2.1. 蛋白质表达和纯化

SARS-CoV PL^{赞成的意见}（多蛋白残基1541-1858）插入pET-22b（+）载体（Chou等。, 2012)表示为大肠杆菌BL21（DE3）细胞（Novagen）。在构建过程中，去掉分泌物标签（pelB先导），并在C末端保留6×His标签。培养物在37°C的LB培养基中生长4 h，用0.4 m诱导M（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷并在20°C下培养过夜。6000离心后克在4°C下保持15分钟，将细胞颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中（20 mM（M）Tris pH值8.5，250 mM（M）氯化钠、5%甘油、0.2%Triton X-100、2 mM（M） β-巯基乙醇），然后通过超声波进行裂解。然后将粗提取物在12000下离心克在4°C下保持25分钟以除去不溶性沉淀。上清液与1 ml Ni–NTA珠在4°C下培养1 h，然后装入空柱中。让上清液流过后，用洗涤缓冲液（20 m）清洗珠子M（M）Tris pH值8.5，250 mM（M）氯化钠，8米M（M）咪唑，2米M（M） β-巯基乙醇），用洗脱缓冲液（20m）洗脱蛋白质M（M）Tris pH值8.5，30 mM（M）氯化钠，150米M（M）咪唑，2米M（M） β--巯基乙醇）。然后将蛋白质装入S-100凝胶过滤柱（GE Healthcare）中，并与流动缓冲液（20 m）进行平衡M（M）Tris pH 8.5，100米M（M）氯化钠，2米M（M）二硫苏糖醇）。通过SDS-PAGE分析收集的组分的纯度，并将蛋白质浓缩至40 mg ml⁻¹使用Amicon Ultra-4 10 kDa离心过滤器（Millipore）。蛋白质的典型产量为每升细胞培养50毫克。

2.2. 分析超速离心（AUC）分析

AUC实验是在XL-A分析超离心机（美国加利福尼亚州富勒顿贝克曼）上使用an-50 Ti转子（Cheng等。, 2010; 谢&周，2011; 周等。, 2012). 沉积速度实验是在20°C下，使用一个双扇形填充碳纤维的epon中心件（0.3或1.2厘米），转子速度为42000转/分⁻¹SARS-CoV损益^{赞成的意见}C112S突变体（0.2毫克毫升⁻¹)或Ub（1 mg ml⁻¹)将蛋白质溶液（330µl）和参考溶液（370µl）装入中心片。对于PL^{赞成的意见}C112S突变型（8 mg ml⁻¹)含Ub（2 mg ml⁻¹)，将过夜孵育的样品（100µl）和对照品（120µl）溶液加载到更薄的中心件（0.3 cm）中。在连续模式下监测250或280 nm处的吸光度，时间间隔为300 s，步长为0.003 cm。然后将不同时间间隔的多次扫描与连续的c（c）(秒)分配模型使用SEDFIT公司（舒克，2000). 所有尺寸和形状分布的分析置信度为第页最大=0.95熵正则化和解决方案N个沉降系数在0到20S之间。此外，AUC结果符合异质关联模型(A类 + B类=AB公司)使用沙特计算离解常数的程序（Brown&Schuck，2006).

2.3. 蛋白质结晶

SARS-CoV PL晶体^{赞成的意见}通过坐滴蒸气扩散法在22°C下获得牛泛素（Sigma）复合物中的C112S突变体。损益^{赞成的意见}–通过混合PL形成Ub络合物^{赞成的意见}和Ub的摩尔比为1:1。最终浓度为8 mg ml和2 mg ml⁻¹分别是。在4℃孵育蛋白质混合物过夜后，在22℃下设置初始晶体筛。经过筛选和优化，可以使用含有18%PEG 3000，0.1的储层溶液来生长晶体M（M）CHES pH 9.5。3天后，尺寸为0.5 mm的单个块状晶体生长。通过SDS–PAGE对晶体进行分析，确认存在两种PL^{赞成的意见}和Ub（补充图S1¹). 所有晶体在补充12%的储液溶液中进行冷冻保护(五/五)甘油和在液氮中闪蒸冷却。

图1 SARS-CoV PL赞成的意见C112S突变体与Ub形成稳定的复合物。(一)PL 280 nm处的吸光度痕迹赞成的意见50米处C112S突变M（M）沉淀速度试验期间的磷酸盐缓冲液pH值为7.4。蛋白质浓度为0.2 mg ml−1。为清晰起见，仅显示每三次扫描。圆圈代表实验数据，线条是使用以下公式拟合Lamm方程后获得的结果SEDFIT公司（周等。, 2011; 舒克，2000). (b条), (c（c）)和(d日)显示连续c（c）(秒)损益分布赞成的意见C112S突变体（0.2毫克毫升−1)，优步（1毫克毫升−1)和带有Ub（8和2 mg ml）的C112S突变体−1)分别是。两条垂直虚线表示PL的位置赞成的意见(秒=2.72）和Ub(秒=1.04）。原始数据的剩余位图和最佳拟合结果显示在插图中。

2.4. X射线数据采集、处理和结构测定

使用ADSC Quantum-315r CCD探测器（X射线波长0.976º），在中国台湾国家同步辐射研究中心SPXF光束线13C1的100K处收集X射线衍射数据。衍射图像用香港（HKL）-2000年包装（Otwinowski&Minor，1997). 该结构通过分子置换法求解相位器（麦考伊等。, 2007)使用野生型PL的结构^{赞成的意见}（PDB条目2月8日; 拉蒂亚等。, 2006)作为搜索模型。使用执行结构模型的手动重建库特（Emsley和Cowtan，2004年). 结构精炼是用REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011). 数据处理和细化统计总结见表1. The晶体结构已存入蛋白质数据库（PDB条目4毫瓦).

表1 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒PL的晶体学信息摘要赞成的意见C112S–Ub复合体 括号中的值表示最高分辨率外壳。 数据收集  “空间”组 P（P）21  单位-细胞参数（Ω，°） 一= 47.5,b条= 68.3,c（c）= 68.4,α= 90,β= 95.7,γ= 90  分辨率（Ω） 30–1.4 (1.48–1.40)  R（右）合并†(%) 3.5 (39.4)  〈我/σ(我)〉 31.4 (3.3)  完整性（%） 99.6 (99.1)  多重性 3.8 (3.7) 精炼  反射次数 80733 (11418)  R（右）因素‡(%) 15.7  免费R（右）因素§(%) 18  原子数   总计 3535   蛋白质 3176   配体/离子 44/2   水 313  B类因子（λ2)   蛋白质 17.9   配体/离子 26.1/22.0   水 25.4  相对标准偏差。   粘结长度（Ω） 0.007   结合角（°） 1.4  拉马钱德兰分析¶(%)   受欢迎的 98   允许 2   不允许的 0  旋转器异常值¶（残留物） 三 †R（右）合并=，其中我我(香港特别行政区)是给定反射和〈的综合强度我(香港特别行政区)\9002；是多个相应的对称相关反射的平均强度。 ‡R（右）=，其中F类光突发事件和F类计算分别是观测和计算的结构因子。 §免费R（右）因子是R（右）使用从精致。 ¶Ramachandran分析和转子流量计异常值检查使用摩尔概率（陈）等。, 2010).

2.5. 定点突变和酶动力学分析

SARS-CoV PL突变体^{赞成的意见}使用QuikChange试剂盒（Stratagene）生产，并通过DNA测序进行验证。这个酶活性PL的^{赞成的意见}通过基于比色法的肽洗脱法测定，该法涉及6肽底物FRLKGG-对位-硝基苯胺（FG6-pNA；GL Biochem Ltd，中国上海）。该底物在Gly-pNA键处被裂解以释放游离pNA，这可以通过405nm处吸光度的增加进行监测。蛋白质水解释放的pNA量可以使用分析级pNA生成的标准曲线进行计算。蛋白酶活性测定在50 m范围内进行M（M）磷酸盐pH 7.4，温度为30°C。基质储备溶液在6米处配制M（M）工作浓度为0.5～5mM（M）.野生型PL的浓度^{赞成的意见}E168A、E168D、E168R和Y265F突变体为1µM（M）而L163Q、D165A和Y265A突变体的厚度为9µM（M）通过将初始速度数据拟合到Michaelis–Menten方程，获得稳态酶动力学参数。程序Sigma图12（美国加利福尼亚州里士满Systat Software Inc.）用于数据分析。

2.6. 去泛素分析

添加0.5µ的荧光底物泛素-7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC；Boston Biochem Co.，USA）M（M）至50米M（M）pH 7.4的磷酸盐缓冲液和不同浓度的野生型PL^{赞成的意见}或其突变体（0.17µM（M）对于野生型，L163Q、E168D和Y265F以及0.51µM（M）对于D165A，E168A、E168R和Y265A）用于氘化分析。在Perkin-Elmer LS 50B发光光谱仪中，通过分别在350 nm和485 nm的激发波长和发射波长下连续监测底物裂解后的荧光发射增加来测定30°C下的酶活性。

2.7. 抑制试验

对于抑制研究，0.5 mM（M）FG6-pNA和各种浓度的CHES（0-600 mM（M）)与PL混合^{赞成的意见}(0.4 µM（M）)在30°C时，持续监测其活性。根据CHES的浓度绘制抑制反应的初始速度，以获得IC₅₀值。

描述CHES和已知PL的相互作用^{赞成的意见}抑制剂6-硫鸟嘌呤（6TG；Chou等。, 2008)PL的活性^{赞成的意见}在存在6TG（0–15µM（M）)在各种CHES浓度下（0–200 mM（M）). FG6-pNA浓度保持在0.4 mM（M）酶的厚度为1µM（M）将多重抑制的数据拟合到方程中

哪里五是两种抑制剂存在时的初始速度，我和J型是两种抑制剂的浓度，五₀是没有抑制剂时的速度，K（K）_我和K（K）_j个是两种抑制剂的表观离解常数α是两种抑制剂相互作用程度的量度（Yonetani&Theorell，1964).

3.1. SARS-CoV-PL的稳定络合物^{赞成的意见}带Ub

用SARS-CoV-PL描述催化的分子基础^{赞成的意见}，我们的实验目的是确定肽基底物或Ub与SARS-CoV PL的结合方式^{赞成的意见}然而，努力明确野生型损益^{赞成的意见}复合体没有成功。因此，我们尝试替换野生型PL^{赞成的意见}活性较低或不活跃的突变体仍保持底物结合亲和力。经过多次试验，一种非活性催化三联体突变C112S以1:1摩尔比与Ub共结晶。

确认PL复合物的形成^{赞成的意见}带有Ub的C112S突变体是真的，不是因为晶体堆积，我们进行AUC实验来表征PL^{赞成的意见}–优步综合体。图1(一)显示PL 280 nm处的典型吸光度轨迹^{赞成的意见}实验期间C112S突变。将信号拟合到连续尺寸分布模型后，很明显C112S突变体是单体的，具有沉降系数2.72 S（图1b条)，与野生型PL一致^{赞成的意见}（周等。, 2012). AUC分析表明，Ub也是一种单体，具有沉降系数1.04秒（图1c（c）). 在结晶浓度（PL）下培养过夜后^{赞成的意见}8毫克毫升⁻¹2 mg ml时的Ub⁻¹)，损益^{赞成的意见}C112S–Ub复合物沉降系数可以观察到3.03 S（图1d日)与1:1化学计量比的络合物（Dam等。, 2005). 相比之下，野生型PL的AUC实验^{赞成的意见}未产生损益^{赞成的意见}–Ub复合物，仅单独PL^{赞成的意见}和Ub信号（补充图S2）。接下来，将AUC结果拟合到A类+B类异质关联模型（Brown&Schuck，2006）)解离常数为6.7µM（M）已获得。这证实了在结晶浓度下，两种蛋白质均为230µM（M），大部分损益^{赞成的意见}C112S突变分子应该与Ub形成稳定的复合物。

3.2. PL的总体结构^{赞成的意见}与Ub复合

这个晶体结构SARS-CoV PL的^{赞成的意见}C112S–Ub络合物以1.4º的分辨率测定（表1和图2). 水晶属于空间组 P（P）2₁，带有单位-细胞参数一= 47.5,b条= 68.3,c（c）= 68.4 Å,β= 95.7°. 当前包含一个PL的原子模型^{赞成的意见}和晶体中的一个Ub分子非对称单元与晶体学数据和几何参数的预期值一致（表1). 98%的残留物位于Ramachandran图的最有利区域，没有一个位于不允许区域。

图2 SARS-CoV PL的结构赞成的意见与Ub复合物中的C112S突变。(一)PL的叠加赞成的意见C112S–Ub复合物（彩色）和游离野生型PL赞成的意见（灰色）。PL的Ubl、拇指、手掌和手指域赞成的意见与Ub复合物中的C112S突变体分别为紫红色、青色、橙色和绿色，Ub为黄色。橙色和灰色球体显示了锌离子在两种结构中的位置。锌结合位点的运动(b条)和β14–β15（BL2）回路(c（c）)用箭头表示。残留物显示为棒状物，氢键用红色虚线表示。本文中的所有结构图都是使用PyMOL公司(https://www.pymol.org).

PL的总体结构^{赞成的意见}Ub复合体中的C112S（图2一)与自由PL相似^{赞成的意见}（比率等。, 2006). 等效C之间的均方根距离^α两种结构的原子为0.56℃。我们结构中的锌结合基序更倾向于Ub，并且锌原子相对于游离PL中的锌原子显示出3.8Å的位移^{赞成的意见}（图2b条). 类似地β14–β15环路，在之前的研究中称为BL2环路（Ratia等。, 2006)，也有向催化间隙的大运动（图2c（c）). 然而，催化三联体并没有显示出显著的变化。

3.3. PL的相互作用^{赞成的意见}带Ub芯

结构显示PL^{赞成的意见}在与Ub的非共价复合物中（图3和4). 损益^{赞成的意见}与Ub核心的几个残基相互作用（残基1–72; 在整个论文中，Ub残留物用斜体和PL表示^{赞成的意见}由拇指、手掌和手指区域组成的杯形手结构，而四个C末端残基(73–76)Ub与PL的窄活性位点通道结合^{赞成的意见}.

图3 Ub核心与SARS-CoV PL的相互作用赞成的意见显示PL之间详细交互的示意图赞成的意见C112S（颜色如图2所示)和Ub芯（黄色）。氢键和离子对相互作用用红色虚线表示。

图4 SARS-CoV PL活性位点中Ub C末端的结合方式赞成的意见. (一)立体示意图，显示PL活性部位之间的详细相互作用赞成的意见C112S突变体和Ub的C末端。氢键和离子对相互作用用红色虚线表示。(b条)OMIT公司F类o个−F类c（c）Ub最后四个C末端残基的电子密度图，分辨率为1.4º，等高线为3.5σPL的相互作用残基赞成的意见显示为木棍。

在九个损益中^{赞成的意见}位于Ub核心4°范围内的残留物，三个残留物Leu200、Tyr208和Val226与Ub核心疏水接触（图3). 四个残基参与极性相互作用，包括一个离子对侧链胍基之间Arg42型以及Glu168的侧链羧酸基团和三个氢键：来自阿拉巴马州46到Gln233的侧链，来自甘氨酸47到Met209的主链酰胺和格林49Arg167侧链（图3). 这些交互作用中只有一个位于手指域（Gln233），而其他位于手掌（Met209）和拇指（Arg167和Glu168）域。此外，PL之间的界面上有36个溶剂分子^{赞成的意见}Ub核心介导两种蛋白质之间的相互作用。这些观察结果表明，PL^{赞成的意见}–Ub核心界面本质上主要是亲水的，Ub核心可能与PL松散相关^{赞成的意见}.

识别保守PL^{赞成的意见}与Ub相互作用的残基，我们比较了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的PL^{赞成的意见}氨基酸序列与PL的氨基酸序列^{赞成的意见}来自其他五个CoV（图5). 多序列比对表明，与Ub核心相互作用的残基保守性较差。然而，Glu168残基是BCoV和其他两种人类CoV中的天冬氨酸残基，而MERS-CoV中的等效残基是精氨酸（Barretto等。, 2005; 扎基等。, 2012; 汉族等。, 2005). 为了评估该残基的功能重要性，我们对E168A、E168D和E168R突变体的肽切和DUB活性进行了表征。动力学分析表明，突变不会显著影响对肽底物的蛋白水解活性（表2). 另一方面，E168A和E168R突变体的DUB活性降低了25倍，而E168D突变体的活性增加了1.3倍（补充图3和表2). AUC分析还表明，C112S/E168R双突变体不能与Ub形成稳定的复合物（补充图S4）。这些实验数据表明离子对Glu168（或Asp168）和Arg42型对于PL识别Ub核心很重要^{赞成的意见}及其DUB活动。此外，E168R突变株DUB活性的降低也表明MERS-CoV PL^{赞成的意见}可能没有表现出显著的DUB活性。早期研究证明SARS-CoV和MHV PL^{赞成的意见}能与IRF3结合，引起其去泛素化并防止其核移位（郑等。, 2008)，并能进一步减少干扰素诱导，促进感染细胞中病毒的生长（郑等。, 2008). 相反，没有显著的DUB活性，MERS-CoV PL^{赞成的意见}可能无法有效抑制干扰素诱导；然而，它对病毒感染的影响仍有待进一步研究。

图5 各种2型冠状病毒PL的序列比对赞成的意见s.第1组，HCoV229E；2a组，BCoV和HCoV-HKU1；2b组，SARS-CoV和MERS-CoV；第3组，IBV。蓝色和绿色椭圆分别表示残留物与Ub核心和C末端极性接触，而品红色椭圆表示催化三元。带有白色字符的红色框表示具有严格一致性的残基，而带有红色字符的蓝色框表示组中具有相似性的残源。加入号码如下：SARS-CoV，AY291451；MERS-CoV，NC019843.2；BCoV，NC012948.1；HCoV-HKU1，DQ415909.1；HCoV-229E，JX503060.1；IBV，JQ088078.1。

3.4. PL的相互作用^{赞成的意见}Ub C末端残留物

四个Ub C末端残基亮氨酸73-Arg74-Gly75-Gly76具有明确定义的电子密度，并且位于PL的窄活性位点通道中^{赞成的意见}（图4一和4b条). 事实上，这四个残基很可能与底物的P4–P1残基相似。它们的主链原子与PL形成氢键相互作用网络^{赞成的意见}，包括亮氨酸73–Asp165侧链，Arg74型-Tyr265侧链，Arg74型–Gly272，甘氨酸75–Gly164和甘氨酸76–Gly272和甘氨酸76与Trp107、C112S和Tyr113发生相互作用。此外，甘氨酸75（P2-mimicking）和甘氨酸76（P1-mimicking）位于由Asn110、Tyr113、Tyry274和Leu163组成的狭窄疏水腔中（图4b条). 先前的研究已经证实Y274A突变体是非活性的（巴雷托等。, 2005). 在这里，我们将Leu163突变为谷氨酰胺，发现K（K）_米和k个_猫与野生型PL相比，使用肽裂解法测定的L163Q突变值分别增加1.6倍和减少9倍^{赞成的意见}（表2). 突变还导致DUB活性降低80%。这些数据表明，除了悬浮在底物结合的活性位点之上之外，疏水性Leu163还可能有助于增强Cys112的亲核性（比率等。, 2006).

与游离PL相比，BL2环中的残基Tyr269表现出显著的运动^{赞成的意见}（补充图S5）。这导致了亮氨酸71（P6-模拟）与Tyr269和亮氨酸73（P4-mimicking）指向由残基Pro249、Tyr265和Tyr299组成的疏水囊（图4一). 然而，与USP–Ub复合物（Renatus等。, 2006)和预测损益^{赞成的意见}–Ub绑定模型（Ratia等。, 2006)的侧链胍基Arg72型（P5-mimicking）不与PL相互作用^{赞成的意见}总之，我们的观察证实了SARS-CoV PL的底物特异性^{赞成的意见}在P1、P2、P4和P6位置，这对最佳底物识别和切割很重要（Han等。, 2005).

先前的研究预测，氧阴离子位于Trp107侧链和Cys112主链酰胺（Ratia等。, 2006). 在当前结构中甘氨酸76末端显示羧酸基团（图4b条). 的O原子之一甘氨酸76羧酸盐与C112S的主链酰胺和Trp107的吲哚N原子氢化键合，距离分别为2.84和2.79º，而另一个O原子靠近C112S侧链羟基（2.46º）和主链酰胺（3.02º）以及Tyr113的主链胺（2.96º；图4一). 这两个O原子中，指向PL的^{赞成的意见}在催化过程中作为氧负离子更具埋藏性和适用性。这表明主链酰胺类残基112和113可以形成氧阴离子孔。类似地甘氨酸76C112S的羟基表明它可能是一种低阻隔氢键，如在酶的非水活性位点（Cleland等。, 1998). 与USP2–Ub复合物的活性部位相比，去质子S^γCys原子亲核剂旋转120°并指向远离Ub甘氨酸76因为两个带负电荷的部分之间的静电斥力（Renatus等。, 2006). 电荷排斥可能会破坏蛋白酶-配体复合物的稳定性。羟基和巯基之间的差异以及PL的较小Ub接触^{赞成的意见}（见下文）能够解释为什么C112S突变体能够与Ub稳定结合，而野生型PL^{赞成的意见}不能。

许多DUB的BL2环，如HAUSP、USP2和USP14，在催化中发挥调节作用（Hu等。, 2002, 2005; 雷纳特斯等。, 2006). 这里，我们提供了BL2环构象的直接结构证据(β14–βPL的15回路）^{赞成的意见}也受到底物结合的影响（图2c（c）和补充图S5）。在有底物存在的情况下，BL2环中的残基Gly272与Arg74型（P3-微型）和甘氨酸76（P1-微型）（图4一). 此外，该环中的另一个残基Tyr269与亮氨酸71（P6-模拟）和亮氨酸73（P4分钟）。所有这些相互作用使BL2环更接近Ub的C末端。另一方面，自由PL中的BL2闭环^{赞成的意见}可能会使其处于非活动状态。一系列“BL2环”结合抑制剂，如GRL0617，其结合位点接近Asp165和Tyr274，已被证明通过IC使BL2环更加闭合₅₀0.3–0.6µM（M）（比率等。, 2008; 高希等。, 2010; 李等。, 2013).

3.5. Asp165和Tyr265对PL也很重要^{赞成的意见}催化作用

除了Leu163和Glu168，我们还突变了另外两个在CoV PL中高度保守的残基Asp165和Tyr265^{赞成的意见}（图5; 巴雷托等。, 2005; 汉族等。, 2005; 扎基等。, 2012)对于绑定到亮氨酸73（P4-微型）和Arg74型（P3-微型）主干（图4一). 我们的动力学数据和氘化分析表明，D165A突变体基本上是非活性的，其k个_猫/K（K）_米，由于k个_猫增长了4.6倍K（K）_米（表2). 增加了K（K）_米D165A突变体的值表明Asp165侧链和亮氨酸73（P4）对PL的底物结合很重要^{赞成的意见}.

与野生型PL相比^{赞成的意见}Y265A突变体的DUB活性仅为1%k个_猫增长了3.4倍K（K）_米（表2). 据报道，在早期的一项研究中，该突变体处于非活性状态（巴雷托等。, 2005). 相比之下，Y265F突变体在基于k个_猫/K（K）_米和43%的DUB活性（表2). 这表明了该位置苯环的重要性，而氢键与Ub主链相连Arg74型（P3型）可能是可有可无的。

3.6. 与其他USP–Ub复合物的比较

损益^{赞成的意见}显示了与几个蜂窝DUB类似的拓扑结构（比率等。, 2006). 在这里，我们比较了PL的结构^{赞成的意见}–Ub复合物与USP2–Ub（PDB条目2小时5; 雷纳特斯等。, 2006)，USP14–优步醛（PDB条目2岁; 胡等。, 2005)和HAUSP–Ub醛（PDB入口1亿立方英尺; 胡等。, 2002)复合物（补充图S6）。有趣的是，PL^{赞成的意见}手指较短，缺少BL1环（补充图6一). 只有大约1000欧²PL表面积的^{赞成的意见}(640 ŲUb核心和360°²由Ub C终端）埋入接口中，比USP2–Ub（1900º²; 补充图S6b条)，USP14–Ub醛（1500º²; 补充图S6c（c）)和HAUSP–乌布醛（1700Ų)复合物。PL接触较少^{赞成的意见}Ub和Cys112的荷电斥力甘氨酸76可能都会影响Ub结合。这可以解释为什么野生型PL^{赞成的意见}和Ub不能形成稳定的复合物（补充图S2），这可能有助于产品释放。相反，更稳定的USP2–Ub复合物会导致Ub对产品的抑制K（K）_我2.8µM（M）（雷纳特斯等。, 2006). 同样，损益的当前结构^{赞成的意见}C112S–Ub被捕获在非共价酶-产物复合物中。和半胱氨酸一样多蛋白酶通常观察到其催化半胱氨酸形成催化三联体，将半胱氨酸突变为丝氨酸可能是描述这些酶-产物复合物结构的一个好策略。

图6 CHES与PL的相互作用赞成的意见活性部位及其抑制作用。(一)CHES（品红）和PL之间的氢键（红色虚线）和疏水相互作用赞成的意见（橙色表示手掌区域，青色表示拇指区域）。(b条)OMIT公司F类o个−F类c（c）CHES的电子密度为1.4º分辨率，等高线为3.5σ. (c（c）)抑制PL赞成的意见由CHES提供。实验一式三份，点和条分别代表平均值和误差。该曲线是IC数据的最佳拟合50计算。(d日)CHES和6TG的两种抑制模式。这些点是实验速度的倒数，这些线是数据与（1）的最佳拟合根据结果，两种抑制剂相互拮抗与PL的结合赞成的意见(α= 2.3).

3.7. PL活性部位的CHES^{赞成的意见}

除了Ub外，在我们的结构的活性部位还有一个具有清晰电子密度的CHES分子（图6一和6b条). CHES的环己基C原子位于三联体残基之一His273的咪唑基团和Trp107的吲哚基团之间。它的铵基团与催化三联体的第三个成员Asp287的侧链羧酸盐离子偶联，而它的磺酸使氢键与主链结合酰胺类Trp107和Ala287的表达。CHES的结合位置表明它可能占据部分S1′和S2′位点，并干扰PL的催化^{赞成的意见}。我们的动力学研究显示IC₅₀值188 mM（M），表明抑制活性较弱（图6c（c）). 然而，这个结合位点可能容纳其他化合物。我们以前报道过两种硫嘌呤类似物，6-巯基嘌呤（6MP）和6TG，是SARS-CoV PL的竞争性可逆抑制剂^{赞成的意见}，带有K（K）_我15µM（M）（周等。, 2008). 对接计算表明，6MP和6TG可能与PL的催化三联体相互作用^{赞成的意见}和其他一些USP（陈等。, 2009). 为了表征这些硫嘌呤类似物和CHES的相互作用，进行了多重抑制研究（图6d日). 实验是通过测量PL的初始反应速度进行的^{赞成的意见}不同浓度的6TG和CHES。底物浓度保持在饱和水平不变，这使得两种抑制剂都能与酶结合（Benson等。, 2008). 通过将数据拟合到（1），结果表明，这些线在x个Yonetani–Theorell图中的轴（Yonetani＆Theorell，1964)和α值为2.3。这表明6TG和CHES相互拮抗结合，表明它们可能与PL相互作用^{赞成的意见}在相同或相近的地区（科普兰，2000).