1.简介

小鼠肝炎病毒A59株（MHV-A59）属于冠状病毒，由一个大而多样的包膜病毒家族组成，其单链阳性RNA基因组约为31000 bp（Lee等., 1991; 西班牙等., 1988). 这个冠状病毒科表现出广泛的宿主范围，感染许多哺乳动物和鸟类，并导致上呼吸道、胃肠道、肝脏和中枢神经系统疾病。在人类和鸟类中，冠状病毒主要引起上呼吸道感染，而猪和牛冠状病毒则会引起肠道感染，导致严重的经济损失（Siddell，1995).

冠状病毒尖峰（S）蛋白，也通常被称为E2，在病毒包膜上形成蛋白团结构，每个尖峰被认为是二聚体或三聚体（Cavanagh，1983年). S蛋白介导病毒离子与宿主细胞受体的结合（Collins等., 1982)病毒进入时的融合和感染后后期的细胞间融合等., 1990). MHV S蛋白在高尔基体中被宿主细胞蛋白酶切割成两个大小相似的亚基：氨基末端S1和羧基末端S2（Frana等., 1985; 卢伊特杰斯等., 1987; 斯图曼等., 1985). 人们认为S1亚单位形成穗的球形头部，而S2亚单位则形成跨膜柄部分（de Groot等., 1987). 序列分析表明，冠状病毒棘突蛋白具有I型膜蛋白的结构特征，包括两个七重区、一个融合肽、S2羧基末端附近的跨膜结构域和S1（Spaan）N末端的疏水信号肽等., 1988). S2结构域有一个内部融合肽和两个七重区，分别命名为HR1和HR2。HR2位于跨膜区附近，HR1是其上游约170个氨基酸。

典型的I类病毒融合蛋白包含几个显著的特征。它们在氨基末端都有一个融合肽，被认为在病毒融合过程中直接插入靶膜。融合肽的羧基末端是两个包含4,3个疏水（七肽）重复序列的区域，这些序列基序形成了一个卷曲线圈结构。这种结构在包膜糖蛋白（或融合蛋白）的外域中形成一个稳定的蛋白酶抗K核心。熔核复合体由两部分组成肽，称为HR1和HR2肽，对应于具有疏水性七肽重复序列的两个区域。七重区（HR）存在于许多不同病毒的融合蛋白中，是I类病毒融合蛋白（Bosch等., 2003; Eckert&Kim，2001年). 先前的生物物理和结构研究表明，HR1和HR2肽类MHV尖峰蛋白形成稳定的异二聚体螺旋三聚体（Bosch等., 2003). 据信，这两个HR结构域在融合过程中重新折叠成六螺旋束，其中HR1结构域形成一个由HR2结构域的三个反平行螺旋包围的三倍螺旋卷曲线圈（Eckert&Kim，2001). 因此，跨膜结构域和已知插入细胞膜的融合肽都被转座成紧密结合。这将细胞膜和病毒膜拉近，促进膜融合。

我们最近的实验表明，MHV尖峰蛋白的两个HR结构域也可以形成六螺旋束（Xu等.，正在准备中）。在这里，我们报道了冠状病毒棘突蛋白第一融合核复合体的初步X射线晶体学分析，即MHV融合核。

2.材料和方法

2.1. 融合核心蛋白的表达和纯化

通过连接HR1和HR2结构域，将MHV融合核心蛋白制备成单链通过一种八氨基酸连接物（GGSGG）。HR1和HR2的氨基酸序列取自小鼠冠状病毒小鼠肝炎病毒A59株（基因库编号M18379）。所使用的HR1区域源自氨基酸968–1027，HR2源自氨基酸1216–1254。这些结构和编码的蛋白质被称为2-螺旋（图1). 2-螺旋蛋白的制备和表征将在别处报道（Xu等.，正在准备中）。

图1 冠状病毒MHV A59棘突蛋白和MHV 2-螺旋结构的示意图。S1和S2在蛋白水解裂解（垂直箭头）后形成，并且非共价连接。包膜蛋白有一个N端信号序列（SS）和一个与C端相邻的跨膜结构域（TM）。S2包含两个HR（七重）区域（阴影条），称为HR1和HR2。FP（带阴影条）是一种推测的融合肽，其后是HR1区域。两个HR区域通过一个八位连接子（GGSGG）连接到一个多肽。

构造已克隆到Nde公司我和Xho公司pET表达载体pET22b（Novagen）的I位点（由合成PCR引物引入）。通过测序验证该结构，将预期质粒转化为大肠杆菌菌株BL21（DE3）活性细胞和转化子在含有100µg ml的LB琼脂平板上进行筛选⁻¹氨苄西林。细胞在310 K下在含有100µg ml的2×YT培养基中培养⁻¹氨苄西林。当培养密度(A类₆₀₀)达到0.6–0.8，用0.2m诱导培养M（M）IPTG并在289 K下额外生长10小时，然后收获细胞。

细菌细胞颗粒在PBS中重新悬浮，并通过超声波均质。裂解液在18000下离心克在277 K下持续20分钟，上清液被加载到镍上²⁺–NTA专栏（Qiagen）。用洗涤缓冲液（1×PBS，60 mM（M）咪唑），用洗脱缓冲液（1×PBS，500 m）洗脱目标蛋白M（M）咪唑）。通过以下方法纯化的蛋白质亲和层析使用Superdex 75柱（Pharmacia）进一步纯化，并通过SDS–PAGE进行分析。

MHV 2-螺旋的硒蛋氨酸衍生物用大肠杆菌BL21（DE3）在含有60 mg l的最小培养基M9中培养⁻¹ L（左）-SetMet公司。向培养物中添加六种氨基酸（赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸），以抑制BL21（DE3）表达菌株的Met生物合成。硒代蛋氨酸MHV 2-螺旋的纯化与天然MHV 2-螺的纯化相同。质谱分析证实了硒的掺入。

2.2. 结晶

纯化蛋白在结晶缓冲液（10 m）中透析M（M）Tris–HCl pH 8.0，10 mM（M）NaCl）并浓缩至8–10 mg ml⁻¹。蛋白质浓度通过280 nm处的吸光度测定，假设A类₂₈₀0.22（对于1.0 mg ml）⁻¹解决方案。使用Crystal Screen试剂盒（Hampton Research）筛选初始结晶条件。蛋白质可以在几种条件下结晶。通过改变沉淀剂、蛋白质浓度和添加剂，进一步优化了结晶条件。质量好的晶体可在0.1M（M）MES pH 6.5，10%(五/五)聚乙二醇4000，8%(五/五)二甲基亚砜和5 mM（M）六胺三氯化钴（图2一和2b条). 在291 K下通过悬滴蒸汽扩散法进行结晶。将1µl蛋白质溶液与1µl贮存溶液混合，并在291 K下与200µl贮存溶液平衡。结晶在3 d内出现。

图2 (一)使用吊滴法生长的MHV 2-螺旋蛋白的典型晶体M（M）MES pH 6.5，6%(五/五)聚乙二醇4000。(b条)使用吊滴法生长的MHV 2-螺旋蛋白（硒代蛋氨酸衍生物）的典型晶体M（M）MES pH 6.5，10%(五/五)聚乙二醇4000，8%(五/五)二甲基亚砜和5 mM（M）三氯化六胺钴。

将纯化的MHV 2-螺旋硒蛋氨酸衍生物浓缩至8 mg ml⁻¹结晶试验是基于天然蛋白质的最佳条件进行的。

3.结果和讨论

MHV 2-螺旋蛋白结构可以在几种条件下结晶。使用0.1可以获得大的双折射平行棱镜晶体M（M）MES pH 6.5，6%(五/五)PEG 4000，尽管晶体的衍射图案仅扩展到8º分辨率（图2一). 只有使用0.1才能获得衍射良好的晶体M（M）MES pH 6.5，10%(五/五)聚乙二醇4000，8%(五/五)二甲基亚砜和5 mM（M）六胺三氯化钴（图2b条). 这些晶体属于空间组 R（右）3，带单位-细胞参数一=b条= 48.3,c（c） = 199.6 Å,α=β= 90,γ= 120°. 假设在非对称单元，计算出溶剂含量约为46%。选定的数据统计如表1所示.

表1 数据收集和处理统计 括号中的值对应于最高分辨率外壳。 数据 峰 边缘 远程 本地 “空间”组 R（右）三 R（右）三 R（右）三 R（右）三 单位-细胞参数（Ω）          一(Å) 48.4 48.5 48.3 48.3  b条(Å) 48.4 48.5 48.3 48.3  c（c）(Å) 200 200.1 199.4 199.6 波长（Ω） 0.9799 0.9801 0.9000 0.9000 分辨率范围（Ω） 35–2.4 35–2.4 35–2.4 35–2.5 观察到的反射 49717 50167 49352 43687 独特的反射 6842 6867 6804 5901 完整性（%） 100 (100) 100 (100) 100 (100) 100 (100) 〈我/σ(我)〉 14.3 (4.1) 14.6 (4.5) 13.7 (3.8) 12.4 (5.6) R（右）合并(%) 9.4 (34.0) 8.4 (31.0) 9.3 (36.1) 7.4 (24.2) ‡R（右）合并=对于强度(我)第页，共页我反射观测小时使用非异常形式的远程数据重新处理原始数据，分辨率范围为35–2.5º。

多波长反常色散（MAD）数据是从单个硒代蛋氨酸衍生物晶体中收集的，其峰值（0.9799º）、拐点（0.9801º）和远距离（0.900º）波长为2.4º。MHV 2-螺旋的结构由MAD阶段方法，并将在其他地方发布。

对MHV融合核的清晰结构分析将提供病毒融合核结构的详细图片（第一个晶体结构冠状病毒棘突蛋白融合核心）和冠状病毒的棘突蛋白介导的病毒融合机制。这将增加病毒融合核心结构的储备。这也将为基于结构的融合抑制剂设计开辟一条新途径肽类或肽类似物，例如小分子，用于这些新出现的传染病。