2.2.1、。相位统计

在投影密度图出版时呈现的所有项目中，相位统计为图像数据的质量提供了最佳评估标准，因为相位误差直接反映了独立显微照片中结构细节的一致性。过去，至少有三种方法可以用来表示相位统计。

虽然上述三种方法均有效，但方法（1）和（2）可能无法揭示给定样本数据结构的所有方面。例如，通过数据平均获得的FOM（方法1）主要取决于单个测量的信噪比和独立观测的数量。这也适用于“中心相位”误差（方法2），假设结构确实是中心对称的，并且不存在系统误差。图1说明在实践中，这些假设并不一定适用。来自两个非常不同的样品晶体的图像数据，物质Na⁺/H（H）⁺反转运蛋白NhaA（威廉姆斯等。, 1999)和截断间隙连接通道（Unger、Kumar等。, 1997)按顺序组合。正如预期的那样，通过方法（1）获得的总平均相位误差随着独立观测数的增加而稳步减小。相反，增加数据集的大小只会对中心比较的总体平均误差产生微小的改善。只有当投影不是真正的中心对称或存在系统误差，或两者都存在时，才能解释中心相位误差的这种行为。因此，无论是方法（1）还是方法（2）都不能令人满意地描述这些情况下的数据。一个可能的解决方案是提出“组合相位误差”（方法3）。实际上，这涉及根据FOM通过中心相位误差（方法2）调整FOM（基于方法1）_调整后的=（FOM*cosα_{av（平均值）}). 程序绘图然后可用于绘制每个反射的“组合相位误差”（图2). 请注意，程序SCALIMAMP公司（谢特勒等。, 1993)或其衍生物FOMSTATS公司（耶格尔等。, 1999)自动生成调整后的FOM值（FOM_调整后的)无论何时应用中心对称相位约束。这些FOM的使用_调整后的傅里叶反演中的值会导致傅里叶分量的“双重加权”。这种方法的基本原理是，它对最可靠的数据赋予了最高的权重，即定义良好的反射（FOM接近1），与中心对称约束（cosα_{av（平均值）}接近1）。同时，这种方法有效地减少了定义不明确（FOM较小）和/或受到某种系统误差（cos）影响的反射的贡献α_{av（平均值）}很小）。因此，如图2所示，显示每个反射的“组合相位误差”(b条)对相位数据的质量及其与适用约束的符合性进行了全面描述。

图1 投影数据相位误差的特征。相位误差是评估电子晶体学工作中数据质量的最佳工具。图中显示了投影数据的不同类型的总体平均相位误差如何作为所用图像数量的函数表现。通过对间隙连接通道（黑柱；Unger、Kumar等。, 1997)和细菌Na+/H（H）+-反转运蛋白NhaA（灰柱；威廉姆斯等。, 1999). 前三幅图像中的数据是真正未熔化的晶体。在所有其他情况下，只有那些测量值在0.0016°以内−1（间隙连接）和0.005º−1（NhaA）沿z（z）*平均数中包括了。中显示的错误(一)对应于根据以下公式计算的整体绩效数字（FOM）AVRGAMPHS公司.随机数据的误差为90°。中显示的错误(b条)表示平均中心相位误差。该误差反映了平均相位与理论目标值（0/180°）的平均偏差第页6（缝隙连接）和第页22121两个样本的（NhaA）对称性。在这种情况下，随机数据将导致总体偏差为45°。对于缝隙连接，6º分辨率的独立测量总数为179、353、516、596和1266，描述了76个独特的反射。在NhaA的情况下，对368、713、936、1152和1704个单独测量值进行平均，以产生204个独特反射的相位。数据中较小的冗余度和NhaA情况下较低的对称性解释了图中所示的略高的相位误差(一)与间隙连接试样的结果进行了比较。然而，在这两种情况下，整体中心相位误差非常相似，并且随着数据的增加，不会有太大改善。这种意外行为与3D分子变换有关，在这两种情况下，都会在确定投影数据时导致系统错误。这里要得出的结论是，使用大型且高度冗余的数据集将为相位值提供高度显著的平均值。然而，平均值的重要性及其与适用阶段约束的符合性并不一定相互关联。

图2 组合相位误差作为投影数据质量的度量。如图1所示从平均数据中获得的相位误差，以及平均相位角与适用理论目标值的偏差，都无法直接测量沿z（z）轴。在这些情况下，“组合相位误差”可能是提供完整数据质量说明的最佳解决方案。利用间隙连接试样的数据编制图2。如所示(一)是使用程序进行数据平均得到的每个反射的FOMAVRGAMPHS公司。每个反射对应的“组合相位误差”如所示(b条). 反射的“组合相位误差”定义为“组合误差”（°）=cos−1（FOM*成本αav（平均值）)，其中FOM是绩效数字（范围从0到1），以及αav（平均值）是数据平均后的平均相位角。FOM和αav（平均值）计算公式为AVRGAMPHS公司根据其定义，“组合相位误差”既反映了反射平均相位角的统计显著性，也反映了其与适用目标相位值的偏差。此外，术语（FOM*cosαav（平均值）)如果在傅里叶求和中实施中心对称相位约束，则通常用作结构因子的权重。此过程将不可靠反射的影响降至最低。出于打印目的，减少框大小表示错误的增加。方框内的数字分配给相位误差，如下所示：1<8°，2<14°，3<20°，4<30°。对于由小方框尺寸编码的错误，即5<40°、6<50°、7<70°和8<90°，不会写出数字。在这两种表示中，90°的误差表示反射的相位不显著。

2.2.2. 对称

在大多数情况下，晶体对称性在投影密度图的最终计算中强制执行。无论何时，都应证明对称平均值的有效性。对于未染色的样品，这可以通过分析未熔化晶体数据中的相位关系来实现(全空间程序；瓦尔普埃斯塔等。, 1994). 然而，只有当相位关系符合密度图计算所选的最高分辨率时，才应强制执行如此确定的任何对称性。否则，应在不进行对称平均的情况下显示地图，即平面内组第页1.这种策略似乎很合理，主要有两个原因：对比度传递函数和试样倾斜或两者的相位数据校正不准确会导致所需的相位关系丢失。特别是在厚试样（>100°）的情况下，试样的非自愿倾斜可能会使对称性的强制执行无效。例如，晶体倾斜2–3°就足以完全消除第页6无标签截断间隙连接通道（Unger、Kumar）图像中的对称性等。, 1997). 在这种情况下，厚度为～150º的试样即使在晶体倾斜0.5°的情况下也会导致部分对称性丧失。这种情况需要考虑倾斜几何，以便生成真实的投影数据。对于较薄的试样，这种影响不太明显，但应注意ALLSPACE公司无法检测对称性。除了真正缺乏对称性之外，后者可能只是被模糊了。

2.2.3. 反转的使用B因素

过去，大多数样品的结晶区域太小(即小于～0.5×0.5µm），以便收集电子衍射数据。然而，可以计算密度图，因为图像提供了相位和振幅信息。然而，与电子衍射数据相比，由于对比度传递函数和其他降低图像对比度的因素（例如样品充电或移动）的影响，图像衍生振幅的准确性较差。因此，图像衍生振幅在中高分辨率下显示出明显下降（参见Henderson，1992)，导致计算密度图中精细结构细节的减少。原则上，这种影响可以通过应用逆函数来克服B将功率恢复到较高分辨率项的因子（“温度因子”）。然而，此过程将以相同的保真度放大噪声。因此，只有当高分辨率反射的相位根据其可靠性得到很好的确定和加权时，才应使用图像锐化。如果这适用，则使用逆B因子可能非常有用。如图3所示(一)和3(b）显示了截短间隙连接通道的投影密度图的并排比较。锐化后结构细节的显著增加经常引起对潜在伪影的担忧。随之而来的问题是：B允许的因素以及如何确定B因子对于任何给定的数据集都是最佳的。根据过去的使用情况，B−300至−600º的系数²似乎需要/足以将适当的权重恢复到5-10°区域的图像衍生振幅。为了透视这些数字，图3中添加了第三个面板(c). 图的这一部分显示了基于数据的相同投影，其中所有振幅都设置为单位和“组合相位误差”的余弦（见图2b条)在傅里叶求和中用作权重。这种处理消除了110倍的振幅差异，该差异将数据集中最强的反射与6至7.5°之间反射的平均振幅分开。相比之下，最大提升幅度为~11倍(B因数−350º²)用于图3所示地图的计算(b条). 毫无疑问，单位振幅的使用（图3c)强烈强调了投影河道结构的主要特征，并引入了靠近二重轴和三重轴的其他强密度特征。然而，请注意图3中地图的整体外观(b条)和3(c)尽管用于计算的振幅差异很大，但它们仍然非常相似。有趣的是，并非图3中的所有其他密度特征(c)都是人工制品。3D重建（Unger等。, 1999)揭示了三重轴周围的额外密度对应于其中一个跨膜的一部分α-螺旋线。毫无疑问，使用单位振幅而不是实际振幅是一个极端。然而，无论振幅如何处理，密度图中的大多数信息仍然有意义，这一事实强调了B因子是任意的，不需要微调。此外，使用B只要相位确定并适当加权，系数就很小。然而，在分辨率范围为5到7º之间缩放数据时需要谨慎，因为分子变换在该区域可能本质上较弱。观察到这种现象的两个例子是细菌视紫红质和水通道蛋白。将分子变换的特征误认为是成像伪影，并试图对这些振幅进行不适当的提升是无益的。当接近近原子分辨率时，更加谨慎似乎是合适的，因为图像数据的退化可能不再遵循简单的指数。幸运的是，在这些情况下，晶体几乎总是足够大，可以收集电子衍射数据，从而避免了与分辨率相关的图像数据退化相关的问题。

图3 反向的影响B投影密度图上的因素。反向B在没有电子衍射数据的情况下，电子晶体学中经常使用因子来克服图像衍生振幅的分辨率依赖性下降。显示了单个截断间隙连接通道的三个投影密度图。每幅地图的标称分辨率为6º。反向B因素B=0和−350º2用于(一)和(b条)分别是。图中所示的地图(c)在将所有振幅设置为单位并使用（FOM*cos）后计算αav（平均值）)（见图2b条)作为傅里叶反演中的权重。所有三张地图都以0.25的增量绘制轮廓σ.对于高于平均值的等高线水平，绘制实线。密度图是使用中央对手方清算所4程序包（协作计算项目，1994年第4期). “锐化因子”（sf）为sf=exp[−B/(4d日*d日)]，其中B是B因素和d日是分辨率，单位为奥。例如，B= −350 Å2如果FOM为1，则将6°处的反射振幅增加约11倍。对于FOM<1，增压将降至（FOM*sf）。类似地，应用（FOM*cosαav（平均值）)（见图2b条)作为具有双重约束的平面组中的权重，可以确保全部锐化仅应用于最可靠的反射。在这种情况下，即使振幅与图中所示的振幅一样不正确(c)将产生一个“密度分布”，它仍然正确地描述了投影结构的主要特征。在间隙连接通道的情况下，这些特征是由六个大致圆形和旋转交错的密度组成的两组，这些密度被连续的密度带分隔开。

2.2.4. 差分图计算

低温电子显微镜的一个优点是可以控制晶体样品的环境。这允许研究与蛋白质功能相关的构象变化，只要变化发生的时间尺度比冷冻预保存过程慢，即几毫秒。然而，分析2D晶体中的构象变化是一项具有挑战性的工作。此外，即使已知3D结构，在大多数情况下，投影中映射的差异也很难解释。Lindahl&Henderson（1997）对电子衍射数据可用的情况进行了评估). 他们的论文得出的结论是，仅考虑振幅或相位的变化就足以确定结构的局部变化。然而，如果结构变化蔓延到整个单位电池只有真正的矢量差才能明确地描述这两种结构之间的差异。在这种情况下，所比较的每个状态都需要一组完整的振幅和相位。如果投影是中心对称的，事情就更复杂了，因为在这种情况下，相位变化不可能很微妙，而总是以180°摆动的形式出现。除非结构变化很大，否则这可能会导致仅对弱反射观察到相位变化的情况。由于这些反射比强反射的噪声更大，因此很难确定观察到的变化是否有意义。如果另外使用图像衍生的振幅数据来计算差异图，那么观察到的密度分布差异是否显著似乎越来越令人怀疑。如何呈现这种投影差异图需要进一步讨论。在所有数据都是从图像中获得的情况下，基于“仅振幅”、“仅相位”和真实矢量差的独立差分图的计算可以提供一种摆脱这种困境的可能方法。如果全矢量差分结合了在“仅振幅”和“仅相位”差分图中清晰可见的贡献，则即使仅图像数据也足以正确描述差异。然而，如果全矢量差仅代表振幅或相位的变化，则结果可能不显著。

2.3.1. 中等分辨率的3D密度图–为什么有用？

细菌视紫红质、捕光复合物II和微管蛋白的原子模型表明，电子晶体学可以生成高分辨率密度图。然而，要获得接近原子分辨率的大型2D晶体是很困难的。然而，与X射线晶体学相比，即使是较小且有序度适中的2D阵列也可以在5-10埃区提供有用的数据。这可能有两个原因。首先，平移晶格无序可以通过计算进行纠正，其次，图像衍生的相位和振幅足以获得中等分辨率的可解释密度图。特别是在膜蛋白的情况下，这种图谱仍然有用，因为其结构通常比可溶性蛋白的结构简单。例如，典型膜蛋白的中间分辨率图将确定以下内容。

此外，中等分辨率密度图可能在以下方面有用。

最后，中间分辨率地图还为以下内容提供了实验约束。

2.3.2. 试样倾斜

作为上一节的延续，出现了一个问题，即需要在多大程度上确定一个结构才能对上述任何应用有用。答案是，这在很大程度上取决于实际结构和所提出的问题。例如，假设完整膜蛋白的跨膜结构域都是α-螺旋形。此外，让这些螺旋线中任何一条相对于膜平面的最大倾角为30°。在这种情况下，如果主要目的是证明，平面内分辨率高于10º且试样倾斜范围在25–30°之间就足够了α-跨膜结构域的螺旋特征及其排列可视化。如图4所示从缝隙连接通道的两个跨膜部分之一显示出平行于膜平面的相同横截面。而试样仅倾斜5°（图4一)没有解决两个更高倾斜螺旋线中的任何一个，总的“故事”出现的倾斜角度只有15°。最后，在样品倾斜30°时，所有跨膜α-螺旋线被清楚地分辨出来。然而α-由于数据的大“缺失锥”导致整个结构的伸长，螺旋线仍然未知。相应的低垂直分辨率使模型构建变得困难，因为这样的练习在很大程度上取决于精确的密度约束。为了促进高效建模，需要约4.5–5º的分辨率(xy公司平面）和6–7°（沿z（z）). 接近这些目标值时α-螺旋重复变得清晰可见，允许明确放置规范α-螺旋线进入密度图。然而，要获得明显优于10°的垂直分辨率，需要从倾斜角度超过40°的样品中获得良好的数据，这是不容易实现的。为了可视化有序连接回路或α-平行于膜平面的螺旋线。类似地，膜蛋白的大球状外结构域以及可溶性蛋白的2D晶体要求更高。在这些情况下α-和β-可能存在二级结构，并且缺乏观察到的优先取向α-横跨脂质双层的螺旋。

图4 试样倾斜对定义的影响α-螺旋。缝隙连接通道直接连接两个相邻的电池。通道的12个子单元中的每一个子单元都采用α-膜跨越部分内的螺旋褶皱（Unger等。, 1999). 这个α-只要分子的数据样本视图的倾斜角等于最大倾斜角，螺旋就可以被解析α-结构中的螺旋线。为了说明这一事实，根据对应于最大样本倾斜的数据计算了三个3D密度图(一) 5°, (b条)15°和(c)分别为30°。一个反向B因数−350º2用于校正图像衍生振幅的分辨率依赖性下降。图中所示为每个地图的相同横截面。各部分按以下步骤绘制轮廓σ用实线表示高于平均值的等高线。即使试样倾角只有5°，也足以解决两个α-螺旋线。然而，倾斜程度越高α-螺旋线保持不明确。包含高达15°的晶体倾斜数据完全解决了这两个问题α-几乎垂直于膜平面的螺旋线。此外，这两个高度倾斜α-螺旋线开始被识别。在样品倾斜30°时，垂直分辨率足以分辨所有α-螺旋线。然而横截面穿过最倾斜的α-螺旋线的形状仍然是椭圆形的，这表明其倾斜度非常接近数据所涵盖的最大试样倾斜度。添加来自更高倾斜晶体的数据将改善每个α-螺旋线。然而，从3D密度图的这一部分得出的主要结论将保持不变，即六个连接蛋白亚基中的每一个都有四个α-螺旋状跨膜结构域。

总之，在判断数据集的充分性时，需要根据具体情况考虑样本的实际结构和提出的问题。最简单的情况是完整膜蛋白的跨膜结构域是唯一的α-螺旋形。脂质双层施加的限制条件表明，只有5–­10º的平面分辨率和倾斜角达到最高度倾斜的倾斜角α-结构中的螺旋是首次可视化分子结构所必需的。在所有其他情况下，要求都更严格。

2.3.3. 数据冗余

如§所述2.3.1，中等分辨率地图是有用的工具，只要它们定义明确。实现这个目标需要数据冗余来支持迭代精炼像散和倾斜几何等图像参数。反过来，这些细化提高了拟合晶格线的质量，为结构因子提供了更可靠的相位估计。实际上，五到十倍的冗余为数据提供了坚实的基础精炼和结构计算。然而，到底需要多少图像取决于它们的质量、样本的厚度和晶体对称性。通常，对于具有高度对称性的标本，所需的图像较少。然而，即使在这些情况下，也只能通过包含每个试样倾斜度的多个图像的数据来获得足够多的独立测量值。这尤其适用于倾角>30°的情况，其中互易空间快速增长，而来自单个图像的数据质量往往恰恰相反。数据表示中的一个恼人习惯是列出数据收集过程中使用的标称最大倾斜度，而不评估互易空间已采样。当然，如果图像是以>45°的倾斜角度记录的，那么它看起来很吸引人，也可能更容易被审查者接受。然而，如果这些图像中的分辨率不是各向同性的，这又有什么用呢(即垂直于倾斜轴的方向较差）或实际测量次数不足以支持晶格线的可靠拟合？因此，作者应提供有关“有效样本倾斜”的信息互易空间已有效采样。与电子晶体学中的其他问题一样，“有效”的定义仍有待进一步讨论。在确定之前，作者应评估其拟合数据的完整性。例如，将相位误差小于60°的拟合结构因子的数量与给定分辨率和一组最大样本倾角的理论上可能的结构因子的数量进行比较，将表明互易空间开始崩溃。此外，有必要对重建的有效分辨率极限进行最终评估，以确定在不过度解释地图的情况下可以得出什么结论。

2.3.4. 受限晶格线分辨率和处理的评估

对于投影密度图，从格线拟合中获得的平均相位误差是衡量数据质量的最佳方法。根据我的经验，一旦通过以下公式计算出整体加权相位误差，中等分辨率密度图的外观就会消失LATLINE公司（阿加德，1983年)接近20°。整体相位误差较高（尤其是超过30°）的可能原因是数据分布稀疏或图像参数不够精细，或两者兼而有之。在这些情况下，需要在分辨率箱中列出相位误差。中等分辨率密度图的一个主要缺点是缺乏定义其有效分辨率的明确标准。这尤其适用于垂直分辨率，因为数据的“缺失锥体”将低于平面分辨率。例如，在平面内分辨率为6º时，沿z（z）根据试样的“标称”和“有效”最大倾斜度，轴可以在～7°和25°之间变化（参见§2.3.3). 在这些情况下，如何评估垂直分辨率仍有待讨论。一个可能的解决方案是分析实验数据的点扩散函数。过去，通过将所有相位设置为0°，所有振幅设置为1，并使用实验FOM（计算公式为LATLINE公司)在傅里叶反演中。如果数据是各向同性且完美的，则此过程将生成以原点为中心的球体。然而，缺失和/或不完美的数据会导致球体变形（亨德森等。, 1990; Unger&Schertler，1995年). 畸变可以沿着重建的主平面进行分析，从而给出有效分辨率的量化度量。这种方法的优点是可以很容易地模拟任何分辨率/最大倾斜度截止值的“完美”数据。该模拟提供了沿所有方向的最佳可能分辨率的估计值，从而与实验数据的结果进行了有用的比较。这种比较的示例如图5所示.计算点扩散的传统方法的缺点(即将所有振幅设置为一）忽略了实验振幅数据。将所有振幅设置为统一事实上的模仿了一个非常重要的B系数（另请参见图3c). 在这些情况下，FOM值不佳或缺失几乎不会对点扩散函数产生影响，因此，这在很大程度上成为衡量结构因素是否存在的指标。这可能导致对垂直分辨率的过高估计，特别是对于对某些晶格线施加相位约束的双面平面组。后者不能得到足够的重视，因为网格线拟合程序LATLINE公司将FOM=100（=完美测量）分配给具有适用阶段约束的结构因子，而不管实际数据的质量和分布如何。因此，闩锁将沿约束晶格线生成明显完美的数据点，即使测量值过于稀疏和/或有噪声，无法验证拟合。包含这些点不仅会导致对垂直分辨率的估计过于乐观，还可能会在3D密度图中引入失真。为了避免这些问题，需要采取两个步骤。首先，需要手动截断所有晶格线（约束和非约束）的数据，以排除测量值分布过于稀疏的区域，从而无法进行有意义的曲线拟合。其次，约束格线的测量需要隔离，然后在平面组中拟合第页1.如果实施阶段约束，则任何约束的FOM结构系数应进行调整以反映组合相位误差，如投影数据所述。然而，请注意，在某些双边平面群中，相位沿某些晶格线限制为±90°。在这些情况下，拟合得到的FOM应乘以相位角的正弦而不是余弦，因为在这种情况下，0或180°的相位角是“随机的”。独立于这些建议，问题仍然是在计算点扩散函数时使用单位振幅是否值得称赞。为了将来使用这种方法，最好保留实验振幅和FOM，将所有相位设置为0°，并应用相同的反向B用于计算最终3D密度图的点扩散系数。应用于图5所示的示例，保留实验振幅并使用B因数−350º²（见图4)垂直分辨率估计为～27º。这与使用单位振幅时获得的～20º相比“不利”（图5b条). 源于同一组原始数据，垂直分辨率估计值的差异强调了为什么这个问题需要进一步讨论。在确定明确的指导方针之前，似乎应该明确说明如何估算中等分辨率3D地图的分辨率极限。

图5 通过点扩散函数评估分辨率。通过比较模拟完美数据集和实验数据计算的点扩散函数，可以评估重建的有效分辨率（Unger&Schertler，1995). 使用7.5º的平面分辨率和30°的最大试样倾斜度兹克斯的节(一)模拟的完美数据集和(b条)给出了实验数据。间距为40º的网格x个和z（z）叠加在截面上以提供内部比例。球体沿z（z）可以清楚地看到，这是数据“缺失锥”存在的特征。将球体缩放到相同的最大密度，并在峰的一半高度设置单个正轮廓来绘制截面轮廓，以满足Raleigh分辨率标准。在这个高度上，山峰沿x个1.5的转换系数将7.5º的标称分辨率与半高宽度相关联(即半高时的标称分辨率/宽度=7.5º/5º）。该转换因子可用于根据点扩展函数的半宽度确定有效分辨率。因此，17.2º是最佳的垂直分辨率(即沿着z（z）)平面内分辨率为7.5º，试样最大倾斜角度为30°（=1.5×11.5º）。应用于实验数据(即将所有振幅设置为一，将所有相位设置为0°，并使用通过以下方式获得的FOMLATLINE公司作为傅里叶反演中的权重），获得了20.4º的有效垂直分辨率。