Structural characterization of the N-terminal part of the MERS-CoV nucleocapsid by X-ray diffraction and small-angle X-ray scattering

Papageorgiou, N.; Lichière, J.; Baklouti, A.; Ferron, F.; Sévajol, M.; Canard, B.; Coutard, B.

doi:10.1107/S2059798315024328

研究论文

结构
生物学

国际标准编号：2059-7983

第72卷| 第2部分| 2016年2月| 第192-202页

doi:10.1107/S2059798315024328

MERS-CoV核衣壳N末端的X射线衍射和小角X射线散射结构表征

^一法国马赛CNRS、AFMB UMR 7257、13288和^b法国马赛Aix-Marseille Universityé，AFMB UMR 7257，13288
^*通信电子邮件：nicolas.papageorgiou@afmb.univ-mrs.fr,bruno.coutard@afmb.univ-mrs.fr公司

美国佛罗里达大学R.McKenna编辑(2015年10月5日收到； 2015年12月17日接受； 2016年1月22日在线)

冠状病毒的N蛋白是一种多功能蛋白，被组织成多个结构域。N端部分由一个本质无序区域（IDR）和一个称为N端域（NTD）的结构域组成。在本研究中结构测定MERS-CoV N蛋白N末端区域的通过X射线衍射测量报告的分辨率为2.4º。由于前30个氨基酸未通过X射线衍射进行解析，因此通过SAXS实验完成了结构研究，以提出包含IDR的结构模型。该模型将MERS-CoV的N末端区域作为一个单体，显示出与其他冠状病毒NTD相同的结构特征。

关键词： MERS冠状病毒;核衣壳;结构;SAXS公司;RNA-结合域.

PDB参考：MERS-CoV核衣壳4ud1的N末端结构域

1.简介

中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）是导致中东爆发严重呼吸综合征疾病的病原体，并零星传播至欧洲、非洲、亚洲和美洲。据世界卫生组织2015年12月的报告，自2012年6月沙特阿拉伯发现第一例临床病例以来，已确认1600多例其他病例，死亡率为36%。在人类中，MERS-CoV可导致无症状病毒血症至与器官衰竭相关的严重呼吸窘迫。该病毒的动物来源仍在调查中，但迄今为止已经提出了涉及蝙蝠和/或骆驼的情况（阿扎尔等。, 2014 ; 科尔曼等。, 2014 ; 米勒等。, 2015 ; 拉吉等。, 2014 ).

MERS-CoV是一种阳性RNA病毒，属于Betacorona病毒中的属冠状病毒科家庭病毒目订单。MERS-CoV基因组的5′2/3包含开放阅读框1a和1b，分别翻译为病毒多蛋白pp1a和pp1ab。这两种蛋白质的加工产生16种非结构蛋白，它们参与复制复合体。3′-近端第三个编码病毒结构蛋白和一些辅助蛋白，这些蛋白是从一组亚基因组mRNA翻译而来的。在结构蛋白中，核衣壳（N）蛋白是一种具有多种功能的关键蛋白。事实上，它不仅通过形成核糖核蛋白复合物（RNP）参与基因组包装等。, 2014 )，但它也在复制和转录过程中调节病毒RNA的合成（Chang等。, 2014; 纳尔逊等。, 2000 ; 斯托曼等。, 1988 ; 吴等。, 2014 ). 此外，N蛋白参与细胞周期的放松调节、宿主翻译关闭和先天免疫中断（在McBride中综述等。, 2014 ).

冠状病毒N蛋白是一种>40kDa的蛋白，它被组织成两个主要的折叠结构域，称为N末端结构域（NTD）和C末端结构域，由柔性连接子隔开（图1一). NTD被细分为一个RNA-binding模块，前面是一个固有无序区（IDR）。该IDR有助于NTD的RNA-binding特性（Chang等。，2009年 ). 连接区包含Ser/Arg延伸，其可以对应于磷酸化参与调节N蛋白功能的位点（Chang等。，2009年; 他等。, 2004 ; 彭等。, 2008 ; 苏尔吉特等。, 2005 ; 吴等。，2009年 ). CTD参与N蛋白二聚化和RNA结合（Chen等。, 2007 ; 塔克达等。, 2008 ; 于等。, 2006 ). 紧随其后的是另一个IDR。基于电子显微镜或小角度X射线散射数据，提出的N蛋白组织结构模型表明NTD和CTD可能是相互独立的结构域，彼此之间没有相互作用（Chang等。, 2006 ). 由于全长N蛋白包含大量（>35%）不易结晶的无序区域，因此独立研究每个结构域的结构和功能特征是相关的。

图1
MERS-CoV N蛋白的序列分析。(一)冠状病毒N蛋白的模块化结构。结构域边界对应于MERS-CoV N蛋白编号。IDR，固有无序区；NTD，N端结构域；CTD，C末端结构域。(b)几种N蛋白N末端区域的序列比对，其中NTD的结构已被记录。序列命名如下：病毒首字母缩写词_PDB代码。所示的二级结构是从MERS-CoV NTD中检索到的⁺本研究中描述的结构。使用以下方法获得对齐T-Coffee咖啡（名称等。, 2000

)和电子脚本3.0（Robert&Gouet，2014）

以前已经确定了几种冠状病毒NTD的三维结构：来自严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV；Huang等。, 2004 ; 赛卡通杜等。, 2007 )、传染性支气管炎病毒Beaudette（IBV；Fan等。, 2005 ; 贾亚拉姆等。, 2006 )，小鼠肝炎病毒（MHV；Grossoehme等。，2009年 )和人冠状病毒OC43（HCoV-OC43；Chen等。, 2013 ). MERS-CoV、IBV和SARS-CoV的NTD序列之间的比对显示出37%的序列一致性，而所有报道的冠状病毒NTD结构都被组织为五股反平行链β-片芯畴，具有不同大小的无序环，连接着股线。A带正电荷β-发夹从核心区域突出。结构分析使该区域被认为是可能的RNA结合域。事实上，突变分析和核磁共振研究得出结论，该区域是RNA募集的主要参与者（陈等。, 2013; 克拉克森等。，2009年 ; 格罗索姆等。，2009年; 赛卡通杜等。, 2007; 棕褐色等。, 2006 ). 最近，一种RNA–N相互作用抑制剂已被证明对HCoV-OC43具有抗病毒作用（Lin等。, 2014 ). 因此，冠状病毒N蛋白是抗病毒研究的一个有吸引力的靶点。由于MERS-CoV在全球范围内传播，对医疗保健具有潜在风险，因此积累MERS-CoV蛋白的结构和功能信息以提供抗病毒开发工具非常重要。

在本研究中，我们展示了MERS-CoV NTD及其上游IDR区域（以下简称NTD）的三维结构⁺)通过X射线衍射测量以及对溶液中蛋白质的小角度X射线散射（SAXS）研究获得2.4º的分辨率，以评估齐聚MERS-CoV NTD状态⁺，并提出了NTD的结构模型⁺包括其无序区域。

2.材料和方法

2.1. 蛋白质的生产、纯化和表征

编码N末端区域（氨基酸1–164；NTD）的密码优化DNA⁺)通过GenScript合成了MERS-CoV核衣壳（Betacoronavirus England 1株，登录号KC164505）。在克隆到表达载体pMCOX20A中之前，通过两步PCR扩增DNA序列，以便在NTD的N末端融合可切割的硫氧还蛋白/6×His标签⁺（兰特斯等。, 2011 ). 蛋白质随后在大肠杆菌T7表达（DE3）细胞（新英格兰生物实验室）。在温度为290 K、含0.5 m的TB培养基中诱导表达过夜M（M）当OD为_600纳米培养基的pH值达到0.6。如前所述，在非变性条件下进行蛋白质纯化和标签去除（Lantez等。, 2011). 决赛尺寸排除色谱法（SEC）步骤在10 m内执行M（M）HEPES，300米M（M）氯化钠pH值7.5。通过热位移分析（Geerlof）评估蛋白质折叠和稳定性等。, 2006 )遵循先前描述的协议（Malet等。，2009年 ). MERS-CoV NTD的非特异性RNA结合特性⁺使用Cy3探针在3′端标记的5′-CACAGGCGACAUCAGCG-3′RNA，通过基于荧光偏振的分析进行评估。结合试验在50 m内进行M（M）Tris缓冲液pH 7.5，1 mM（M）DTT，2米M（M）氯化镁₂在50 n时使用Cy3标记的RNAM（M）荧光偏振测量是在一个微板阅读器（PHERAstar FS，BMG Labtech）中进行的，该阅读器带有配备偏振器的光学模块，分别使用546和563 nm的激发和发射波长。

为了确认齐聚在线多角度激光状态分析SEC光散射，吸光度和折射率（MALLS/UV/RI）测量在Alliance 2695 HPLC系统（Waters）上进行，使用硅胶KW802.5柱（Shodex），在10 m内平衡M（M）HEPES，150米M（M）氯化钠pH值7.5。使用三角光散射探测器（miniDAWN TREOS，Wyatt Technology）、准弹性光散射仪器（DynaPro，Wyatt-Technology）和差动折射计（Optilab rEX，Wyatt-Techn技术）进行检测。分子量和流体动力学半径的测定由阿斯特拉诉软件（Wyatt Technology）使用n个/d日c（c）0.185 ml g的值⁻¹.以最终浓度5 mg ml装载蛋白质⁻¹.

2.2. 蛋白质结晶、数据收集和处理

使用纳米滴-悬浮机器人（Mosquito，TTP Labtech）在293K下通过悬挂滴-蒸汽扩散法进行结晶试验。将100 nl蛋白质溶液与25 mg ml混合，获得最佳结晶条件⁻¹100 nl储液罐溶液（0.1M（M）醋酸钠pH值5，2M（M）硫酸铵）。MERS-CoV NTD晶体⁺在110 K的液氮中闪蒸冷却。将甘油作为冷冻保护剂添加到母液中，使其最终浓度达到20%。

在法国格勒诺布尔欧洲同步辐射设施（ESRF）的ID30A-1光束线上，使用Pilatus32M探测器在波长0.965º、温度100K的条件下收集了天然酶的衍射数据。

数据通过以下方式进行整合扩展数据集（卡布施，2010年 )，索引于空间组 C类121（单元-单元参数一= 208.648,b = 67.021,c（c）=60.94，α=β=γ=90），假设最小可接受信噪比等于2，缩放并截断到2.4º的分辨率。这些数据随后用于分子置换具有相位器并由菲尼克斯（亚当斯等。, 2010 ). 分子图谱软件库特（埃姆斯利和考坦，2004年 )用于建模，而奇梅拉（佩特森等。, 2004 )用于可视化和绘制模型。

2.3. 小角度X射线散射（SAXS）测量和数据处理

所有SAXS测量都是在ESRF的束线BM29上以12.5 keV的工作能量进行的，导致散射矢量秒范围为0.025至5 nm⁻¹。使用Pilatus 1M探测器在2.43 m的样本到探测器距离处记录数据。散射矢量秒定义为

$[s={{4\pi}\over{\lambda}}\sin\theta，\eqno（1）]$

哪里λ是以纳米为单位的入射辐射的波长，以及θ是入射和散射辐射之间夹角的一半。

测量了七种蛋白质浓度的范围（0.21、0.41、0.77、1.55、3.06、5.85和11.66 mg ml⁻¹)10米M（M）HEPES pH值7.5300 mM（M）氯化钠。所有样品在15000下离心15分钟克在实验之前，为了最小化聚集粒子的贡献。

测量过程中，将45µl蛋白质样品注入1.8 mm毛细管中，以使辐射损伤最小化；数据收集于277K。

对每个蛋白质浓度进行10次曝光，每次曝光1s，并结合得出每次测量的平均散射曲线。在相同条件下对每个蛋白质样品在测量之前和之后进行缓冲液参考。这个前向散射使用5 mg ml的BSA作为参考校准强度⁻¹.

使用处理数据ATSAS公司包（Petoukhov&Svergun，2007 )根据标准程序。每个蛋白质平均10帧1s，使用普里默斯（科纳列夫等。2003年 ). 排除受辐射损伤影响的帧，并从样本中减去缓冲区背景。

3.结果

3.1. 蛋白质生产和纯化

NTD公司⁺MERS-CoV N蛋白的部分设计基于现有的冠状病毒N蛋白晶体结构（Chen等。, 2007; 风扇等。, 2005; 格罗索姆等。，2009年; 赛卡通杜等。, 2007). 与无序预测相结合的序列比对显示，N末端固有无序区（IDR）起始于位置1，终止于位置36，而结构化RNA结合结构域（RBD）包含氨基酸37-164（图1一). 迄今为止，在去除IDR后，已经获得了不同冠状病毒NTD的晶体结构。在这项研究中，包含氨基酸1到氨基酸164的结构域用于产生NTD⁺MERS-CoV N，因此包括N端IDR。重组野生型（wt）蛋白是在大肠杆菌并被纯化用于结晶、SAXS实验和齐聚研究。重组蛋白的质量通过热转移分析（TSA）和使用非特异性RNA序列的RNA结合分析进行评估。TSA实验揭示了MERS-CoV NTD从折叠状态到展开状态的过渡曲线⁺这表明蛋白质是有结构的。此外，观察到的熔化温度(T型_米)为313K。为了进行比较T型_米MERS-CoV NTD的⁺比SARS-CoV NTD（Fang等。，2009年 ). 使用荧光偏振进行RNA-结合分析，作为额外的质量评估。该蛋白对非特异性RNA的亲和常数在百毫摩尔范围内，具有K（K）_d日共153 nM（M）结果如图2所示(一). 总之，这些结果表明MERS-CoV NTD⁺折叠良好，适合结晶。

图2
MERS-CoV NTD的生物物理特性⁺. (一)RNA与MERS-CoV NTD的结合⁺通过荧光偏振进行评估。3′-Cy5标记的RNA与不同浓度的NTD孵育⁺. (b)NTD的MALLS/UV/折射率测定/SEC分析⁺.右边年轴表示外径_280纳米和左边年轴表示摩尔质量，单位为g/mol⁻¹（Da）。吸收峰显示为一条不连续的线，连续的轨迹表示摩尔质量。报告了峰值顶部对应体积处的测量质量值。

3.2.结构确定通过X射线衍射

分子替换使用IBV NTD（PDB条目）执行（MR）20吨; 风扇等。, 2005). 在中找到了唯一的解决方案空间组 C类121，每个分子5个非对称单元。后续精炼在没有特定问题的情况下收敛到R（右）_工作0.23和R（右）_自由的第0.27页。数据收集和精炼如表1所示。该结构作为PDB入口存放4美元1.

表1
X射线数据采集和精炼统计学

数据收集
波长（Ω）	0.965
分辨率范围（Ω）	48.26–2.48 (2.486–2.480)
“空间”组	C类121
单位-细胞参数（Ω，°）	一= 208.648,b= 67.021,c（c）= 60.94,α=90，β= 89.98,γ= 90
总反射	101472 (9834)
独特的反射	32509 (3088)
多重性	3.2 (3.2)
完整性（%）	98.04 (97.87)
平均值我/σ(我)	5.23 (1.90)
威尔逊B类系数（Ω²)	55.81
R（右）_合并	0.143 (0.6257)
R（右）_测量	0.1708
科科斯群岛_1/2	0.967 (0.831)
抄送*	0.991 (0.953)
精炼
R（右）_工作	0.2281 (0.4445)
R（右）_自由的	0.2738 (0.4771)
非H原子数量
总计	4922
大分子	4839
配体	32
水	51
蛋白质残留量	621
R.m.s.d.，债券（Au）	0.005
R.m.s.d.，角度（°）	0.87
拉马钱德兰支持（%）	98.2
Ramachandran异常值（%）	0
旋转器异常值（%）	0
C类^β异常值（%）	0
冲撞得分	5.08
平均B类因子（蛋白质）²)	64.70
总体摩尔概率分数	1.27

NTD公司⁺区域整体呈球状（完全β)呈现出一个以三个反平行为主要核心的悉尼形表面β-形成中心的线束β-柔性板β-发夹结构挤出。这些功能与柔性线圈回路相互连接。这些线圈的灵活性通过升高的B类因素（总体对局部），也如图3所示其中MERS-CoV NTD⁺结构（PDB条目4美元1，蓝色）与IBV（PDB条目）叠加2亿英镑; 风扇等。, 2005)和SARS-CoV（PDB条目1个磁盘; 黄等。, 2004)NTD结构（分别为绿色和红色）。MERS-CoV-NTD N-末端区域的前30个残基⁺对应于无序区域，无法解析。该区域以前在使用X射线衍射技术获得的所有结构中几乎没有被解析，而在1个磁盘通过核磁共振测量溶液中的结构。

图3
冠状病毒NTD的带状表达。MERS-CoV NTD的叠加⁺结构（蓝色）与IBV（绿色）和SARS-CoV（红色）NTD的结构相同，显示了蛋白质主核心的相对良好叠加以及互连的随机线圈环的高度灵活性。

图4显示了NTD的几个N末端RNA-结合域的静电表面⁺源自密切相关的病毒。表面计算依据APBS公司并从−5 mV（红色）截断到+5 mV（蓝色）。图4(一)和4(b)分别显示蛋白质的前后视图。所有结构的共同特征是带正电荷的发夹（图中朝向顶部）和疏水核心域（图5b). 相比之下，底部的电荷分布存在一些差异，尤其是来自小鼠肝炎病毒和人冠状病毒OC43的蛋白质，与其他结构相比，它们显示出更重要的负电荷区域（Ma等。, 2010 ).

图4
前部(一)和背面(b)从几个源自密切相关病毒的NTD的静电表面视图。SARS-CoV-NTD的结构通过NMR在溶液中测量，而其他结构均通过单晶X射线衍射获得。表面计算依据APBS公司并从−5 mV（红色）截断到+5 mV（蓝色）。

图5
晶体中NTD分子之间相互作用的表示。(一)NTD接口处结构的带状表示⁺MERS-CoV（左侧面板）和IBV的NTD（右侧面板），其中附近分子的Pro33（紫色）与Trp43（红色突出显示）堆叠在一起。(b)中相同结构的表面表示(一)其中疏水残基标记为绿色，其他标记为灰色。

对晶体内分子排列的分析表明，Pro33堆积在附近分子Trp43残基的前面。如图5所示，IBV NTD结构的晶体封装中也发现了相同的堆叠在这些图中，疏水残基（Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Cys、Ala、Tyr、His、Thr、Ser、Gly和Lys）遵循Livingstone和Barton（1993）的分类 )标记为绿色，突出核心结构域的保守疏水倾向。

3.3.齐聚作用化验

蛋白质结晶和RNA结合的SEC制备实验表明，wt-NTD⁺主要以单体形式洗脱。然而，这一结果不足以证明该蛋白不能作为一种瞬时多聚体发挥作用。SEC-MALLS实验表明，观察到的分子量为18 kDa，接近理论分子量（17.8 kDa），证实了SEC结果（图2b). 水动力半径(R（右）_小时)等于1.85±0.45nm。尽管MALLS数据排除了蛋白质从SEC洗脱后形成多聚体的可能性，但也用NTD进行了交联实验⁺结果表明，即使存在戊二醛NTD⁺生产交联多聚体的能力很差（数据未显示）。总之齐聚研究表明NTD⁺MERS-CoV核衣壳在溶液中表现为单体，正如NTD之间的小界面所示⁺晶体中的分子，晶体中观察到的相互作用并不反映溶液中的相互作用。为了表征MERS-CoV NTD的行为⁺以及获取有关NTD N末端部分的结构信息⁺，还进行了SAXS实验。

3.4. 小角度X射线散射（SAXS）测量

3.4.1. 吉尼亚分析

图6显示了范围内的Guinier分析新加坡特别行政区_克<1.3，其中R（右）_克是回转半径以纳米表示(R（右）_克=2 nm）。1.55至11.66 mg ml浓度（conc）对应的数据⁻¹呈现出随浓度增加的非线性。数据表示为开圆圈，而红线表示线性回归。浓度值（mg ml）⁻¹,R（右）_克单位为纳米以及标准化前向散射强度我显示（0）/conc。两者都有R（右）_克和我（0）/conc随着浓度的增加而增加，这是源于分子间吸引力的粒子间干扰项的特征。然而，对于较低浓度的数据（0.2、0.41和0.77 mg ml⁻¹)上述数值稳定在大约R（右）_克=2 nm和我（0）/浓度=26.5。

图6
范围内的吉尼亚分析新加坡特别行政区_克< 1.3 (R（右）_克=2 nm）。实验数据用开放的圆圈表示，而红线表示线性回归。浓度值（conc），R（右）_克单位为纳米以及标准化前向散射强度我显示（0）/conc。两者都有R（右）_克和我（0）/conc随着浓度的增加而增加，这是来自分子间吸引力的粒子间干扰项的特征。

考虑到BSA的校准SAXS曲线，我们估计分子量（MW）为25 kDa，比预期的蛋白质分子量17.8 kDa高约30%。

3.4.2.GNOM公司分析

所有浓度分别由GNOM公司（斯维尔贡，1992年 )使用普里默斯接口。结果如表2所示所有参数都随着浓度的增加而增加，正如吉尼亚分析在低浓度下观察到的那样-秒区域。考虑多孔体积的平均值(V（V）)计算三种较低浓度，〈V（V）〉=27.7纳米^三，我们估计MW范围为13.8<MW<18.4 kDa(V（V）/2<兆瓦<V（V）/1.5），这与蛋白质单体的分子量（17.8 kDa）一致。

表2
第个结果，共个GNOM公司和AUTOPOROD汽车单独分析所有浓度

浓度（mg ml⁻¹)	R（右）_克（纳米）	我（0）/conc	多孔体积（nm^三)	天_最大值（纳米）
0.20	2.04	26.8	27.1	8
0.41	2.06	26.8	28.8	8.5
0.77	2.13	29.5	27	8.5
1.55	2.21	30.7	30.2	8.5
3.06	2.40	32.3	29.7	10.9
5.85	2.65	38	32.7	11.6
11.66	3.01	32.2	36.1	14

考虑到三种较低的浓度GNOM公司分析得出回转半径 R（右）_克2 nm，等于吉尼亚分析结果。比率R（右）_克和R（右）_小时(R（右）_克/R（右）_小时)提供有关蛋白质的形状信息。与水动力半径的比较R（右）_小时MALLS测得的1.85 nm为R（右）_克/R（右）_小时比率为1.08。像往常一样R（右）_克/R（右）_小时球蛋白的值为～0.775，这意味着R（右）_克小于R（右）_小时然而，当分子从球状结构变为非球状或细长结构时R（右）_克/R（右）_小时趋向于0.775以上的值R（右）_克变得大于R（右）_小时.在本例中R（右）_克/R（右）_小时该值可能是由于蛋白质的额外N末端区域（氨基酸1–30）从蛋白质的主要球状结构域中突出，从而偏离球状结构所致，如下所述。

3.4.3.地球观测系统分析（集成优化方法）

初步分析达米夫（Franke&Svergun，2009年 )在所有四种较低的浓度中，分别显示出几乎相同的粒子，这些粒子很好地符合实验数据（数据未显示）。计算出的粒子具有一个球状区域和一个突起（图10b). 结构4美元1上面描述的很适合球状部分。为了建模达米夫我们考虑了一个额外的30氨基酸N末端区域，并使用EOM公司2.0程序（Bernadó等。, 2007 ; 特里亚等。, 2015 ). 创建了具有包含缺失序列的N末端区域的模型PDB结构。两种不同的EOM公司采用的策略是：（i）将N末端区域（氨基酸1-30）建模为一个完全随机区域，（ii）将N端区域划分为三个等长的、跨越氨基酸1-30的完全随机部分。蛋白质的球状部分取自4美元1所有情况下，结构都保持固定。这两种策略对最终模型结构以及相应的R（右）_克，尺寸分布，R（右）_弯曲和R（右）_σ统计数据由EOM公司.

EOM创建了一个包含10000个可能粒子的池R（右）_克以及在图7中红色粗线所示的类高斯分布轮廓上随机分布的尺寸(一). 对于每个特定浓度数据集EOM公司选择包含符合数据的所有可能构象的粒子系综。这个R（右）_克这些信号群的大小分布显示为黑色棒状。图7(b)描述了计算的典型集合模型。具有高R（右）_克（>2.2 nm）和大尺寸（>8 nm）对应于具有空间延伸的N末端区域的分子，而较低的值R（右）_克和大小对应于分子的N末端区域与主核紧密折叠。

图7
EOM公司分析。(一)R（右）_克每种浓度（黑棒）的尺寸分布由EOM公司。池分布显示为红色连续线。(b)几种典型系综模型的叠加EOM公司.

为了能够定量表征尺寸或R（右）_克分配，EOM公司使用两个指标：R（右）_弯曲和R（右）_σ（特里亚等。, 2015). 这个R（右）_弯曲指标以0–100%范围内的百分比给出R（右）_弯曲=100%表示最大灵活性。这个R（右）_σ度量表示集合分布相对于原始池的方差，定义为比率σ_{e（电子）}/σ_对，其中σ_{e（电子）}和σ_对分别是所选集合和池的分布的标准偏差。接近1的值表示一个完全灵活的系统。

在表3中我们报告R（右）_弯曲和R（右）_σ信号群的指标，以及R（右）_柔性工具显示R（右）_弯曲池的度量，作为0.2至3.06 mg ml浓度的函数⁻¹.对于每个浓度R（右）_弯曲总体范围在75%到85%之间R（右）_柔性工具90%和aR（右）_σ在0.99和1.3之间的范围内。这些值表明存在Tria所讨论的重要灵活性等。(2015). 然而，目视检查R（右）_克图7中的尺寸分布显示了以周围为中心的主要群体的存在R（右）_克=2.2±0.2 nm，以及围绕着R（右）_克=1.7±0.2 nm，这对于三种较低的浓度是明显的。这些不同的系综的存在可能表明N末端区域的两种优先构象，可以是开放的也可以是封闭的。

表3
R（右）_弯曲,R（右）_柔性工具和R（右）_σ指标作为浓度的函数，由EOM公司分别针对五种较低浓度

浓度（mg ml⁻¹)	R（右）_弯曲(%)	R（右）_柔性工具(%)	R（右）_σ
0.20	76.8	91.1	0.99
0.41	75.1	90.4	1.30
0.77	78.8	90.5	1.20
1.55	84.7	90.1	0.95
3.06	85.2	89.4	1.32

3.4.4. 合并配置文件的分析

考虑到上述所有分析，五种较低浓度（0.2、0.41、0.77、1.55和3.06 mg ml）下的数据⁻¹)合并以检索具有良好信噪比的单个数据文件。低谷-秒合并文件的区域平均为0.2和0.4 mg ml⁻¹数据，而高-秒区域平均为0.77、1.55和3.06 mg ml⁻¹数据。

对合并数据的全面分析侏儒,达米夫和EOM公司已执行。该分析的详细信息如表4所示.A三维从头算模型是根据合并的SAXS数据使用达米夫(秒范围从0.1到5纳米⁻¹).

表4
SAXS数据收集和散射导出参数

散射和分子质量参数与文中讨论的合并数据剖面有关。

数据收集参数
仪器	BM29、ESRF
探测器	皮拉图斯1M
梁几何形状（mm）	700 × 700
波长（Ω）	0.992
q个范围（nm⁻¹)	0.025–5
暴露时间（s）	1
浓度范围（mg ml⁻¹)	0.2–11.66
温度（°C）	4
结构参数
我（0）/conc来自P（P）(第页)（任意单位）	26.8
我（0）/conc来自Guinier（任意单位）	26.5
R（右）_克从P（P）(第页)（纳米）	2.04
R（右）_克来自Guinier（纳米）	1.95
天_最大值（纳米）	8
多孔体积（nm^三)	27.5
分子量测定
部分比体积†（纳米^三)	21.4
分子质量来自我(0)†（kDa）	24.1
序列的分子质量（kDa）	17.731
使用的软件
主数据缩减	安装2天
数据处理	ATSAS公司
从头算分析	达米夫
验证和平均	达马弗
强度计算	CRYSOL公司
三维图形	奇梅拉

†部分比容取为（1.21×MW）^三每个分子（Harpaz等。, 1994

).
使用5 mg ml浓度下BSA（66 kDa）的校准数据计算分子量⁻¹.

没有使用预定义的形状或对称性。计算了20个不同的模型，然后对其进行平均和过滤镶嵌的（沃尔科夫和斯维尔根，2003年 ). 图8显示的结果是数值拟合GNOM公司,达米夫和EOM公司分析。这个GNOM公司拟合曲线完全叠加在达米夫拟合曲线由红色连续线显示，而EOM公司拟合曲线由蓝色实线和合并的数据（空心圆）一起显示。错误信号，红点GNOM公司和达米夫和蓝色圆点EOM公司，如图底部所示，几乎与空间经济重叠。

图8
GNOM公司,达米夫和地球观测系统适合。这个GNOM公司配合完全叠加在达米夫红色连续线显示的拟合，而EOM公司拟合由蓝色的连续线和合并的数据（开圆圈）显示。错误信号，红点GNOM公司和达米夫和蓝色圆点EOM公司，显示在图的底部，它们几乎被叠加在一起用于空间经济。

图9(一)显示了P（P）(第页)合并数据的分发天_最大值=8纳米。图9(b)显示了Kratky图合并数据的特征是高电平信号增加-秒区域（>2.5 nm⁻¹)，可能是由于灵活的N末端区域。

图9
距离分布和Kratky图。(一)距离分布P（P）(第页)合并数据的天_最大值=8纳米。(b)Kratky图显示高电平信号特征增加的合并数据-秒区域（大于2.5 nm⁻¹)由于分子的部分无序。

在图10中(一)我们展示了由EOM公司合并数据的分析以及相应的R（右）_克和尺寸分布地球观测系统（图10b). 每个集合对测量的SAXS剖面的贡献显示为每个集合结构下的百分比。

图10
EOM公司合并数据集的分析。(一)三种集成模型结构由EOM公司分析合并数据以及相应的存在百分比。(b)R（右）_克以及合并数据的大小分布。(c（c）)过滤后三个结构的拟合达马弗微粒。

相应的指标R（右）_弯曲= 84% (R（右）_柔性工具=91%）和R（右）_σ=1.12对应于主要灵活的N末端区域，而尺寸和R（右）_克分布如图10所示(b)为两个不同的种群（大约R（右）_克=2.2 nm和R（右）_克=1.6 nm），根据之前对每个浓度的计算。根据EOM公司分析中，我们可以强调存在一个灵活的N末端区域，同时存在分子的两种构象：开放构象和闭合构象。在所有情况下，前20个氨基酸形成一个环，而不是随机展开。

三种系综模型结构由EOM公司在过滤颗粒内拟合，计算公式为达马弗如图10所示(c（c）). 粒子的突起部分主要对应于开放构象，N末端区域从球状部分指向外面。

4.讨论和结论

MERS NTD公司⁺尽管序列预测显示存在从氨基酸1到氨基酸37的无序N末端区域，但包含的氨基酸1–164仍结晶。试图结晶NTD域（从位置37到164）并没有从商业屏幕上得到合适的晶体。值得注意的是，在撰写本研究期间，已发表了包含氨基酸39–165的NTD区域的初步晶体学分析（Wang等。, 2015 ).

因此，我们的结构研究侧重于NTD⁺域，它可以通过组合晶体结构和SAXS分析。有趣的是非对称单元晶体由五个NTD组成⁺相邻分子的Pro33和Trp43之间相互作用形成的分子（图5). 这种相互作用突出了内在无序区（IDR）在晶体组织中的作用，并说明了需要为给定的感兴趣域设计几个结构体，以提高蛋白质表达或结晶水平的成功率（Bignon等。, 2013 ; 格拉斯隆德等。, 2008 ).

尽管在大小和顺序上有所不同，但迄今为止已确定其结构的NTD与中央的β-表和aβ-发夹延伸。正如预期的那样，MERS-CoV NTD的三维结构⁺显示相同的结构组织。它β-延伸带正电荷（图4)在几种冠状病毒中，它被认为通过与RNA的磷酸二酯基团（Fan等。, 2005). 除了这些相互作用外，保守的疏水核心结构域还可以通过几个芳香残基（Huang等。, 2004; 麦克布莱德等。, 2014; Spencer&Hiscox，2006年 ). 有趣的是，在晶体结构MERS-CoV NTD的⁺发现位于核心结构域的Trp43与相邻NTD的脯氨酸（Pro33）堆叠⁺，如IBV NTD（黄）的晶体包装等。, 2004).

因此，我们想评估齐聚MERS-CoV NTD状态⁺SEC-MALLS分析和SAXS数据表明，至少在我们的实验条件下（pH 7.5），MERS NTD⁺在溶液中主要表现为单体。如前所述齐聚MHV N蛋白的表达部分由NTD模块（Hurst等。，2009年 ). 此外，IBV N蛋白的NTD也具有较弱的二聚化倾向（Fan等。, 2005; 贾亚拉姆等。, 2006). 因此，我们可以建议MERS-CoV NTD自己⁺虽然不能促进MERS-CoV N蛋白的组装，但在CTD促进寡聚化后，可能通过NTD-NTD相互作用形成RNP的机制仍有待阐明。

Trp43在RNA结合中的作用也得到了解决。MERS冠状病毒NTD⁺与百毫摩尔范围内的非特异性RNA结合，W43A取代并没有显著改变亲和常数（数据未显示）。对MHV NTD的RNA结合研究表明，芳香族残基位于β3和β5是序列特异性RNA结合的强大决定因素（格罗索姆等。，2009年)，而Trp43位于β1股。然而，NMR对RNA与SARS-CoV NTD结合的分析表明，即使是聚腺嘌呤RNA，核心区域仍参与结合（Huang等。, 2004). 因此，Trp43可能参与RNA结合，但不作为主要贡献者，其单一替代不允许干扰功能。在这一阶段，β冠状病毒保守残基Trp43的作用仍有待研究。

SAXS实验用于表征MERS-CoV NTD⁺溶液中。SAXS结果表明，该蛋白是单体的，由球状部分和30个残基的柔性N末端区域组成。这个区域并不是完全无序的，但从球状部分指出有两种优先构象：开放构象和闭合构象。在所有情况下，前20个氨基酸形成一个环，而不是随机展开。让我们回顾一下，这个N末端参与RNA结合，与N蛋白的其他RNA结合位点协同工作（Chang等。，2009年). 然而，它也可能发挥其他作用，因为病毒IDR往往参与与宿主细胞成分（RNA除外）的各种相互作用，如宿主膜或蛋白质（Xue等。, 2014 ).

支持信息

3D视图

PDB参考：MERS-CoV核衣壳4ud1的N末端结构域

致谢

这项工作得到了欧盟第七框架的银大规模合作项目（赠款协议编号260644）和法国综合结构生物学基础设施（FRISBI）ANR-10-INSB-05-01的支持。作者还感谢ESRF提供同步加速器束时间，感谢MASSIF和BM29的工作人员收集数据，以及Stéphanie Blangy和Silvia Spinelli对实验的贡献。

工具书类

P.D.亚当斯。等。(2010).《水晶学报》。天66, 213–221. 科学网交叉参考计算机辅助系统 IUCr日志谷歌学者
 Azhar，E.I.，Hashem，A.M.，El-Kafrawy，S.A.，Sohrab，S.S.，Aburizaiza，A.S.，Farraj，S.A.，Hassan，A.M.，Al-Saeed，M.S.、Jamjoom，G.A.和Madani，T.A.（2014）。MBio公司,5，e01450-14交叉参考公共医学谷歌学者
 Bernadó，P.、Mylonas，E.、Petoukhov，M.V.、Blackledge，M.和Svergun，D.I.（2007年）。美国化学杂志。Soc公司。 129, 5656–5664. 科学网公共医学谷歌学者
 Bignon，C.、Li，C.、Richière，J.、Canard，B.和Coutard，B.（2013年）。《水晶学报》。天69, 2580–2582. 交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Chang，C.-K，Hou，M.-H，Chang，C.-F，Hsiao，C.-D&Huang，T.-H（2014）。抗病毒研究。 103, 39–50. 科学网交叉参考计算机辅助系统公共医学谷歌学者
 Chang，C.-K.，Hsu，Y.-L.，Chang，Y.-H.，Chao，F.-A.，Wu，M.-C.，Huang。J.维罗尔。 83, 2255–2264. 科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Chang，C.-K.，Sue，S.-C.，Yu，T.-H.，Hsieh，C.-M.，Tsai，C.-K，Chiang，Y.-C.，Lee，S.-J.，Xiao，H.-H.，W.-J.、Chang，W.-L.、Lin，C.-H.和Huang，T.-H（2006）。J.生物识别。科学。 13, 59–72. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Chen，C.-Y.，Chang，C.-K.，Channg，Y.-W.，Sue，S.-C.，Bai，H.-I.，Riang，L.，Shoiao，C.-D.和Huang，T.-H.（2007）。分子生物学杂志。 368，1075–1086交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Chen，I.-J.、Yun，J.-M.P.、Chang，Y.-M.、Lin，S.-Y.、Zhao，J.、Perlman，S.、Shen，Y.-Y.，Huang，T.-H.和Hou，M.-H.（2013）。生物化学。生物物理学。学报,1834, 1054–1062. 科学网交叉参考计算机辅助系统公共医学谷歌学者
 Clarkson，M.W.，Lei，M.，Eisenmesser，E.Z.，Labeikovsky，W.，Redfield，A.&Kern，D.（2009）。《生物分子杂志》。核磁共振,45, 217–225. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Corman，V.M.、Ithete，N.L.、Richards，L.R.、Schoeman，M.C.、Preiser，W.、Drosten，C.和Drexler，J.F.（2014）。J.维罗尔。 88, 11297–11303. 科学网交叉参考计算机辅助系统公共医学谷歌学者
 Emsley，P.&Cowtan，K.（2004）。《水晶学报》。天60, 2126–2132. 科学网交叉参考计算机辅助系统 IUCr日志谷歌学者
 Fan，H.、Ooi，A.、Tan，Y.W.、Wang，S.、Fang，S..、Liu，D.X.和Lescar，J.（2005）。结构,13, 1859–1868. 科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Fang，H.-J.，Chen，Y.-Z.，Li，M.S.，Wu，M.-C.，Chang，C.-L.，Chang.，C.-K.，Hsu，Y.-L.，Huang，T.-H.，Chen。生物物理学。J。 96, 1892–1901. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Franke，D.和Svergun，D.I.（2009年）。J.应用。克里斯特。 42, 342–346. 科学网交叉参考计算机辅助系统 IUCr日志谷歌学者
 A.吉尔洛夫。等。(2006).《水晶学报》。天62，1125-1136科学网交叉参考计算机辅助系统 IUCr日志谷歌学者
 Gräslund，S.、Sagemark，J.、Berglund，H.、Dahlgren，L.G.、Flores，A.、Hammarström，m.、Johansson，I.、Kotenyova，T.、Nilsson，m.，Nordlund，P.和Weigelt，J.（2008）。蛋白质实验。净化。 58, 210–221. 科学网公共医学谷歌学者
 Grossoehme，N.E.、Li，L.、Keane，S.C.、Liu，P.、Dann，C.E.、Leibowitz，J.L.和Giedroc，D.P.（2009年）。分子生物学杂志。 394, 544–557. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Harpaz，Y.、Gerstein，M.和Chothia，C.（1994年）。结构,2, 641–649. 交叉参考计算机辅助系统公共医学科学网谷歌学者
 他、R。等。(2004).病毒研究。 105, 121–125. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Huang，Q.，Yu，L.，Petros，A.M.，Gunasekera，A.，Liu，Z.，Xu，N.，Hajduk，P.，Mack，J.，Fesik，S.W.和Olejniczak，E.T.（2004）。生物化学,43, 6059–6063. 科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Hurst，K.R.、Koetzner，C.A.和Masters，P.S.（2009年）。J.维罗尔。 83, 7221–7234. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 贾亚拉姆·H、范·H、鲍曼·B·R、乌伊·A、贾亚拉姆·J、科里森·E·W、莱斯卡·J·和普拉萨德·B·V（2006）。J.维罗尔。 80, 6612–6620. 科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Kabsch，W.（2010年）。《水晶学报》。天66, 125–132. 科学网交叉参考计算机辅助系统 IUCr日志谷歌学者
 Konarev，P.V.、Volkov，V.V.、Sokolova，A.V.、Koch，M.H.J.和Svergun，D.I.（2003）。J.应用。克里斯特。 36, 1277–1282. 科学网交叉参考计算机辅助系统 IUCr日志谷歌学者
 Lantez，V.、Dalle，K.、Charrel，R.、Baronti，C.、Canard，B.和Coutard，B.（2011年）。公共科学图书馆-负面。特罗普。数字化信息系统。 5，第936页科学网交叉参考公共医学谷歌学者
 Lin，S.-Y.，Liu，C.-L.，Chang，Y.-M.，Zhao，J.，Perlman，S.&Hou，M.-H.（2014）。医学化学杂志。 57, 2247–2257. 科学网交叉参考计算机辅助系统公共医学谷歌学者
 Livingstone，C.D.&Barton，G.J.（1993）。计算。申请。Biosci公司。 9, 745–756. 计算机辅助系统公共医学科学网谷歌学者
 Ma，Y.、Tong，X.、Xu，X.，Li，X.和Lou，Z.&Rao，Z.（2010）。蛋白质细胞,1, 688–697. 科学网交叉参考计算机辅助系统公共医学谷歌学者
 Malet，H.、Coutard，B.、Jamal，S.、Dutartre，H.、Papageorgiou，N.、Neuvonen，M.、Ahola，T.、Forrester，N.、Gould，E.A.、Lafitte，D.、Ferron，F.、Lescar，J.、Gorbalenya，A.E.、de Lamballerie，X.和Canard，B.（2009年）。J.维罗尔。 83, 6534–6545. 科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 McBride，R.、van Zyl，M.和Fielding，B.C.（2014）。病毒,6, 2991–3018. 交叉参考公共医学谷歌学者
 米勒，硕士。等。(2015).柳叶刀感染。数字化信息系统。 15, 559–564. 公共医学谷歌学者
 Nelson，G.W.、Stohlman，S.A.和Tahara，S.M.（2000）。《病毒遗传学杂志》。 81，181–188科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Notredame，C.、Higgins，D.G.和Heringa，J.（2000）。分子生物学杂志。 302, 205–217. 科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Peng，T.-Y.，Lee，K.-R.&Tarn，W.-Y.（2008）。FEBS J公司。 275, 4152–4163. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Petoukhov，M.V.和Svergun，D.I.（2007）。货币。操作。结构。生物。 17, 562–571. 科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Pettersen，E.F.、Goddard，T.D.、Huang，C.C.、Couch，G.S.、Greenblatt，D.M.、Meng，E.C.和Ferrin，T.E.（2004）。J.计算。化学。 25, 1605–1612. 科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 拉吉，V.S。等。(2014).突发感染。数字化信息系统。 20，1339–1342交叉参考公共医学谷歌学者
 Robert，X.和Gouet，P.（2014）。核酸研究。 42，W320–W324科学网交叉参考计算机辅助系统公共医学谷歌学者
 Saikatendu，K.S.、Joseph，J.S.、Subramanian，V.、Neuman，B.W.、Buchmeier，M.J.、Stevens，R.C.和Kuhn，P.（2007）。J.维罗尔。 81, 3913–3921. 科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Spencer，K.A.和Hiscox，J.A.（2006年）。FEBS信函。 580, 5993–5998. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Stohlman，S.A.、Baric，R.S.、Nelson，G.N.、Soe，L.H.、Welter，L.M.和Deans，R.J.（1988）。J.维罗尔。 62, 4288–4295. 计算机辅助系统公共医学谷歌学者
 Surjit，M.、Kumar，R.、Mishra，R.N.、Reddy，M.K.、Chow，V.T.K.和Lal，S.K.（2005）。J.维罗尔。 79, 11476–11486. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Svergun，D.I.（1992）。J.应用。克里斯特。 25，495–503交叉参考科学网 IUCr日志谷歌学者
 Takeda，M.、Chang，C.-K.、Ikeya，T.、Güntert，P.、Change，Y.-H.、Hsu，Y.-L.、Huang，T.-H.和Kainosho，M.（2008）。分子生物学杂志。 380, 608–622. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Tan，Y.W.、Fang，S.、Fan，H.、Lescar，J.和Liu，D.X.（2006）。核酸研究。 34, 4816–4825. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Tria，G.、Mertens，H.D.T.、Kachala，M.和Svergun，D.I.（2015）。国际癌症研究所,2, 207–217. 科学网交叉参考计算机辅助系统公共医学 IUCr日志谷歌学者
 Volkov，V.V.和Svergun，D.I.（2003）。J.应用。克里斯特。 36, 860–864. 科学网交叉参考计算机辅助系统 IUCr日志谷歌学者
 Wang，Y.S.，Chang，C.和Hou，M.-H.（2015）。《水晶学报》。F类71, 977–980. 交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Wu，C.-H.，Chen，P.-J.&Yeh，S.-H.（2014）。宿主与微生物,16, 462–472. 交叉参考计算机辅助系统公共医学谷歌学者
 Wu，C.-H，Yeh，S.-H，Tsay，Y.-G，Shieh，Y.-H，Kao，C.-L.，Chen，Y.-S.，Wang，S.-H，Kuo，T.-J，Chen，D.-S.和Chen，P.-J（2009）。生物学杂志。化学。 284, 5229–5239. 交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者
 Xue，B.、Blocquel，D.、Habchi，J.、Uversky，A.V.、Kurgan，L.、Uversky，V.N.和Longhi，S.（2014）。化学。版次。 114, 6880–6911. 交叉参考计算机辅助系统公共医学谷歌学者
 Yu，I.-M.，Oldham，M.L.，Zhang，J.和Chen，J.（2006）。生物学杂志。化学。 281, 17134–17139. 科学网交叉参考公共医学计算机辅助系统谷歌学者