1.简介

随着结构生物学家处理越来越具挑战性的系统，开发高效的方法来为X射线衍射研究提供大量晶体变得越来越重要。难以结晶的蛋白质通常只会产生小的晶体，在受到辐射照射的破坏性影响之前，只能产生几度衍射数据。对于许多系统来说，通过使用微焦点同步加速器光束以及从多个晶体收集和组合数据，可以使用非常小的晶体获得高分辨率的完整数据集。例如，在求解β₂肾上腺素能受体-Gs蛋白复合物，筛选了数百个微晶，在最终数据集中使用了20个微晶（拉斯穆森等。, 2011). 通过飞秒结晶学（FX）的应用，可以扩展从小型或辐射敏感晶体获得的结构信息，这是一种利用X射线自由电子激光器（XFEL）产生的极亮、短时间尺度X射线脉冲的新兴方法。这种方法利用了“破坏前衍射”现象（Neutze等。2000年)在晶体中发生明显的辐射诱导电子和原子重排之前，一个X射线脉冲会产生一个静止的衍射图案（巴蒂等。, 2011; 伦布等。, 2011). 由于每次发射后，暴露在X射线脉冲下的晶体区域都会被完全破坏，因此这些实验需要多个晶体（查普曼等。, 2011). 此外，FX提供了一种确定辐射敏感金属酶催化精确结构的方法（Kern等。，2013年)在同步加速器中金属中心的光还原后可能会发生结构重排（彼得斯等。, 1998; 亚诺等。, 2005; 科贝特等。, 2007; 梅哈伦纳等。, 2010; 戴维斯等。，2013年). 在大多数情况下，这些实验还需要大量晶体，因为晶体的每个区域只能暴露一次。

高通量结晶（横山等。2000年; 布伦德尔等。, 2002; 布劳恩等。, 2002; 艾拉妮丝·莫莉塞特等。, 2004; 锂等。, 2012)以及在同步辐射光源（Snell）上实现自动采样安装系统等。, 2004; 软木塞等。, 2006; Smith&Cohen，2008年; 科恩等。, 2014)使从多个晶体中收集数据变得容易；然而，挑战仍然存在。使用自动安装系统进行样品交换的过程可能需要35秒到几分钟的时间，其中包括安装晶体、将晶体定心以进行数据采集和拆卸晶体。虽然此时间刻度可能适用于需要筛选最多数百个晶体的实验，但更高效的方法对于在XFEL源进行更具挑战性的实验至关重要，因为XFEL源的时间有限且要求很高。此外，采集晶体以收集数据可能是另一个耗时的步骤。正在开发晶体操作机器人来自动化这个过程（海达里·卡杰波尔等。，2013年; 东等。, 2014)；然而，晶体的采集仍然主要是手工进行的。

样品注射器通过将液体喷射器中的大量晶体直接送入一系列X射线脉冲（DePonte等。, 2008; 巴蒂等。, 2011; 伦布等。, 2011; 查普曼等。, 2011; 齿状山脊等。, 2012; 布泰等。, 2012; 约翰逊等。, 2012; 科恩等。, 2012，2013年, 2014; 雷德克等。，2013年; 线路接口单元等。，2013年; Barends酒吧等。, 2014). 然而，大多数液体喷射器实验需要大量晶体。此外，输送过程中可能会出现并发症：溶液可能会起泡、冻结或干燥，并破坏从注射器流出的水流的形成，晶体可能会被注射过程的剪切力损坏（史蒂文森等。, 2014). 与许多注射器实验兼容的晶体的最大尺寸是有限的，通常必须提前过滤晶体悬浮液，以去除大于约5µm的晶体。此外，由于晶体不是低温储存的，样品降解可能会妨碍实验用晶体的提前制备和储存。

高效样品输送和衍射质量筛选的另一种方法是使用高密度样品容器，在已知位置放置晶体，并使用高速样品测角仪快速定位样品。用于室温数据采集的高密度样品安装容器示例包括微流控芯片和微晶陷阱（Dhouib等。, 2009; 基塞尔曼等。, 2011; 平克等。，2013年; 柳比莫夫等。, 2015; 勒迪格等。, 2015).

在这里，我们描述了一种简单、廉价的高密度样品安装网格，它能够从大量只能承受少量X射线照射的晶体中高效地自动收集数据。之前已经描述过在线性相干光源（LCLS）XFEL使用肌红蛋白晶体使用这些网格收集完整的无辐射损伤数据集（Cohen等。, 2014). 简言之，六边形(P（P）6） 肌红蛋白晶体手动安装在栅极端口中，并在LCLS X射线泵探头（LCLS-XPP）仪器上进行闪蒸冷却以收集数据。为了解决网格内晶体优先取向的潜在问题，收集了网格面与光束成不同角度的数据。总的来说，从32个网格中的932个晶体中收集了数据，最终数据集中包括739张静态图像，完成率超过90%，分辨率达到1.36º（科恩等。, 2014). 在本文中，我们概述了斯坦福同步辐射光源（SSRL）开发的网格数据收集支持软件例程，以及扩展网格实用性以适应低温和室温下广泛实验策略的其他工具。为了说明所涉及的技术，我们详细介绍了在LCLS-XPP上使用液控机器人在网格上生长晶体或将晶体加载到网格上进行衍射质量筛选实验的实验。

2.样品安装网格

网格脚手架由一块100或200µm厚的聚碳酸酯塑料组成，带有激光切割成排的孔（或端口）。这种聚碳酸酯支架固定在标准磁性底座上，以生产“网格组件”（图1一). 使用一个专用的粘接夹具将聚碳酸酯支架固定在磁性底座内，作为环氧树脂组（图1b条). 网格端口可以在已知位置容纳大晶体或小晶体组。当前的网格布局有75个端口，直径分别为400、200和125µm（图1d日)；然而，可以改变端口的大小和布局，以更好地适应不同的实验设置。由于晶体被固定在已知位置，因此可以快速准确地将晶体自动定位到X射线束路径中。

图1 (一)样品安装网格用环氧树脂固定在标准磁性底座上。这使得它们可以通过自动安装系统进行操作。为了进行比较，还显示了一个汉普顿研究型铜磁性样品针。(b条)环氧树脂固化时，使用夹具将格栅固定到位。该夹具由两部分组成：一个是由标准单脚吊杆制成的底座，另一个是用铝加工而成的专用盖。盖子上的导孔将网格垂直固定在环氧树脂上。(c（c）)内有两个网格（白色）的单吸盘外壳（棕色）的剖视图。(d日)基准端口用红色突出显示的样品安装网格示意图。单位为毫米。

格栅的外部尺寸是能够可靠地安装在SSRL盒式磁带或单袋式存储容器端口内的最大区域（图1c（c）). 网格的使用将磁带容量从96个扩展到7200多个样本位置（假设每个环路/端口一个晶体）。样品安装网格能够从大量晶体中高效自动采集数据，这些晶体在数据采集过程中只能承受少量X射线照射或较小的旋转范围（科恩等。, 2014). 格栅的一面可以附加一层聚合物薄膜，以更好地将样品固定在端口内，或用作坐滴或悬滴结晶实验的支架（补充图S1）。所使用的5µm厚聚碳酸酯薄膜具有最小的X射线吸收和低X射线散射背景。

3.手动装晶

网格可以手动填充晶体。为了在这个过程中观察晶体，使用磁性支架将网格组件放置在显微镜下很有帮助（补充图S2）。栅极端口应预先填充防冻油，如Paratone-N或石蜡，以防止晶体脱水。可以使用细针将油涂在每个栅极端口上。可以使用低温封隔器作为工具，从结晶托盘中取出晶体，在晶体上涂上一层薄薄的油，然后将其转移到适当大小的栅极端口。将低温封隔工具的大小与栅极中的端口大小相匹配是有帮助的。在网格中填充所有端口可能是不切实际的，因为晶体可能会随着时间在低温保护剂油中降解。有必要进行测试，以确定用特定样品和油填充格栅的最长时间。这可以通过在网格中填充晶体并记录每个端口的加载时间来完成。然后可以收集衍射数据并比较已知暴露于油中时间的晶体。有关网格使用的详细说明，请参阅https://smb.slac.stanford.edu/hardware/sample_mounting_grids/.

4.液体搬运机器人的网格适配器

在格栅的一面添加一层聚合物薄膜，为结晶实验创造了一个支架。为了用结晶溶液填充网格，开发了一种适配器，将网格固定在液体搬运机器人的目标板位置（图2一). 一个氯丁橡胶衬里的扭力夹抓住格栅组件的磁性底座并将其固定到位。网格相对于两个金属表面进行索引，以确保精确的可再现跌落放置（图2b条). 该适配器已通过Labcyte Echo 550成功测试（图2c（c）)、Art Robbins Gryphon（补充视频S1）和TTP Labtech Mosquito（补充视频S2）。样品放置在网格上后，网格可以在专门的晶体生长容器中培养，该容器支持悬滴或坐滴实验和脂质立方相（LCP）结晶实验。液体搬运机器人也可用于将晶体悬浮物装载到格栅上。

图2 一种用于液体处理机器人的网格适配器。(一)具有标准微孔板足迹的网格适配器允许网格定位在液体搬运机器人的板位置，包括ARI Gryphon和Labcyte Echo 550液体搬运器。一个氯丁橡胶衬里的扭力夹（黑色）抓住磁性底座并将格栅固定到位。(b条)格栅相对于适配器突出的两个金属表面进行分度，以确保端口正确定位。(c（c）)一张网格适配器的照片，它将网格固定在Labcyte Echo 550液体搬运机器人的目标板位置。

5.格栅式蒸汽扩散室

开发了一种栅格蒸汽扩散室，用于在受控环境中保持栅格，以培养坐滴或悬滴结晶实验（图3一). 室盖上透明X-seal结晶支架，以便用显微镜监测晶体生长。使用带有真空润滑脂薄膜的硅O型环，以确保网格脚手架周围的密封紧密（图3b条). 腔室底部的一口井可在格栅下方容纳高达350µl的干燥剂。

图3 (一)在蒸汽扩散室内孵化的网格。溶菌酶晶体在网格上呈点滴状生长(b条)栅格蒸汽扩散室的展开图。含有栅格（白色）的样品被放置在结晶室中，而磁性底座（银）则位于外部切口中。X-seal结晶支架拧入结晶板以关闭腔室。干燥剂可保持在室内格栅下方。硅胶O型环（红色）在格栅周围形成紧密密封(c（c）)坐在格子上的水滴在蒸汽扩散室内孵化。将一薄层聚碳酸酯粘贴到格栅的一面，并将沉淀剂中的溶菌酶溶液分配到格栅背衬上，与格栅端口对齐。坐液中可以看到溶菌酶晶体生长。

6.格栅LCP托盘

LCP结晶实验也可以使用专用托盘在网格上进行，无需切开玻璃夹心板并手动采集晶体进行数据采集。格栅LCP托盘组件由两个硅化玻璃载玻片、1 mm厚的双面胶带和一个带有磁性底座和玻璃载玻片支架的托盘组成。格栅夹在两片玻璃之间，并被沉淀剂包围（图4一). 为了便于拆卸，可以在格栅顶部和顶部玻璃板下方放置一层薄聚碳酸酯板。

图4 (一)LCP网格托盘的展开视图。含有样品（蓝色）的网格（白色）夹在两片玻璃（透明蓝色）之间，网格周围有沉淀剂。带有网格切口部分的1 mm厚双面胶带（白色）用于将两片玻璃固定在一起，并为沉淀剂形成屏障。该组件位于托盘（棕色）中，托盘上有玻璃三明治和磁性底座（银色）的支撑切口。(b条)LCP实验在玻璃三明治内的网格上进行。可以看到溶菌酶晶体生长在充满蛋白质–LCP混合物的网格端口中。

7.LCLS的数据收集

格栅与LCLS-XPP仪器上安装的基于测角仪的仪器结合使用（Cohen等。, 2014)用于XFEL衍射实验。在这些实验中，斯坦福自动贴片机（SAM）机器人（科恩等。, 2002)用于将网格内的晶体安装到测角仪上。为了控制这些实验，在蓝色-Ice/DCSS公司实验控制软件（McPhillips等。, 2002; 科恩等。, 2014). 为了定义所有网格端口相对于X射线束位置的位置，半自动对准过程利用了激光切割网格端口的预定义空间布置。该过程首先通过旋转网格直到其在软件视频显示器中处于边缘打开状态来定义网格边缘的位置，然后点击网格的视频图像以将网格边缘移动到X射线束位置。如果栅格在此视图中倾斜，则可以确定两个位置来定义平移路径。接下来，将栅格旋转90°，以在视频图像中显示栅格的正面视图。然后按指定顺序单击网格外角上的四个端口，它们作为基准标记来定义端口位置和网格旋转（补充图S3；图1d日). 该程序将所有栅格端口校准至测角仪的坐标系和波束互作用区域。

对于与每个网格端口大小密切匹配的晶体，可以自动进行数据采集；每个端口自动居中于X射线相互作用区域并曝光。或者，可以暂停自动数据采集，并使用手动“单击并拍摄”程序选择端口的不同区域进行曝光。也可以在栅极端口内的较长晶体上进行螺旋数据采集（科恩等。, 2014). 指定哪些网格端口包含晶体的电子表格可以提前上传，以便在数据采集期间自动跳过空端口`通过将晶体暴露在120 Hz的衰减X射线脉冲下，同时以1°s的恒定速度旋转栅格，可以收集振荡图像⁻¹在1°以上收集的振荡图像由120个重叠的静止衍射图案组成（科恩等。, 2014).

如果端口内存在一组小晶体，则可以在整个栅极端口或端口内的较小区域上进行光栅扫描。光栅扫描通常在低剂量辐射的同步加速器上进行，以定位晶体（Song等。, 2007; 切列佐夫等。, 2009). 然而，在LCLS，光栅是在全剂量辐射下进行的，以从网格端口中的多个晶体收集数据，或从单个晶体上的多个位置收集数据。通过使用下拉菜单选择端口，可以自动对整个网格端口进行光栅化，并自动定义合适的圆形区域（补充图S4一)，或者可以通过在软件显示中定义多边形的边缘来对包含晶体的较小区域进行光栅化（补充图S4b条).

8.同步加速器的数据采集

SSRL高分子晶体学光束线也支持网格数据采集，网格数据采集选项卡已添加到蓝冰/DCSS公司实验控制软件（McPhillips等。, 2002). 与LCLS的数据采集类似，对每个网格执行半自动对准程序，然后可以继续进行数据采集。LCLS支持的类似自动数据采集选项也适用于SSRL（补充图S3），增加了在每个晶体位置和X射线光栅期间采集振荡数据的选项。这种自动化可以进一步纳入自动化工作流程（Tsai等。，2013年)其中，低剂量X射线光栅可用于在网格端口内定位晶体，以实现自动化多晶体数据收集策略。

网格对于同步加速器的微晶/微束数据收集是最佳的，因为微晶往往在数据收集几度后就会受到严重的辐射损伤（Rasmussen等。, 2011). 网格的最佳方向是使表面与X射线束正交。当晶体具有首选定向在网格端口内，可以采取更具战略性的方法，通过改变每次曝光的网格角度来实现完整性。在大多数情况下，在产生的衍射与聚碳酸酯支架相互作用之前，格栅可以从初始位置旋转±20°或更多。然而，对于网格端口内的晶体，当晶体位于端口边缘时，必须注意避免直接X射线束的相互作用以及与聚碳酸酯支架产生的衍射。为了避免后一种影响，使用粘贴在网格一个面上的薄（～5µm）聚合物板，可以使沉积在板表面上的结晶液滴朝向检测器，从而使衍射远离网格支架（补充图S1）。

9.使用网格收集室温数据

栅极端口可以覆盖一层聚合物薄膜，以防止蒸发，从而进行室温数据采集。该方法用于LCLS-XPP上光敏光系统II（PSII）晶体的室温屏蔽。聚碳酸酯背衬用环氧树脂粘在格栅的一面。PSII晶体悬浮液通过管道输送到开放的栅极端口上，并使用回路将晶体拖曳到栅极端口中（图5一). 第二片聚碳酸酯被放置在开放的网格端口上，并通过毛细管作用固定到位（图5b条). 然后将网格手动安装在测角仪上，用于XPP的数据采集。为了避免光敏PSII晶体暴露在环境光下，数据采集是在黑暗中进行的。晶体比栅极端口小得多（约20–30µm），在低光条件下很难可视化。因此，通过光栅化单个400µm端口来收集数据。在第一轮实验中，共从三个网格收集了500张图像。在优化晶体悬浮条件和数据收集参数后，在18分钟内从单个网格收集280张图像，观察到最小蒸发。在这组图像中，87张图像包含衍射数据，观察到最佳衍射分辨率高于2.5º（图5c（c）).

图5 网格中的光系统II晶体的室温实验。(一)栅格端口中的光系统II晶体悬浮液。将聚碳酸酯背衬应用于栅格的一面，为晶体悬浮液创造一个空间。然后将光系统II的晶体悬浮液通过管道输送到开放的栅格端口上。(b条)示意图横截面为室温实验准备的栅极端口。在用晶体填充栅格端口之后，可以将第二片聚碳酸酯背衬施加到栅格以密封栅格端口并保护晶体不脱水。(c（c）)在室温下使用栅格架在LCLS-XPP上记录的PSII晶体的衍射图像。分辨率由圆环表示，各个衍射点以相应的分辨率高亮显示。

10.网格上晶体悬浮物的自动加载

液体处理机器人也可以用于将微晶悬浮液分配到网格中。使用Echo 550液体搬运机器人，将小鼠穿孔素晶体悬浮液装入网格，在LCLS-XPP进行筛选。按照上述方法制备了穿孔素晶体（Law等。, 2010). 将浆液离心，倒出上清液，并将颗粒重新悬浮在隐保护剂中。使用Echo 550液体搬运机器人将悬架转移到带有聚碳酸酯衬垫的格栅上。将30 nl晶体悬浮液滴沉积在聚碳酸酯背衬的表面上，背衬与每个栅极端口对齐（图6一). 网格立即进行闪速冷却，并于2014年12月在LCLS-XPP上用于筛选穿孔素晶体（图6b条).

图6 (一)LCLS-XPP数据采集期间，聚碳酸酯背衬网格的边视图。在液氮闪蒸冷却之前，使用Echo 550液体搬运机器人将穿孔素晶体悬浮液滴定位在网格端口内。(b条)LCLS-XPP数据采集期间，两个穿孔素晶体位于网格端口上。在顶部晶体中暴露于X射线束的地方，可以清楚地看到一个洞。底部的水晶仍然完好无损。

11.网格上的蒸汽扩散结晶实验

为了测试网格作为晶体生长的支架，我们在网格上用溶菌酶进行了坐滴蒸汽扩散实验。使用Echo 550液体处理器将蛋白质和沉淀液滴分配到带有薄聚碳酸酯背衬的网格上。然后将网格放在蒸汽扩散室中，滴入干燥剂培养5天。溶菌酶晶体在网格上生长（图3c（c）)，并使用Echo 550液体处理器在结晶液滴顶部分配冷冻保护剂滴。

蒸汽扩散室也有助于制造对冷冻保护油敏感的手动晶体。该方法最近被用于在含有25个非互补碱基（TB-25）的全核酸支架（full nucleus acid scaffold）的情况下，用RNA聚合酶II（Pol II）与通用转录因子IIB（TFIIB）复合的晶体加载网格，以模拟转录泡。为了实现这一点，在格栅上涂上低温保护剂，并将其放置在蒸汽扩散室内，将低温保护剂溶液放在井中。使用两个显微镜来帮助可视化结晶托盘和蒸汽扩散室中的网格。晶体通过低温操作从结晶托盘转移到网格中。为了保持湿度，在两次传送之间对试验箱进行了松散密封。然后对格栅进行闪蒸冷却，并用于在LCLS-XPP和SSRL光束线12-2（Cohen等。, 2014).

12.网格上的脂质立方相实验

原理验证LCP结晶实验是在网格上进行的，使用了LCP中溶菌酶生长的适应协议（Aherne等。, 2012). 使用Art-Robbins鹰头狮将立方相分配到栅极端口（补充视频S1），并在玻璃三明治中用沉淀剂培养栅极（图4b条). 培养16小时后，在网格端口中观察到宽达50µm的溶菌酶晶体。

网格用于筛选流感M2跨膜结构域蛋白在LCLS-XPP的最佳晶体生长条件。阿特·罗宾斯·格里芬（Art Robbins Gryphon）将立方相分配到网格端口中，分配到每个端口的体积在每个网格中都不同。然后在玻璃三明治中用不同的沉淀剂培养网格，观察到端口中生长着晶体（补充图5一). 将格栅从玻璃夹层上取下，用聚碳酸酯薄膜覆盖以防止蒸发，并在室温下在LCLS-XPP下进行筛分。衍射图像如补充图5所示(b条).

13.讨论

高密度样品安装设备大大减少了多晶体数据采集所需的时间。环形晶体的数据采集要求每个晶体单独安装在测角仪上，以X射线束为中心，然后拆卸。根据光束线硬件和软件的不同，晶体环的自动对准每个可能需要15到30秒（Sharff，2003）; 斯内尔等。, 2004; Pothineni公司等。, 2006; Jain&Stojanoff，2007年; 歌曲等。, 2007). 安装和拆卸样品所需的时间各不相同；然而，即使样品交换需要25s，回路中1000个晶体的样品交换、校准和曝光也至少需要12h的光束时间。此外，1000个单独安装在回路中的样品需要11个SSRL盒或62个单袋存储。样品安装网格可以一次将多达75个传统尺寸的晶体（直径约100–300µm）或数千个微晶安装在测角仪上，避免了样品交换所需的大量时间。由于对整个网格进行一次校准（根据操作员的不同，校准大约需要30秒到1分钟），因此进一步节省了时间，之后每个采样位置的位置由蓝色-Ice/DCSS公司控制软件（Cohen等。, 2014). 当使用传统尺寸的晶体时，使用网格筛选1000个晶体将使样品交换和校准所花费的时间从最多12小时减少到1小时以下，并且一个单块足够容纳1000个样品。此外，单个栅极端口也可以填充多个微晶，在这种情况下，可以一次在测角仪上安装数千个晶体。实际上，网格数据采集的效率取决于许多因素，包括探测器读出速度、每个网格中的晶体数量、执行的数据采集类型和用户的技能。

网格对于手动进行样品交换的室温数据采集特别有利。在光系统II的情况下，样品的感光度对实验施加了额外的限制：手动安装网格、对齐和数据收集是在接近黑暗的情况下进行的，单个晶体无法被可视化以将其定位在光束路径中。尽管有这些限制，但在室温下1小时内从单个20–30µm晶体中获得了87张衍射图像，包括晶体加载、安装和数据收集。在晶体直接生长在网格上的情况下，可以在室温数据采集期间完全避免晶体采集。未来，可以通过开发湿度控制的样品存储外壳，进一步提高室温实验的效率，该外壳可以与测角仪处的湿度控制气流一起为SAM机器人开发。将室温样品运送到同步加速器可以通过在专用运输容器中使用水凝胶来控制湿度来实现（Baba等。，2013年).

衍射实验的一个快速发展的工具是在XFEL和同步辐射源（Nogly等。, 2015). 然而，必须筛选数千种LCP条件，才能找到衍射良好的晶体生长的条件。使用网格来筛选无导线心脏起搏器的情况将是一个非常强大的工具，使研究人员能够使用网格进行采集和无导线心脏起搏器注射器。因此，网格是LCP注射器的补充技术，因为它既可以用于直接数据收集，也可以用于筛选LCP条件。

进一步的开发将侧重于使用视频分析实现网格对齐过程的完全自动化。为了能够自动收集随机位置的晶体数据，还正在开发低背景固定样品架，并使用紫外色氨酸荧光或X射线光栅技术根据基准标记绘制随机位置晶体的位置。使用这些技术从微晶中自动收集数据，可以使我们将注射器的样品输送速度与可忽略的样品浪费相匹配。此外，这种自动化可以进一步扩展到多晶体实验的全自动化工作流的开发，其中使用多晶体自动收集的数据将实时分析完整性。

14.结论

使用高密度容器，例如在已知位置放置晶体的网格，可以实现高效、高度自动化的数据收集策略。适配器和专用网格支架允许在网格内进行结晶实验，绕过了采集和安装晶体的繁琐步骤。这种方法对非常小和精细的晶体特别有吸引力。

15.相关文献

本文的支持信息引用了以下参考文献：Caffrey&Cherezov（2009)、Hellmich等。(2014)和普拉拉等。(2013).