1.简介
长波长大分子晶体学(MX)为解决晶体学问题提供了直接途径相位问题通过利用天然蛋白质和核酸晶体中S和P原子的微小异常差异,而无需额外的重原子标记。硫的单反常衍射实验技术(S-SAD)于1981年首次成功用于小蛋白crambin(Hendrickson&Teeter,1981)). 1999年重新提出了使用S-SAD作为解决蛋白质结构的工具的想法(Dauter等。, 1999)2000年出版了第一部小说结构(刘等。, 2000). 然而,由天然S-SAD或P-SAD确定的新结构数量仍然很少。直到最近,才采用多晶体平均法确定了几个具有挑战性的晶体结构(刘等。, 2012; El Omari公司等。, 2014)以及仅从一个晶体进行多个方向的低剂量实验(Weinert等。, 2015). 除了不断成功地减少波束线硬件引入的仪器误差外,最近这些突破的主要因素是像素阵列探测器的引入(Broennimann等。, 2006)以及改进的数据处理和结构解决方案软件(Kabsch,2010; 谢尔德里克,2010年; 亚当斯等。, 2010).
自然SAD实验并不是长波长工作的唯一有用应用。将波长调到特定吸收边以下和以上可以明确确定结合辅因子,如Cl−,K+或Ca2+利用反常差分傅里叶图来定位硫的位置,将蛋白质序列锚定到分子再置换溶液的低分辨率电子密度图中,可以帮助建立模型。此外,来自M(M)V(V)铀的边缘((f)〃>100 e−)通过将铀酰盐与蛋白质结合,可以帮助大分子复合物的阶段化(Liu等。, 2001).
在过去几年中,同步加速器的MX光束线的设计已经进行了优化,以实现硒周围波长的全自动高通量仪器K(K)边缘(λ= 0.979 Å). 这些光束线中的许多可以访问高达2.3º的波长,并且上面引用的大多数工作都是在这种情况下成功完成的(Rose等。, 2015). 光子工厂的光束线BL-1A可以访问高达3.5º的波长,第一个成功的结果已经发布(Ru等。, 2012). 早期尝试获取硫和磷K(K)边缘(λ分别为5.015和5.779?)等。, 1997)和ESRF(Biou等。, 2005)很有希望,但显然受到当时可用技术的限制。Djinovic Carugo总结了克服长波MX技术挑战需要考虑的最相关因素等。(2005). 钻石光源(DLS)长波长MX光束线I23的设计解决了所有这些方面的问题,如下所述。
2.理论考虑
2.1. 散射和吸收的波长依赖性
在X射线与物质相互作用的过程中,会发生各种物理过程。这些过程可以分为弹性散射其中没有能量损失,非弹性康普顿散射(有能量损失)和与本例最相关的光吸收。在最后一个过程中,入射辐射被吸收,导致电子从原子中喷射出来。这种行为是元素特有的,并且表现出对入射辐射波长的强烈依赖性,表现出所谓的吸收边。散射过程随着波长的变化而更加平滑。
散射和吸收不仅发生在晶体内部,也发生在任何周围材料以及入射和衍射光束路径内。对于大气压力下的常规光束线,长波辐射随距离的衰减变得非常显著。图1(一)显示了波长范围为1到6º的空气通过多个路径长度的传输。除了这种衰减导致的信号减弱外,光束路径内的X射线散射还会在探测器上产生背景噪声,从而限制数据质量。使用轻气体(如氦气)可以大大降低这些因素,或者原则上通过在真空中进行实验来消除这些因素。
| 图1 X射线在不同长度空气中的传输是波长的函数(一),溶菌酶的质量衰减系数(b条)和归一化剂量加权衍射强度我E类(c(c))和归一化剂量加权异常衍射强度差Δ我E类(d日)用于不同大小的等长溶菌酶晶体。 |
入射光束强度的降低与光束通过的材料厚度成指数关系。这个过程可以用线性吸收系数 μ我这是材料化学成分和密度的特征。微观上,通过原子横截面的概念,可以通过材料中单个原子的叠加来理解这一点。这个线性吸收系数可以表示为基于材料化学成分的每个元素原子效应的总和,
哪里N个A类是阿伏伽德罗数,MW是分子量,ρ是密度,x个我是类型的原子数我从化学公式和σ一我是吸收横截面不同元素的我.图1(b条)显示了对线性吸收系数溶菌酶在波长范围为1-6º的不同物理过程中的溶菌酶XOP公司(Sánchez del Río&Dejus,2011年). 光吸收支配着材料的线性衰减。
The imaginary part of the反常散射系数与吸收成正比横截面原子的,如
哪里第页e(电子)是电子的经典半径λ是波长。
2.3. 增加衍射角
考虑长波长实验时的一个主要限制是布拉格定律表示的衍射角增加。图2显示分辨率(d日间距)作为不同波长的衍射角的函数。要达到至少d日=3º,很明显,对于λ=4°衍射角大于2θ=90°必须易于接近。在小分子晶体学中,这通常是通过在不同的探测器2上收集几次扫描数据来实现的θ偏移。由于辐射损伤,这种方法在大分子晶体学中并不理想。因此,需要一个覆盖样品周围大范围衍射角的探测器阵列。理想情况下,该阵列应为球形,但几何方面(如测角仪和样本变换器的空间要求)有利于扁平模块的圆柱形布置。这可以通过像素阵列检测器轻松实现,像素阵列检测器通常由矩形模块构成。
| 图2 分辨率是不同波长布拉格角的函数。 |
2.4. 数据收集策略
对于圆柱形探测器的几何结构ω测角仪的轴向长波方向显著增加(Dauter,1999). 此外,圆柱形探测器的形状产生了不利的纵横比,因此覆盖不均匀倒易空间。因此,只有使用多轴测角仪才能获得低对称空间群中晶体的完整数据,该测角仪允许晶体重新定向。由于实验受到辐射损伤的限制,因此从给定的样品中获得最佳效果非常重要。几何数据收集策略正在开发中,考虑到束线几何、阴影和碰撞,以优化SAD或MAD实验的异常差异测量。
2.6. 吸收校正
如前几节所述,吸收是长波长MX的一个限制因素。吸收不仅会导致辐射损伤,还会衰减样品中的衍射X射线。因此,所有测量的强度都必须根据X射线穿过晶体及其周围材料的路径长度进行校正。经验吸收校正可以在后细化步骤中进行。它们通常基于精炼使用对称相关反射的强度模拟吸收表面的球谐函数(Blessing,1995). 因此,在低对称性空间群中,经验吸收修正的适用性是有限的。
大分子晶体的X射线层析成像可以在光束线坐标系(Brockhauser)中重建衍射和非衍射材料的形状和体积等。, 2008). 长波束线有一个X射线层析成像相机集成在终端站的设计中。由此产生的三维模型将允许计算所有测量反射的路径长度,作为分析吸收校正的基础。
晶体的制备和安装非常重要,因为最小化晶体周围的非衍射材料将降低吸收效应。
3.真空中长波长MX光束线I23
3.1. 真空度
对于波长高达4º的波长,当压力低于100 Pa时,空气吸收和散射效应可以忽略不计。然而,蛋白质样品必须保持在低温下,这就要求更严格的真空度。其主要原因是低温泵效应:残余气体在真空中冷凝在冷物体表面,逐渐形成吸附分子层。由于X射线的吸收和散射,这一增加的层将导致数据质量的恶化。此外,低温冷却系统冷表面上的冷凝会增加热辐射的吸收,从而降低冷却效率,并导致系统所有组件(包括蛋白质晶体)逐渐升温。假设自由分子流和单位粘附概率,保守估计确定目标压力为10−4 I23样本环境的Pa。考虑到水蒸气是真空环境中的主要残留物,该模型表明,在2.5小时内,冰的生长速度约为1µm。
3.3. 样品转移
晶体从液氮传输到I23真空内终端依赖于一个适用于低温电子显微镜样品传输的低温传输系统(Leica VCT100)。该系统包括装载站、穿梭机和连接到I23真空容器的对接站。一次最多可以将四个放置在铜样品块上的样品架从装载站的液氮浴转移到冷转移梭。坞站起到承重锁的作用,允许铜块从航天飞机安全通过,进入真空容器内的样品酒店。样品酒店可在五个街区共容纳20颗水晶。夹钳机构在酒店和测角仪之间传输样品。采样过程的所有阶段都由机器视觉系统监控。图3中可以看到带有三个样品架和一个空位置的样品块.
| 图3 铜传输块中的三个样品架。一个位置是空的。 |
3.4. 梁线布局
主要光束线组件如下。X射线由2米U27真空波荡器产生。带有两个硅晶体(111切割)的双晶单色器(DCM)可以提供高达5.9º的波长。两对水平偏转镜用于聚焦和谐波抑制。第一对反射镜以矢状和切线方向聚焦光束,而第二对的两个平面反射镜用于抑制通过DCM的高次谐波,这在较长波长下尤为重要。光束可以聚焦到大约120×120µm的中等尺寸。这将使尺寸高达80µm的晶体均匀发光,以简化吸收校正。靠近样品的缝隙可以提供较小的光束尺寸。整个光束线波长范围为1–5.9º,针对1.2至4º范围内的实验进行了优化。
为了避免长波X射线的衰减,光束线是无窗口的。这意味着终端,包括样品环境和检测器,直接连接到储存环真空,这是通过沿不同束线段的差分泵送实现的。
4.材料和方法
4.1. 结晶和样品制备
在19°C下,通过坐滴蒸汽扩散法获得晶体。通过混合等量的40 mg ml−1索姆丁(Sigma–Aldrich,目录号T7638)在DTNB饱和去离子水中的溶液,结晶缓冲液由0.5组成M(M)酒石酸钾/钠,0.05M(M)ADA pH 6.8,20%甘油。使用导热杜邦-卡普顿支架直接从结晶液滴中收集晶体,并将其浸入一滴NVH油(MiTeGen)中,然后放入液氮中冷冻。
5.结果
图5显示了从索姆丁晶体收集到的X射线衍射图样(一). 为了清楚起见,120个探测器模块中只显示了15个。由于将整个样品环境和探测器置于真空中,X射线背景非常低。图5显示了一个典型的布拉格点(方框A)及其周围背景(b条). 背景主要是零到两个计数范围内的散射。低背景也表现为中等分辨率下平均1.2计数(图5一,方框b),溶剂环中的4.4计数(方框c)和低分辨率下的0.8计数(方框d)。虽然这些数据是使用相对较弱的无聚焦X射线束收集的,但正是这种噪声降低产生了较高的信噪比。
| 图5 索姆丁衍射像(一); 文本中解释了这些方框。(b条)是方框a的放大图像。 |
从晶体中收集了总共180°的衍射数据。出色的数据质量使得结构解决方案只需90°的数据即可获得成功。高信噪比反映在渐近的高值中我/σ(我)(ISa)第65.7页(Diederichs,2010年)). 表1列出了数据处理统计数据.
数据收集统计 | “空间”组 | P(P)41212 | 单位-细胞参数(Ω) | 一=b条= 57.84,c(c)= 150.37,α=β=γ= 90 | X射线源 | I23、DLS | 波长(Ω) | 1.378 | 分辨率范围(Ω) | 150.37–1.20 (1.22–1.20) | R(右)合并(%) | 3.7 (76.0) | R(右)下午。(%) | 1.5 (32.9) | 完整性(%) | 89.9 (79.9) | 多重性 | 6.8 (5.9) | 〈我/σ(我)〉 | 26.7 (2.2) | 科科斯群岛1/2(%) | 100 (74.4) | 国际标准协会 | 65.70 | 镶嵌度(°) | 0.047 | 威尔逊B类系数(Ω2) | 8.6 | 精炼统计 | R(右)工作(%) | 14.67 | R(右)自由的(%) | 16.75 | 氨基酸残基数量 | 207 | 水域数量 | 206 | 配体数量 | 4 | 离子数量 | 6 | R.m.s.d.,粘结长度(Ω) | 0.006 | R.m.s.d.,角度(°) | 1.174 | 平均B类系数(Ω2) | 蛋白质 | 15.05 | 水 | 23.77 | 配体 | 25.77 | 离子 | 29.86 | 拉马钱德兰阴谋 | 有利(%) | 99.1 | 允许(%) | 0.9 | 异常值(%) | 0 | 转子流量计不良(%) | 0.6 | 冲撞得分 | 2.73 | 摩尔浓度分数 | 1.06 | PDB代码 | 4zg3型 | | |
根据(4)计算出的波长为1.378Ω的索马汀的Bijvoet比率基于207个氨基酸中的17个S原子,为0.98%。根据分辨率外壳绘制的异常信号强度,估计为SHELXC公司,如图6所示根据这一估计,随后的分辨率截止值为1.5º下部结构决心。这种异常信号足以使重原子下部结构解和由此得到的电子密度图自动SHARP质量优良(图7(右),允许自动跟踪207个thaumatin残基中的200个残基。八个二硫键和蛋氨酸硫在反常差傅里叶图中清晰可见(图7,左)。
| 图6 异常信号强度ΔF类/σ(ΔF类)根据决议SHELXC公司. |
| 图7 电子密度(2F类o个−F类c(c))用于索姆丁结构的碎片(PDB条目4zg3型)在1处形成等高线σ水平(右)。C的表示α索姆丁的主干(黄色)显示了二硫键(绿色)的位置,在反常差傅里叶图(红色)中有相应的峰值,在4.0处等高线σlevel(左)。其中一个二硫键显示出紊乱。 |
在真空中溶解的索姆丁的结构与蛋白质数据库中的其他索姆丁结构没有显著差异。在类似条件下生长的晶体中,以可比分辨率测定的其他三种索姆丁结构与二级结构的比对显示出密切的相似性,特别是与PDB入口的相似性4axr公司(西普里亚尼等。, 2012). 所有207 C的叠加产生的r.m.s.d.值α两种结构的原子为0.078Ω。结构线形结果如表2所示,以及相应的细化统计对于所有比较结构。
PDB代码 | 高分辨率(Ω) | R.m.s.d.(奥兰多) | 精炼R(右)工作(%) | 精炼R(右)自由的(%) | 单位-细胞参数(Ω) | 4zg3型(本工程) | 1.2 | — | 14.67 | 16.75 | 一=b条= 57.84,c(c)= 150.37 | 1lx赫兹(查伦等。, 2002) | 1.25 | 0.27 | 17.90 | 19.50 | 一=b条= 57.80,c(c)= 149.96 | 3好的(马苏达等。, 2011) | 1.27 | 0.198 | 11.20 | 14.80 | 一=b条= 57.77,c(c)= 150.13 | 4axr公司(西普里亚尼等。, 2012) | 1.38 | 0.078 | 13.44 | 16.56 | 一=b条= 57.98,c(c)= 150.38 | | |
6.结论与展望
我们展示了第一个成功的本地S-SAD结构测定来自真空MX实验。所提供的数据表明,通过减少真空中的背景散射,结合无读出噪声的探测器技术,可以从相对较低多重性的低剂量实验中获得非常高的信噪比。虽然辐射损伤总是一个限制因素,但与空气中的标准波束线设置相比,噪声或背景降低将有助于管理辐射损伤,并允许在相同剂量下获得更多数据。
本研究证明了金刚石光源真空长波长MX光束线I23的概念。所提供的数据是非常早期的束线调试结果。在对采样传输机制进行一些修改后,下一步将是利用这第一个在以下波长范围内优化的完全可调谐MX波束线的独特机会λ=1.2至4.0º。
致谢
我们感谢Wolfgang Kabsch在XDS公司Gerard Bricogne和他在Global Phasing的团队就数据收集策略的实施进行了各种刺激性的讨论,测试了新的XDS公司版本和几何检测器校准帮助。我们感谢Benjamin Luethi(Dectris)和Julien Marchal对探测器项目的支持。萨姆·霍雷尔准备了水晶。钻石光源公司数不清的工程师和技术人员使这项工作成为可能,特别是戴夫·巴特勒和亚当·普雷斯科特。
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