2.1. 结晶、数据收集和定相

卢克和卢克D通过PCR扩增金黄色葡萄球菌菌株NCTC8325并使用聚合酶不完全引物延伸（PIPE）技术克隆到pET-15b+载体中（Klock&Lesley，2009). 感染性疾病结构基因组学中心（CSGID）常规实施的标准方案用于表达和纯化LukE和LukD（Kim等。, 2008; 安德森，2014). 转换为BL21（DE3）Magic后大肠杆菌菌株，细胞在37°C的TB培养基中生长，直到OD₆₀₀已达到1的。此时，温度降低到25°C，蛋白质过度表达是由异丙基的添加引起的β-D类-1-硫代半乳糖苷，最终浓度为1 mM（M）16小时后，通过离心法收集细胞，将其悬浮在10 m的缓冲液中M（M）Tris–HCl pH值8.3500 mM（M）氯化钠，10%甘油，5米M（M） β-巯基乙醇并通过超声波进行裂解。LukE和LukD分别通过Ni–NTA纯化亲和层析并在10 m的缓冲液中洗脱M（M）Tris–HCl pH值8.3500 mM（M）氯化钠，5米M（M） β-巯基乙醇。纯化后，立即将LukE和LukD蛋白浓缩至14.2和5.2 mg/ml⁻¹分别存储在由0.5M（M）氯化钠，10米M（M）Tris–HCl pH 8.3。

在室温下进行了坐滴结晶试验，并使用浓度为7.1 mg ml的LukE获得晶体⁻¹0.2英寸M（M）硫酸锂，0.1M（M）Tris pH值8.5，40%(v（v）/v（v）)2.6 mg ml时的聚乙二醇400和LukD⁻¹0.2英寸M（M）醋酸铵，0.1M（M）双三pH 6.5，25%(w个/v（v）)PEG 3350。采集的晶体在液氮中快速冷却之前转移到母液中。在美国伊利诺伊州阿贡市高级光子源的生命科学协作访问团队光束线上，在100K处收集衍射数据。数据处理使用香港（HKL）-2000年用于索引、集成和缩放（Otwinowski&Minor，1997). 结构由以下因素决定分子置换使用相位器（麦考伊等。, 2005). 数据收集和细化统计如表1所示.

的结构金黄色葡萄球菌以LukS-PV和LukF-PV为分子再置换模型，分别测定LukE和LukD的结构。结构经过了改进REFMAC公司v.5.7.0032（穆尔舒多夫等。, 2011). 模型显示在库特并根据电子密度图进行手动校正（Emsley&Cowtan，2004). 所有结构图均使用PyMOL公司（v.1.3；薛定谔）。LukE的结构还包含两个Cl原子和一个三甘醇分子；LukD结构包含2-[双（2-羟乙基）氨基]-2-（羟甲基）丙烷-1,3-二醇的分子。使用电子脚本3.0服务器（Robert&Gouet，2014).

3.1.结构确定LukE和LukD

使用不同的表达系统对LukE和LukD的几个结构进行了表达测试大肠杆菌.LukE公司_12–311和LukD_27–327成功表达和纯化并用于结晶筛选。LukE晶体_12–311和LukD_27–327提供了分辨率分别为3.2和1.7°的可测量X射线衍射数据。结构由以下因素决定分子置换使用先前确定的LukS PV和LukF PV的三维坐标作为搜索模型（Pédelacq等。, 1999). 两种晶体结构中的每一种都有一个分子非对称单元，这两个改进模型包括氨基酸30-311（LukE总计311个）和氨基酸27-325（LukD总计327个）。LukE和LukD各自是椭圆形的球状蛋白，具有22个（175个残基）或25个（176个残基）β-分别以四股反向平行排列β-床单和三张很短的α-螺旋（十个残基）。它们的组织结构与其他双组分成孔毒素的折叠结构非常相似α-溶血素，它们排列在三个典型的结构域中：（i）帽，（ii）茎和（iii）边缘（Gouaux等。, 1997; 佩德拉克等。, 1999; 吉列特等。, 2004; 图1). 前30个LukE残基和27个LukD残基在两个N末端都缺失，因为金黄色葡萄球菌被截断，也是因为该区域的电子密度定义不明确。

图1 LukED成孔白细胞介素的两种水溶性成分的三维结构。LukE（左）和LukD（右）的功能区表示β-蓝色、黄色和红色的盖子、茎和边缘三明治。N端子和C端子都有标签。

3.2. 与其他白细胞毒素相比，LukE和LukD的结构

研究表明，LukED靶向中性粒细胞上的趋化因子受体CXCR1和CXCR2（Reyes-Robles等。, 2013). 这种相互作用通过LukE发生，并被CXCL8抑制，CXCL8是CXCR1和CXCR2的高亲和力内源性配体。LukE的Gln210–Ala219区域，对应于环路L3（图2)，赋予CXCR1/CXCR2特异性；实际上，在该区域含有LukS-PV序列的杂交LukE分子不能靶向CXCR1和CXCR2受体，同时仍然保留对其他细胞类型的毒性（图3一; 雷耶斯·罗伯斯等。, 2013). 与LukE和其他s成员的叠加相比，LukE与LukS-PV的整体叠加具有更大的r.m.s.d.（r.m.s.d 1.2？）。这是由于LukS-PV的边缘域相对于帽域具有更高水平的扭转。对Gln210–Ala219区域中LukE和LukS-PV表面的比较表明，氨基酸序列差异包括导致表面性质变化的残基（图3一). 特别是，用LukE中的Gly214取代LukS-PV的Tyr184似乎对溶剂暴露表面的面积和环L3的形状有重大影响。LukE中的环L3比LukS-PV中的相同环长一个残基，这一事实导致定位残基Pro215-Thr216，从而使局部溶剂暴露更高。其他强烈影响LukE中L3表面的残留物是Gln210和Ser218。实际上，环L3的溶剂暴露表面为1750.8º²LukE和1472.4º²具有不同电荷分布的LukS-PV。这些重要的变异可以解释LukE和LukS-PV与趋化因子受体结合的不同特异性（Reyes-Robles等。, 2013). 此外，LukE和LukD在不同的金黄色葡萄球菌菌株和150个不同菌株的LukE序列的比对没有发现环路L3中的相关变异性。事实上，LukE中L3相对于LukS-PV的差异对于CCR5+细胞系中LukED的毒性并不重要，这表明与CCR5受体（Reyes-Robles）结合并不需要L3等。, 2013).

图2 LukE和LukD与其他双组分成孔毒素的序列保持。根据等效物（红色）或物理化学性质的守恒，对多重序列比对的每一列中的残留物进行着色。蓝色、黄色和红色的条分别表示属于盖、茎和边缘的区域。环路L3和L4以及发散区DR5也显示出来。

图3 LukE和LukS-PV的叠加。LukE通过与LukS-PV（红色，保守；蓝色，非保守）的序列保守着色，并叠加到LukS-SV（PDB条目1吨5; 黄色实线；吉列特等。, 2004). (一)顶部，叠加在LukS PV主链上的LukE残基Gln210–Ala219的特写（绿色），以棒状重复显示（黄色；显示的唯一侧链是Tyr184的侧链）。底部，LukE（左，绿色）和LukS-PV（右，黄色）的两个溶剂暴露表面。在(b条)不同区域Gln210–Ala219和Leu265–Arg295（DR5）的氨基酸在LukE中表示为棒状。左下角报告了Gln210–Ala219和Leu265–Arg295的LukE和LukS-PV序列比对。(c（c）)在LukE中，发散区域DR5显示为绿色条带，LukS-PV的Arg73、Tyr184、Thr244、His245和Tyr250的位置显示为黄色条带，这些位置参与hPMNs细胞的结合、中性粒细胞的激活和孔隙形成。在LukE中，这些残基对应于Ile103、Pro215、Arg275、Thr276和Tyr279。环路L3和L4显示在轮辋域中。

LukE相对于LukS-PV的另一个不同区域是Leu265–Arg295序列，称为DR5，它对LukED的毒性活性很重要（图3c（c）; 雷耶斯·罗伯斯等。, 2013). 在该区域中有对LukS-PV受体结合很重要的残基。虽然LukS-PV与LukE具有较高的氨基酸同源性，但它使用C5a受体靶向人类PMN。最近，人们对LukS-PV进行了扫描诱变，以确定其与中性粒细胞表面结合的残基（Laventie等。, 2014). 特别是，如图3所示，Arg73、Tyr184、Thr244、His245和Tyr250的单残基突变，每个突变为丙氨酸(一)和3(c（c）)研究表明，LukS-PV可降低其激活中性粒细胞和形成毛孔的能力，并对与人类多形核白细胞（hPMN）的结合起重要作用。在LukE中，这些残基对应于Ile103、Pro215、Arg275、Thr276和Tyr279。特别是，LukE中的Pro215取代LukS-PV中的Tyr184似乎对减少（i）环路L3和L4之间的距离特别重要，这导致C之间的距离为8.4和10.6º^αTyr184（LukS-PV）或Pro215（LukE）的原子和C^α环4上最近残基的原子，（ii）L3本身的扭转（C之间的距离^α叠加后，Tyr184和Pro215的原子为3.2º）和（iii）LukE中轮辋的总扭转（β-L4薄板相对于LukE在LukS-PV中旋转～74°）。

迄今为止，HlgA和HlgB是双组分成孔毒素的唯一成分，其水溶性形式和孔形式的结构都已确定。HlgA和HlgB分别与LukE和LukD有71%和76%的一致性。在图4中HlgA和HlgB的水溶性形式与LukE和LukD重叠。LukE–HlgA叠加导致r.ms.d.为0.53 Au。部分原因是HlgA结构中缺少最可能可变的残基，所以该值很低。最高的可变性（如图4中绘制为木棍的残留物所示)在轮辋的环和盖的锁扣区域中观察到，这在HlgA（PDB入口）的结构中不存在2平方公里7; 罗布林等。, 2008). 此外，LukD–HlgB叠加导致0.97Å的r.m.s.d。结构变化主要是在连接两个反平行体的回路中观察到的β-HlgB（PDB入口）结构中不存在的阀杆紧密构造中的股线1千英尺; 奥尔森等。, 1999). 孔结构中的MPD分子或水溶性单体结构中的磷酸胆碱分子在HlgB中占据的磷酸胆碱结合口袋被LukD中的双-三缓冲液分子占据。

图4 LukE和LukD与HlgA和HlgB的叠加。左侧，LukE的色带表示根据HlgA（红色，保守；蓝色，非保守）的序列守恒着色，叠加在HlgB条目上2平方公里7)黄色。HlgA结构中的缺失区域分别显示在LukE上的重叠中，残基被画成棒状。右侧，LukD与HlgB的结构叠加（PDB条目1千英尺). LukD根据HlgB的序列守恒进行着色。

3.3. 成孔杂岩背景下LukE和LukD的结构特征

最近γ已经确定了HL和LukAB八聚体孔（Yamashita等。, 2011, 2014; 巴达罗等。, 2015). 八聚体由S和F亚单位的四个分子组成。此外，有人认为八聚体结构将类似于其他杀白细胞素的孔结构（Alonzo&Torres，2014). 因为已经证明，在每个成员中，帽状结构域和边缘结构域的核心在单体和原单体之间是刚性的γ由于HL和它们在八聚体组装时保持其相对取向，LukE和LukD的结构被叠加在HlgA和HlgB上γHL孔复合物（LukE，在232℃下的r.m.s.d.为1.67Å^α原子；LukD，246℃下1.66℃的r.m.s.d^α原子）。我们研究了原生质体之间两种界面（界面1，HlgA–HlgB，对应LukE–LukD；界面2，Hlg B–Hlg A，对应Luk D–LukE；图5）中发生的相互作用所涉及的残基守恒). 在帽结构域的界面1中，HlgB的Asp44和Asp48以及HlgA上的Lys15和Arg16参与了质子间体静电相互作用。这些残基是保守的，与LukD的Asp69和Asp73以及LukE的Lys43和Arg44相对应。在边缘结构域的界面1中，HlgB的Arg171和HlgA的Asp194参与静电相互作用，并对应于LukD的Arg176和LukE的Asp226。此外，LukE的Asp66和Asp175以及LukD的Lys46和Arg244，对应于HlgA的Asp38和Glu145以及HlgB的Lys21和Arg219，参与了界面2上的蛋白质间静电相互作用。此外，LukE的Asp66和LukD的Asp69似乎在稳定可溶性茎中也非常重要。事实上，它们分别参与了LukE和Luk D茎中Tyr141和Tyr142的原聚体内氢键相互作用，以及茎的主链，表明这些残基在可溶性单体向孔道复合状态转变中的重要性（补充图S1）。

图5 LukE和LukD在HlgAB孔复合体的原体上的结构重叠。(一)在孔复合体（PDB入口）中，LukE（蓝色）和LukD（红色）分别叠加在原生质体HlgA和HlgB上2007年3月，灰色；山下等。, 2011)显示界面1和界面2。(b条)帽中的质子间静电相互作用。HlgA和HlgB中形成静电相互作用的残留物（灰棒）在LukE（板岩棒）和LukD（红棒）中保存。(c（c）)轮辋中的转子间静电相互作用。在孔隙复合体中形成静电相互作用的HlgA和HlgB保守残基叠加在LukE和LukD中。棍子的颜色如所示(一).

茎部在单体和原体之间经历了最重要的结构重塑（Roblin等。, 2008). 除了间体中发生的氢键β-薄片，HlgB的Glu108和Lys146以及HlgA的Lys140和Asp104之间有两个离子对γHL八聚体孔。根据序列比对，它们对应于LukD的Glu133和Lys171以及LukE的Lys170和Asp134。