.8*	99.8*
异常相关系数
内壳	29	24	10
外壳	−7	1	−2
总体	1	2	−1
SigAno公司
内壳	1.199	1.082	0.943
外壳	0.706	0.723	0.696
总体	0.821	0.817	0.783

†CC公司_1/2在0.1%水平上有效的值用星号标记。

对于每个最终数据集，使用遗传算法。这说明了连续数据集之间统计数据的一些可变性。此外，由于采集方法（晶体安装在网格上），晶体的某些方向是首选的，因此在某些情况下，这可能导致完整性降低。对于以后的数据集，这与完整性的权重低于〈这一事实相结合我/σ(我)〉和R（右）_测量在GA中，导致完整性降低（在所有解析shell中），但同时多重性和〈也随之增加我/σ(我)〉. 这可能是由于GA未选择不太常见取向的晶体，因为平均值较低我/σ(我)由辐射损伤引起的值。检查世博会中包含的子数据集。1人，但在世博会上失踪。5和世博会。6确实显示出更低的我/σ(我)〉值及以上R（右）_测量值。

3.2. RIP信号

色散信号随着剂量的增加而增加（补充图S2）。这是RIP信号的一个重要指标，但我们的分析重点是RIP峰值高度，这是RIP信号强度的一个更敏感的指标。应该强调的是，这是一个“事后”分析，需要高质量的相位集。为了确定RIP峰值高度，模型相位用于计算F类_之前−F类_之后使用缩放的差分图F类_A类（结构系数振幅下部结构atoms）值SHELXC公司然后搜索此差异图中的峰值。峰的位置揭示了结构中的哪些原子受到了损伤，而峰的高度则表明了损伤的程度，从而也表明了RIP信号的强度。在索姆丁X射线RIP实验中，在Cys126 S原子上可以找到最强的峰。图1描述了作为剂量函数的平均最大峰高。即使在相对温和的剂量下（例如1.16 MGy），也存在大量RIP信号。当剂量增加到1.74和2.32 MGy时，该信号显著增加，但在该剂量以上仅观察到适度增加（图1一和2一–2e（电子）). 负峰也可能出现在RIP差分图中，这对应于原子移动到新位置。一个众所周知的例子是S的运动^γ二硫键中的一个新位置。这些负峰值的幅度通常低于正峰值，可能是因为当S^γ在二硫化物中，与没有硫醇键的情况相比，可能的旋转体更少。然而，对差异图中的负峰进行检查也会发现较大的峰：比平均差异密度高出14.24个标准偏差（图2（f）–2j个). 虽然在合并统计中没有异常信号的证据，但我们使用阳极但发现在平均密度值以上没有超过4.8个标准偏差的峰值。因此，没有进行RIPAS（异常散射RIP）分析。对于UV RIP实验，为了区分X射线和UV损伤，在UV暴露（对照）之前收集了第二组子数据集。前两个X射线数据集（表2中的Before_UV.1和Before\UV.2）之间的平均RIP峰值高度)比平均值高4.24个标准偏差，表明这些数据集之间的X射线辐射损伤很小（图3b和3d日). 然而，比较第三个数据集（表2中的After_UV，发生在UV-LED暴露后，具有与前两个数据集相同的数据收集参数和剂量）和第一个数据集（Before_UV.1）在RIP图中显示出显著的峰值（图3一和3c（c）). 最大和最小峰高分别比平均值高23.34和−8.99个标准偏差，Cys7和Cys20在Cys S周围的差异最大^γ原子。与X射线RIP实验一样，几乎没有异常信号，最高峰值比平均密度值高6.7个标准偏差。

图1
索马汀RIP峰高与剂量的关系。(一)最大值和(b)模型阶段的最小峰值高度F类_之前−F类_之后差异电子密度图中的标准偏差高于平均值。每个值的点对应于所有峰值的平均值K（K）中使用的值SHELX公司误差条表示峰值高度的标准偏差。

图2
为thaumatin X射线RIP数据计算的模型相RIP差异电子密度图。(一)–(e（电子）)表示从第一组数据（Expo.1）中减去的递增剂量点（分别为Expo.2、Expo.3、Expo.4、Expo.5和Expo.6）。差异密度显示为6的绿色网格轮廓σCys126和Cys177之间的二硫键显示出最高的电子密度。(（f）)–(j个)差异图与(一)–(e（电子）)但轮廓为−6.5σCys66附近。

图3
立方胰岛素UV-RIP实验的模型相RIP差异图。6处等高线的正差电子密度σ表示为围绕半胱氨酸S原子的绿色网格。负电子密度差的等高线为−5σ半胱氨酸S原子附近的红色网格。(一)和(c（c）)是在数据集Before_UV.1和After_UV。(b)和(d日)是数据集Before_UV.1和Before\UV.2之间计算的RIP差异图，即在紫外线照射之前。X光差异图显示辐射损伤的证据很少，而紫外线照射前-紫外线照射后的差异图显示半胱氨酸S的强正峰^γ位置以及Cys20附近出现的新峰值。

3.3.下部结构决心

由于辐射损伤中通常有大量原子，因此RIP亚结构的测定可能很困难下部结构。事实上，在与SHELXD公司CC（all）图分析与CC（弱），除了在非常高的信号情况下，对RIP的用途有限（补充图S3）。然而，可以应用子结构解决方案成功的一个度量标准后部将实验子结构与伪原子参考进行比较下部结构。伪原子下部结构计算方法为SHELXC公司和阳极使用最高RIP峰值高度和优化模型。保留高于平均差值的六个标准偏差阈值的峰值。然后可以将该参考与SHELXD公司对比参考和实验确定的子结构，得出正确率百分比。对于立方胰岛素，参考物包含6个阳性和阴性位点，而对于thaumatin，有14个阳性和阳性位点。

thaumatin（X-射线RIP）和立方胰岛素（UV RIP）均产生可用于产生可解释相的亚结构。因为我们之前已经表明，在初始缩放后向下加权后数据集强度可以改进RIP相位的所有步骤，所以我们评估了一系列K（K）值（南澳等。, 2005; 德桑克提斯等。, 2016; 2016年祖别塔和南澳 ). 因为SHELXC公司/D类/E类对于管道而言，评估大量K（K）值自动通过一个简单的脚本。对于每个K（K）值，我们确定了下部结构如上所述的正确性，以及所有K（K）值（平均值下部结构正确性）。对于立方胰岛素下部结构正确率为57.67%（图4). 对于最有利的thaumatin剂量（3.48 MGy）下部结构正确率为29.47%（图4和5). 而胰岛素亚结构的质量一致较高，且相对不受比例因子的影响K（K），thaumatin亚结构可以通过应用K（K）值为0.97421、0.98474和0.99737，生成了46%的正确子结构，而在K（K）=1.01（图4). 有趣的是，尽管较高剂量下RIP差异峰高存在微小差异（图1)，只有最高剂量数据集产生了正确的thaumatin亚结构（图5和补充图S4）。对于索姆丁，我们使用了〈d日′/σ(d日′）〉值1.3–1.5，以确定高分辨率截止值SHELX公司然而，使用最好的K（K）值（0.97421）并重新运行SHELXD公司 下部结构在不同的最大分辨率下进行测定，我们发现最佳分辨率截止值出现在2.8-3.5℃左右。这对应于〈d日′/σ(d日′）〉值为2–2.5（补充图S5）。这强化了这样一个概念，即有时最好尝试不同的分辨率截止值，而不是仅仅依赖于基于差异统计的截止值。由于立方胰岛素中强烈的RIP信号下部结构在1.5至4.0℃的所有运行中确定。

图4
用胰岛素和thaumatin数据集测定亚结构的质量。子结构的正确性表示为实验子结构中与参考结构相比的保守位点的百分比（参考模型通过识别模型相RIP差异图中的峰来确定）。绿点对应于胰岛素的立方亚结构。蓝星对应最高剂量（3.48 MGy）的thaumatin亚结构。在红色虚线下方，子结构正确性小于45%。

图5
作为X射线剂量函数的索姆丁亚结构测定的质量。对于每种剂量K（K）将值与引用进行比较。计算下部结构如前所述执行正确性。低于并包括2.9 MGy下部结构不可确定。

3.4. 相位计算

RIP分阶段以类似于SIR的方式进行，主要区别在于存在负占用场地。由于目前没有任何子结构确定程序可以确定包括正面和负面占用场地的子结构下部结构必须通过引导获得。这可以通过相位改进和识别差分傅立叶图中的峰值（正和负）来迭代执行。在RIP中，此过程可能非常关键，因为下部结构（南澳等。, 2005). 然而，立方胰岛素UV RIP中的信号足够高，显示出对缩放的依赖性很小K（K）（图4)之前在其他UV RIP实验中观察到过（Nanao和Ravelli，2006).加权平均值相位误差（wMPE）是根据SHELXE公司使用最终引导下部结构与改进模型相比，一致优秀，总体平均wMPEK（K）18.5°（图6). 正如之前观察到的其他阶段化方法，当相关系数部分自动生成的SHELXE公司模型超过25%，并且每个片段的平均残基数大于10个残基。相比之下，索姆丁的相位计算对K（K）值。即使在最高剂量（3.48 MGy）下，也只有少数值产生了可解释的电子密度图（图6). 考虑到即使子结构的完整性约为低剂量点的四倍，也很难进行阶段化，因此仅在此剂量点进行阶段化分析（图5). 有趣的是，尽管RIP峰值高度在2.3 MGy剂量下趋于平缓，但相位和下部结构在该剂量下，甚至在2.9 MGy下，测定都不成功，但仅在3.48 MGy下（图7和补充图S6）。

图6
作为比例因子函数的实验相位误差K（K）与改进模型相比，wMPE是最佳相位误差。绿点对应于立方胰岛素，蓝星对应于剂量为3.48 MGy的thaumatin。红色虚线表示相位误差为35°，低于该误差的地图质量极佳。

图7
作为剂量函数的thaumatin的X射线RIP实验定相的相位误差。

3.5. 多重性的影响

获取具有高度多样性和完整性的数据集与控制辐射损伤是不一致的。因此，特别是在小晶体和/或低对称性的情况下，很难从单晶中获得X射线RIP所需的两个完整数据集（de Sanctis&Nanao，2012). 因此，RIP无法从高多重性数据集的阶段化优势中获益（Usón等。, 2003 ; 派克等。, 2016 ). 由于SSX RIP多重性仅受晶体多样性和数量的限制，SSX提供了获得“损坏”和“未损坏”状态更高多重性数据集的可能性。因此，我们对多样性对不同指标和阶段划分的影响感兴趣。对于这些分析，我们从前面讨论的非常高的多重性数据集开始（thaumatin Expo.1和6，以及胰岛素Before_UV.1和After_UV），并逐步减少其多重性以创建新的数据集（表3和4). 虽然有许多潜在的策略可以减少多重性，例如减少每个子数据集中的图像数量或基于特定标准删除子数据集，例如我/σ(我)，我们采取了一种实用的方法来减少多重性和随机省略的子数据集。增量删除了足够的数据集，一次将多重性减少1.5–2倍。此外，为了减少分辨率的影响，我们对所有数据集使用了相同的分辨率范围，即使它在某些外部分辨率外壳中产生的统计数据较差。

表3
减少多重性后的Thaumatin X射线RIP总体数据收集统计

与原始数据集（表1中的Expo.1–Expo.6）相比，每个数据集的多重性都被人为地降低了)通过删除足够的图像将多重性减少1.5–2倍。对于After系列，与Before系列相比，使用了更多的子数据集，因为开始的完整数据集也需要更多的子数据集才能实现我/σ(我)〉值与早期剂量点相当，可能是因为X射线损伤后数据质量下降。所有数据集使用相同的分辨率范围，这在某些情况下导致外壳统计数据降低。

	X射线RIP
数据集名称	之前_A类	之前_B类	之前_C类	之前_D类	之前_E类	之前_F类	之后_A类	之后_B类	之后_C类	之后_D类	之后_E类	之后_F类
子数据集数量	14	12	10	8	6	三	24	22	20	18	16	13
分辨率范围（Ω）
总体	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4
外壳	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40
反射总数
总体	513560	440049	366446	292681	219403	109888	879971	806757	733172	660329	586699	477028
外壳	36745	31479	26224	20990	15743	7911	62810	57587	52356	47156	41926	34088
独特反射次数
总体	51569	51534	50962	50817	50307	43461	48742	48736	48597	48596	47950	47937
外壳	3704	3704	3698	3679	3631	3083	3535	3534	3518	3518	3484	3484
完整性（%）
内壳	97.6	97.6	96.3	96	96	80.8	89.4	89.4	89.3	89.3	85.9	85.9
外壳	97.8	97.8	97.6	97.1	95.9	81.4	93.4	93.4	93	93	92.1	92.1
总体	98.6	98.6	97.5	97.2	96.2	83.1	93.2	93.2	93	93	91.7	91.7
多重性
内壳	8.90	7.71	6.42	5.12	3.82	2.24	16.47	15.16	13.84	12.43	11.50	9.32
外壳	9.90	8.49	7.09	5.70	4.33	2.56	17.76	16.29	14.88	13.40	12.03	9.78
总体	9.95	8.53	7.19	5.76	4.36	2.52	18.05	16.55	15.08	13.58	12.23	9.95
R（右）_合并(%)
内壳	5.5	5.5	5.7	5.4	5.6	4.6	5.1	5.1	5	4.9	5	4.8
外壳	201.3	199.1	244.9	184	205.7	174.7	278.9	273.9	285.9	279.9	284.5	263.6
总体	17.2	17.1	17.7	16.3	17	14.7	20.4	20.3	20.8	20.8	20.9	19.5
R（右）_测量(%)
内壳	5.8	5.9	6.1	6	6.5	5.7	5.2	5.2	5.2	5.2	5.2	5.1
外壳	212.2	211.9	219.8	202.1	232.4	211	286.5	282.3	295.3	290.2	296.2	277.1
总体	18.1	18.2	19	17.9	19.2	17.7	21	20.9	21.5	21.5	21.8	20.4
〈我/σ(我)〉
内壳	31.49	29.18	26.70	23.90	18.85	15.14	45.53	41.84	40.02	38.66	37.64	35.12
外壳	0.98	0.93	0.85	0.82	0.61	0.48	0.94	0.92	0.85	0.82	0.77	0.75
总体	9.13	8.51	7.74	7.05	5.53	4.25	11.72	11.32	10.69	10.27	9.77	9.20
科科斯群岛_1/2†(%)
内壳	99.8*	99.8*	99.8*	99.8*	99.7*	99.4*	99.9*	99.9*	99.9*	99.9*	99.9*	99.8*
外壳	23.4*	22.7*	18.8*	18.3*	12.7*	10.9*	28.3*	29.2*	28.3*	26.3*	23.3*	22.5*
总体	99.7*	99.7*	99.6*	99.5*	99.3*	99.2*	99.8*	99.8*	99.8*	99.8*	99.8*	99.8*

†CC公司_1/2在0.1%水平上有效的值用星号标记。

表4
胰岛素UV RIP多重性降低

每个原始数据集（Before_UV.1–After_UV；表2)与初始数据集相比，它的最大多重性被人为地降低了。对于After系列，与Before系列相比，使用了更多的子数据集，因为开始的完整数据集也需要更多的子数据库才能实现〈我/σ(我)〉值与早期剂量点相当，可能是因为X射线损伤后数据质量下降。所有数据集使用相同的分辨率范围，这在某些情况下导致外壳统计数据降低。

	紫外线RIP
数据集名称	之前_艾岛	之前_Bi公司	之前_Ci公司	之前_迪	之前_工程安装	之前_Fi（网络接口）	之前_吉	之前_您好!
子数据集数量	61	41	21	11	6	5	4	三
分辨率范围（Ω）
总体	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4	100–1.4
外壳	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40	1.44–1.40
反射总数
总体	1082251	726413	374875	196084	106764	89232	71445	53423
外壳	80952	54294	28131	31231	8075	6733	5394	4030
独特反射次数
总体	31317	31317	31291	14766	29308	28118	26159	24211
外壳	2358	2358	2358	2357	2279	2131	1979	1857
完整性（%）
内壳	100	100	99.2	98.9	76.1	71.1	65.4	64.9
外壳	100	100	100	100	97.1	90.8	84.4	79.2
总体	100	100	100	99.8	93.6	89.8	83.6	77.4
多重性
内壳	35.72	24.05	12.44	6.53	4.59	4.13	3.58	2.63
外壳	34.33	23.02	11.93	6.26	3.54	3.16	2.72	2.17
总体	34.56	23.19	11.98	6.28	3.64	3.17	2.73	2.20
R（右）_合并(%)
内壳	13.8	12.1	9.4	8.4	7.6	7.9	7.8	6.9
外壳	291.9	232.5	170.1	154.2	147.6	139.5	148.1	134.3
总体	22.7	19.2	14.1	12.1	10.4	10.2	10.2	9.8
R（右）_测量(%)
内壳	14	12.5	9.8	9.2	8.5	9	9.1	8.3
外壳	296.3	237.7	177.9	168.6	172.3	164	177.9	167
总体	23	15.19	14.8	13.2	12	11.9	12.1	12
〈我/σ(我)〉
内壳	44.17	39.86	29.99	22.59	19.35	17.39	15.93	13.66
外壳	2.11	2.11	1.78	1.31	0.89	0.90	0.76	0.74
总体	16.32	15.19	11.71	8.79	6.39	5.97	5.30	4.81
科科斯群岛_1/2†(%)
内壳	99.8*	99.6*	99.5*	99.2*	99.3*	98.9*	98.8*	99.5*
外壳	69.0*	67.0*	55.5	38.7	26.4	28.8*	27.1	25.2*
总体	99.9*	99.8*	99.5*	99.2*	99.2*	99.1*	99.0*	99.1*

	紫外线RIP
数据集名称	之后_艾岛	之后_Bi公司	之后_Ci公司	之后_迪	之后_工程安装	之后_Fi（网络接口）	之后_吉	之后_您好!
子数据集数量	61	41	21	11	6	5	4	三
分辨率范围（Ω）
总体	100–1.5	100–1.5	100–1.5	100–1.5	100–1.5	100–1.5	100–1.5	100–1.5
外壳	1.54–1.50	1.54–1.50	1.54–1.50	1.54–1.50	1.54–1.50	1.54–1.50	1.54–1.50	1.54–1.50
反射总数
总体	847024	572864	299805	156750	85897	71422	56916	42477
外壳	63380	432243	23078	12058	6604	5477	4335	3224
独特反射次数
总体	25406	25411	25405	25388	24902	24201	23105	21081
外壳	1925	1926	1926	1926	1897	1848	1762	1613
完整性（%）
内壳	100	100	99.7	99.3	96.3	90.2	85.8	78.3
外壳	100	100	100	100	98.8	96.2	91.8	84
总体	100	100	100	99.9	98	95.2	90.9	83
多重性
内壳	34.65	33.40	11.93	6.30	3.52	3.09	2.57	2.07
外壳	32.92	22.45	11.98	6.26	3.48	2.96	2.46	2
总体	33.34	22.54	11.80	6.17	3.45	2.95	2.46	2.01
R（右）_合并(%)
内壳	18.1	14.3	13.2	13.8	8.5	8.2	8	7.6
外壳	534.3	438.7	301.8	315.2	371.6	476.4	775.5	2747.3
总体	50.4	40.6	26.2	26.1	22.1	23.4	25.5	28.3
R（右）_测量(%)
内壳	18.5	14.7	14.1	15.1	10	9.8	9.8	9.7
外壳	542.6	448.8	315.3	344	436.1	572.2	959.7	3514.1
总体	51.2	41.6	27.4	28.6	25.8	28	31.4	35.9
〈我/σ(我)〉
内壳	31.52	29.23	22.56	17.17	13.18	11.86	10.52	9.39
外壳	1.49	1.48	1.32	0.95	0.62	0.52	0.32	0.12
总体	11.89	11.05	8.91	6.60	4.78	4.16	3.43	2.47
科科斯群岛_1/2†(%)
内壳	99.8*	99.9*	78.4*	99.3*	99.2*	98.5*	98.5*	98.8*
外壳	53.5*	51.8*	43.5*	22	8.7	8.9	2.2	2.4
总体	99.7*	99.7*	94.4*	96.1*	98.4*	97.8*	97.2*	97.1*

†CC公司_1/2在0.1%水平上有效的值用星号标记。

3.5.1. 多重性对RIP信号和相位的影响

在立方胰岛素中，多重性的影响很明显。在以前的RIP实验中，分辨率约为四倍至1.5º（Nanao等。, 2005)通常都能实现。由于SSX中可以使用多晶体，因此可以大大增加多重性。特别是，我们观察到RIP峰值信号的指数增益，如RIP差异图中的最大峰值高度所评估的，胰岛素的多重性高达12倍（图8一和8b)索默丁的多重性高达7倍（图8c（c）和8d日). 这些增益可以从正峰值和负峰值高度中看到。收益递减点出现在胰岛素的25倍倍和索马丁的8倍左右。这一趋势将持续到相位确定阶段。立方胰岛素的信号强度阈值在四倍时出现（UV RIP；图9一和9b). 正如其他定相方法所见，存在一个“灰色区域”，其中有足够的信号来确定可解释的相位，但没有足够的信号确定正确的RIP子结构。换句话说，如果已知下部结构在中用作起点SHELXE公司然后阶段化成功了，但显然这是人为的情况。对于thaumatin X射线RIP，我们观察到下部结构确定和定相：下部结构确定和定相需要6倍的重数，从已知的子结构开始可以减少到4倍。

图8
人为降低数据集多重性对平均模型相RIP差异峰高的影响。(一)和(b)对应于模型相中的最大和最小峰值高度F类_之前−F类_之后立方胰岛素UV RIP数据的差异电子密度图。(c（c）)和(d日)对应于thaumatin X射线RIP数据的最大和最小峰值高度。所有峰高均为平均值K（K）值。红点对应于未经重数减少的原始数据集。误差条代表不同峰值高度的标准偏差K（K）缩放的值。

图9
胰岛素UV RIP的实验阶段(一)和索姆丁X光RIP(b)从已知（蓝星）或实验确定的子结构（绿圈）开始。与改进模型相比，报告了所有试验中的最佳wMPE。

4.讨论

RIP为传统的反常和同晶方法提供了一种补充方法，用于实验测定相。尽管RIP也可以与反常和同晶方法结合使用，但它本身是一种有用的方法，特别是当重原子衍生化或硒蛋氨酸取代困难时。多晶体技术的最新进展使得从大量晶体获得的X射线数据中确定高分辨率结构变得切实可行。在这里，我们展示了串行方法产生足够的信号来确定相位从头开始通过X射线RIP和UV RIP对这两个测试系统进行测试。在本研究中，我们分别收集了低剂量和高剂量数据集；然而，我们也在探索通过同时优化两个数据集来改善RIP信号的可能性。通过这种方式，可以根据选择的子数据集改进同构信号。由于索马丁和胰岛素的相对高度对称性，我们简单地使用最强的子数据集作为处理期间索引其他子数据集的参考。然而，在某些情况下，单个子数据集可能没有包含足够的反射。在这些情况下，可能需要其他索引方法（和解决索引歧义），例如使用Brehm&Diederichs（2014）开发的方法 ). 对于非常不完整的子数据集，除非有可用的参考数据集，否则由于缺少常见反射，无法进行缩放。

对于X射线RIP，我们表明可以将RIP信号提高到4 MGy。这为串行RIP实验的设计提供了指导。例如，在ESRF中，可以在网格和集合内的工作流MXCuBE公司（加巴丁霍等。, 2010 ; 赞德等。, 2015). 具体来说，一旦构建了衍射图，就可以提供剂量率估计值，用户不仅可以修改单个数据采集参数，还可以修改每个位置的重新采集次数。因此，用户可以更改实验参数，为每个子数据集提供1 MGy，并四次收集每个位置。除了易于实验外，串行方法的一个关键优点是，与单晶相比，在给定剂量下，每个最终数据集可以实现更高的数据质量。衍射图案数量的增加有助于收集高多重性数据集。在许多类型的实验阶段化中，高多样性对阶段化的成功至关重要，特别是SAD（Cianci等。, 2008 ). 然而，由于RIP的传统方法需要极低剂量的“之前”和“之后”数据集，RIP通常没有从高多样性数据收集中受益。事实上，在某些情况下，甚至收集两个完整的低多重性数据集也可能是一项挑战。在这里，我们证明了串行方法可以用来产生具有良好统计特性的高多重性数据集，而且RIP峰高的指数增长是多重性的函数，直到索马汀和胰岛素的八倍和25倍多重性的收益递减点。正如先前对单晶X射线RIP所显示的那样，通过传统方法进行初始缩放，然后对高剂量数据集进行缩小，可以显著改善下部结构溶液（Nanao等。, 2005). 仍然没有办法先验的找到最佳比例因子K（K），除了尝试多次K（K）值，但此参数的可脚本性和直接支持SHELXC公司使过程简单明了。其他方法（如调整K（K）最大化非原点Patterson峰高的值也可能有效。此外，在运行时搁架对于每个K（K）值与计算时间相加，通过计算以下两个关键统计数据进行补偿SHELXE公司：的相关系数根据本地数据和平均片段大小部分自动构建的模型。与其他定相方法一样，这两个参数可以高度预测RIP的定相成功，并且是评估RIP在新系统中成功的主要手段。

因为这些是测试系统，我们还不知道这些模式是否会在低对称性或大型非同构的情况下得到证实。值得注意的是，我们关注的是最著名的X射线敏感基团：二硫化物。然而，在未来的工作中，我们希望将此扩展到其他辐射敏感原子，如羧酸盐中的氧原子和硒等重原子，其中异常信号可以与先前描述的单晶RIP信号（Schiltz等。, 2004; 拉韦利等。, 2005).

支持信息

补充图。内政部：https://doi.org/10.107/S2059798318001535/di5013sup1.pdf

致谢

作者想感谢ESRF MX beamtime allocation Panel为ESRF本项目和其他正在进行的SSX项目分配的波束时间（“SSX BAG”）。我们还要感谢ESRF分子生物学实验室的支持，特别是蒙特塞拉特·索勒·洛佩斯。

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