2.1. 感染和RNA分离

Vero细胞感染SARS-CoV（法兰克福-1株；NCBI登录号AY291315；Drosten等。, 2003)感染倍数为0.01。细胞病变开始时（感染后约40小时），细胞内RNA在室温下用5%十二烷基硫酸锂在LET缓冲液（100 mM（M）氯化锂，1米M（M）EDTA，10米M（M）Tris–HCl pH 7.4），含20µg ml⁻¹使用注射器剪切细胞DNA后，将裂解物在315 K下培养15分钟，用苯酚（pH 4.0）和氯仿萃取，并将RNA乙醇沉淀。用引物SAV009（5′-GGACAGCAACCGCTGGACAATC-3′）反转录获得cDNA，补充核苷酸使用Thermoscript逆转录酶（Invitrogen）对法兰克福1号染色体组的13644–13665进行分析。

2.2. 亚克隆，大肠杆菌蛋白质表达与纯化

使用两个含有Gateway重组系统（Invitrogen）attB位点的引物，从上述cDNA中通过PCR扩增SARS-CoV Nsp9编码序列。在该基因的5′端，附加了一个编码六组氨酸标签的序列。然后在pDest14质粒（Invitrogen）中亚克隆该cDNA。通过测序检查最终构建物的开放阅读框（称为pDest14/Nsp9-HN，编码SARS-CoV或f1a多蛋白残基4118-4230的N末端His标记版本）（MilleGen，Toulouse，France）。表达式在中执行大肠杆菌用pLysS质粒（Novagen）转化C41（DE3）菌株（Avidis SA，法国）。该质粒携带溶菌酶基因，可以对表达进行严格调控，并为六种罕见密码子提供tRNA，这些密码子在大肠杆菌培养物在310 K下生长至OD₆₀₀达到0.6，然后在冰上储存2h；添加2%乙醇诱导应激伴侣（Gong&Shuman，2002）). 通过添加50µM（M）IPTG和细胞在290 K下培养16 h。通过离心收集细胞，将细菌颗粒重新悬浮并冷冻在50 m内M（M）Tris–HCl，150米M（M）氯化钠，10米M（M）咪唑，pH 8.0。

用0.25 mg ml解冻细胞悬液⁻¹溶菌酶，0.1µg ml⁻¹DNase和20 mM（M）硫酸镁₄并在12000下离心克将上清液涂在与FPLC系统相连的镍亲和柱上（Amersham Pharmacia Biotech）。用50 m洗脱蛋白质M（M）Tris–HCl，150米M（M）氯化钠，250米M（M）pH 8.0的咪唑，然后施加到制备的Superdex 200凝胶过滤柱上，在10m内进行预平衡M（M）Tris–HCl，300米M（M）氯化钠pH 8.0。重组蛋白经N末端测序鉴定，质谱学，动态光散射（DLS）和圆二色性（CD）。

2.3. 蛋白质特性

使用Dynapro微量取样器（蛋白质溶液），使用5.8 mg ml的蛋白质溶液进行DLS⁻¹10米M（M）Tris–HCl，300米M（M）氯化钠pH 8.0。使用0.1 mg ml的蛋白质溶液，在JASCO J810光谱仪上记录最终纯化产品的CD光谱（185 nm至260 nm）⁻¹在pH 7.0的磷酸钠缓冲液中，含有25 mM（M）氯化钠。

2.4. 结晶

如前所述，使用笛卡尔机器人（Sulzenbacher）通过蒸汽扩散纳米液滴进行结晶筛选等。, 2002; 文森特利等。, 2003). 简单地说，使用了三种商业工具：向导屏幕1和2（翡翠生物结构）、结构屏幕1和2中以及Stura Footprint屏幕（分子尺寸有限公司）。晶体是在2.0中获得的M（M）硫酸铵，0.1M（M）磷酸盐-柠檬酸盐pH值4.2，蛋白质浓度5.8 mg ml⁻¹凝胶过滤缓冲液中。用二维矩阵中的纳米液滴（Lartigue）对结晶进行优化等。, 2003)沉淀范围为1.8–2.2M（M）硫酸铵和pH值范围为4.0–­4.5（0.1M（M）磷酸盐-柠檬酸盐），导致晶体尺寸为～100×100×80µm（图2).

图2 优化了SARS-CoV Nsp9蛋白晶体。比例尺为100µm。

2.5. 数据收集

晶体在硅油DC200的纯溶液中进行低温冷却。他们使用Quantum ADSC Q4R探测器在束线ID14-EH1、ESRF、Grenoble处暴露。共记录了110个1°振动，晶体到探测器的距离为180 mm，每帧采集时间为9 s。衍射数据与DENZO公司（Otwinowski&Minor，1997年)并减少了标量（合作计算项目，第4期，1994年）).

3.1.大肠杆菌蛋白质表达与纯化

我们在Gateway系统中亚克隆了35个严重急性呼吸系统综合征冠状病毒靶点，包括20个全长蛋白和15个蛋白结构域。迄今为止，已经生成了70个结构体，其中28个表达，14个可溶，5个纯化。其中四个导致了小晶体，其中包括本报告中描述的Nsp9蛋白。硒代蛋氨酸取代的Nsp9的表达是使用蛋氨酸生物合成途径抑制的方法进行的（Doublié，1997). 硒代蛋氨酸蛋白的纯化如上所述进行，并且晶体优化正在进行中。

3.2. 数据收集和整理

Nsp9晶体在ID14-EH1衍射至2.8°（ESRF，格勒诺布尔）。数据集成和缩减表明它们属于P（P）622空间组。 R（右）_{sym（对称）}为5.3%，考虑到数据的冗余性，这是一个很好的值（表1). 沿c（c）轴（00我)，表示空间组是其中之一P（P）6₁22或其对映体 P（P）6₅22.单元间参数为一=b条= 89.7,c（c）=136.7º，这导致V（V）_M（M）值3.1Ω^三 Da公司⁻¹（60%溶剂）中含有两个分子非对称单元（马修斯，1968年). 观察到的中心或非中心强度分布与理论曲线重叠，表明四面体孪晶，通常在三角或六角晶体中观察到的特征并不存在。

3.3. 特征

SARS-CoV Nsp9已纯化为同质性分两步进行。最终产物的身份已通过N末端测序确认。使用凝胶过滤和DLS检查了Nsp9的低聚物状态。前一种技术表明该蛋白质是单体，而DLS分析与表观Stokes半径为26º、等效质量为31 kDa的单分散物种一致，对应于二聚体。这种差异可能与两种技术之间的浓度差异有关。

PSI-Blast搜索检索到7个同源序列，均属于冠状病毒科家庭。他们使用复数（Corpet，1988年)带有标准选项。二级结构预测的一致性JPRED公司（袖口等。, 1998),PSI-预测（麦古芬等。, 2000)和预测蛋白质（罗斯特，1996年)收敛到七倍β-股。使用线程程序执行折叠识别分析3磅/平方米（凯利等。, 2000)和INBGU公司（费舍尔，2000年). 这两个程序都没有检测到任何与Nsp9同源的蛋白质，但收敛到两个七品牌的倍数β-表。一致的是，纯化Nsp9的CD光谱揭示了由大多数β-股（35%）和β-匝数（18%），但也包含15%α-螺旋线。随机邮件段占总数的32%。