1.简介

2003年，一种以前未经确认的冠状病毒，称为SARS冠状病毒（SARS-CoV），是导致全球疫情的病原，导致大约8000例报告病例和800例死亡（Drosten等。2003年; 克西亚泽克等。2003年; 奎肯等。2003年; 佩里斯等。2003年)，它的出现归因于动物与人类的种间传播（普伦蒂斯等。, 2004). 冠状病毒的特征是具有最大已知基因组的包被阳性标记RNA病毒，属于该属冠状病毒家庭的冠状病毒科（马拉等。2003年; 罗塔岛等。2003年). 迄今为止，已鉴定出约26种冠状病毒，根据基因组序列和血清学反应可分为三个不同的组（Lai和Holmes，2001）; 西班牙和卡瓦纳，2004年). 在SARS爆发之前，研究人员很少关注冠状病毒蛋白质的结构-功能研究，因为这种病毒主要导致动物的严重疾病，但在人类中相对温和的疾病，例如人类冠状病毒引起的普通感冒。虽然在过去20年左右的时间里，人们对模型冠状病毒进行了广泛的研究，但对SARS爆发前病毒组装和病毒复制/转录等潜在机制却知之甚少。目前没有获得许可的药物，对抗冠状病毒感染的策略主要依赖SARS爆发前的疫苗。

2003年，严重急性呼吸系统综合征（SARS）在全球流行，对全世界产生了深远的社会和经济影响，尤其是在疫情发源地中国。政府和资助机构提供了更多的支持；研究人员努力了解SARS冠状病毒的起源、与宿主的相互作用以及冠状病毒复制和转录的机制；在开发疫苗或抗病毒化合物以预防SARS-CoV感染方面已经做了大量工作。到目前为止，结构生物学在为SARS-CoV蛋白的功能分配和抗病毒药物的发现提供信息方面发挥了重要作用（Bartlam等。, 2005).

与中国的许多研究人员一样，一旦疫情的严重性变得明显，我们小组就开始研究SARS-CoV。采用结构蛋白质组学方法，在中国政府和资助机构的大力支持下，启动了一个大型项目。在疫情爆发和公众意识增强后，其他大型项目，如SEPSDA（中欧SARS诊断和抗病毒项目，网址：http://www.sepsda.org/)由欧盟和FSPS（SARS冠状病毒相关蛋白质的功能-结构蛋白质组学，http://visp.scripps.edu/SAR/)由NIAID和NIH资助。它们的大部分活动领域包括结构生物学，这得益于为结构基因组学/蛋白质组学开发的高通量技术。在这篇综述中，我们将重点介绍SARS冠状病毒蛋白的结构-功能研究所取得的成就，以及随后针对SARS-CoV和其他冠状病毒的治疗干预策略。

2.SARS冠状病毒

SARS-CoV基因组约为29.7 kbp，由至少14个功能开放阅读框（ORF）组成，编码28个蛋白质，涵盖三类：两个大的多蛋白（pp）1a和（pp；病毒组装所必需的四种结构蛋白[S、E、M和N蛋白（见表1）]；和八种辅助蛋白，它们在组织培养中被认为不重要，但可能在受感染的宿主中提供选择性优势（表1，图1)（马拉等。2003年; Rota公司等。2003年; Ziebuhr，2004年). 28个SARS-CoV蛋白中的许多与其他蛋白质（包括来自其他病毒的蛋白质）具有低序列相似性，这表明它们的独特性并妨碍基于同源性的功能分配。在这28种SARS-CoV蛋白中，有12种蛋白质结构（X射线结晶学或核磁共振）可从蛋白质数据库中获得，从而为针对SARS冠状病毒的治疗干预提供了起点。

图1 SARS-CoV基因组。橙色和蓝色三角形代表PL的解理位点赞成的意见和M赞成的意见分别是。

3.复制酶复合体

SARS-CoV复制酶基因编码16种具有多种酶功能的非结构蛋白（nsp）（Snijder等。2003年)，已知或预测包括多种酶，这些酶是加号RNA病毒复制机制的常见组成部分。这些酶在宿主细胞中通常不可用或不易获得，因此被确定为抗SARS药物设计的潜在靶点。它们包括：一种RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp，nsp12），一种3C样半胱氨酸蛋白酶（M^{赞成的意见}或3CL^{赞成的意见}，nsp5），一种木瓜蛋白酶样蛋白酶（PL^{赞成的意见}，nsp3）和超家族1样解旋酶（HEL1，nsp13）。复制酶基因还编码在阳性RNA病毒中不太常见的蛋白质，这些蛋白质指示3′-5′外核糖核酸酶活性（ExoN同源物，nsp14）、内核糖核酶活性（XendoU同源物，nsp15）、腺苷二磷酸核糖1′-磷酸酶活性（ADRP，nsp3）和核糖2′-哦-甲基转移酶活性（2′-O-MT，nsp16）（斯奈德等。2003年). 因此，这些酶可能与冠状病毒复制和转录的独特特性有关。最后，复制酶基因编码另外九种蛋白质，对其结构或功能知之甚少。鉴于复制酶蛋白在病毒生命周期中的重要作用，阐明其功能以及它们如何相互作用形成复制酶复合物对于确定抗病毒化合物的设计策略至关重要。然而，为了发现抗CoV疗法，还需要对复制酶复合物进行进一步的结构和功能研究。

Nsp5，通常被称为主要蛋白酶（M^{赞成的意见})或3CL^{赞成的意见}（由于其与3C蛋白酶的相似性），是SARS-CoV蛋白中研究最广泛的。它晶体结构我们小组（Yang）在2003年疫情爆发后仅仅几个月就报告了疫情等。2003年)以及位于圣地亚哥的Structural GenomiX公司（图2一)虽然是第一个冠状病毒M^{赞成的意见}结构是从2002年的传染性胃肠炎病毒（TGEV）中确定的（Anand等。2002年). M^{赞成的意见}作用于复制酶多聚蛋白14个裂解位点中的11个，以释放复制酶复合物的单个成分，因此是发现抗病毒疗法的一个至关重要的靶点。冠状病毒M^{赞成的意见}结构的特征是两种类糜蛋白酶β-桶结构域，类似于其他病毒蛋白酶，和一个额外的C末端球状体α-螺旋域（Anand等。, 20022003年; 杨等。2003年). M^{赞成的意见}作为二聚体发挥作用，并依赖C末端结构域进行二聚（图3一)（史等。, 2004). 催化Cys–His二联体和底物结合位点位于域I和域II之间的缝隙中。

图2 SARS-CoV复制酶蛋白结构。(一)nsp5，M赞成的意见; (b)nsp3 ADRP结构域；(c（c）)nsp3损益赞成的意见领域；(d日)nsp7；(e（电子）)nsp8；(如果)nsp9；(克)nsp10；以及(小时)nsp15。所有结构均以带状表示形式显示，并根据二级结构进行着色(α-螺旋红；β-股黄；线圈为绿色）。Nsp8显示了两个叠加的构象。

图3 (一)M赞成的意见二聚体与结合肽模拟酯抑制剂N3。M（M）赞成的意见单体以带状表示，并用红色和蓝色表示。肽模拟酯抑制剂（每个单体一个）以棒状表示并呈绿色。(b)nsp7–nsp8超级复合体。nsp7–nsp8复合体显示在功能区表示中。Nsp7呈绿色，nsp8的一个构象呈蓝色，nsp9的第二个构象为橙色。(c（c）)S蛋白融合核心。从左至右显示1WYY（杜克罗伊等。, 2005)，2BEZ（Supekar等。, 2004)和1WNC（徐等。, 2004). 中央HR1肽类以色带表示形式显示，颜色为红色、蓝色和绿色。人力资源2肽类以黑色显示。N端子和C端子已贴上标签。(d日)S蛋白RBD与细胞受体ACE2结合。该复合物结构以带状表示，ACE2受体呈绿色，S蛋白受体结合域（RBD）呈蓝色，S蛋白质受体结合基序（RBM）呈红色(e（电子）)S蛋白RBD与80R抗体结合。复合物结构以带状表示，80R抗体呈品红色，S蛋白RBD呈蓝色，S蛋白RBM呈红色(d日). (如果)S2m，一种严重急性呼吸系统综合征冠状病毒基因组中严格保守的RNA元件。S2m以棒状表示，并根据以下方案进行着色：类似GNRA的五环，为黄色；A型RNA螺旋为蓝色和品红色；三嘌呤不对称凸起为红色；七核苷酸泡沫是绿色的。

SARS-CoV M的底物特异性^{赞成的意见}在生物化学和结构上都有很好的特征（Hegyi和Ziebuhr，2002; 阿南德等。2002年2003年; 杨等。2003年, 2005). 全冠状病毒M^{赞成的意见}s在P1位置具有绝对保守的Gln残基，而小残基如Ala、Ser和Gly则在P1′位置保守（Ziebuhr等。, 2000). 在SARS-CoV M的P2位置^{赞成的意见}，Leu是首选，尽管其他疏水残基，如Phe、Met和Val，偶尔也会占据这一位置。P3位置不需要侧链特异性，因为P3的侧链朝向散装溶剂。小残基，如丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和脯氨酸优先位于P4位置。冠状病毒M的结构信息^{赞成的意见}迄今为止，研究人员设计针对SARS-CoV M的抑制剂将被证明是有用的^{赞成的意见}.

许多策略被用来发现针对冠状病毒M的抑制剂^{赞成的意见}具有纳摩尔或低微摩尔结合亲和力[见Yang等。(2007)查看]。我们小组基于SARS-CoV M的天然N-末端高压蒸煮底物设计了肽模拟酯抑制剂^{赞成的意见}并使用基于结构的方法进行优化（图3一)（杨等。, 2005). 此外，由于所有三种冠状病毒抗原群的活性位点都具有显著的保守性，我们的化合物对所有冠状病毒M都具有广谱活性^{赞成的意见}.发现对冠状病毒M有活性的其他类化合物^{赞成的意见}包括苯胺类（什叶等。, 2005)六氯酚及其类似物（Hsu等。, 2004; 线路接口单元等。, 2005)、天然多酚（Chen，Lin等。, 2005)、靛蓝衍生物（陈、王等。, 2005)，七叶皂苷（一种血清素激动剂）（Chen，Gui等。, 2005)、干扰素（Tan等。, 2004)，酮-谷氨酰胺类似物（Jain等。, 2004)、锌共轭化合物（Hsu等。, 2004)芳基硼酸化合物（Bacha等。, 2004)槲皮素-3-b-半乳糖苷及其合成衍生物（Chen等。, 2006)，工厂萜类和木质素（温等。, 2007)，苯并三唑酯类（吴）等。, 2006)香豆素衍生物（Hamill等。, 2006)和其他化合物（Kaeppler等。, 2005; 卢等。, 2006; 济等。, 2006). 除了活性位点抑制剂外，第二种策略是抑制M的二聚化^{赞成的意见}从而废除其活动。该方法于2004年首次提出（Shi等。, 2004)和一种这样的抑制剂，一种基于SARS-CoV M设计的八肽^{赞成的意见}N末端序列，后来报道（Wei等。, 2006). 这项工作以及我们自己的工作表明，肽模拟物的设计是设计针对冠状病毒M的抗病毒治疗药物的一种有效方法^{赞成的意见}.

Nsp3是一种由1922个氨基酸组成的大型多域蛋白，由类木瓜蛋白酶（PL）在两个位点对pp1a多聚蛋白进行蛋白水解裂解产生^{赞成的意见}). 已确定nsp3功能酶域的两个晶体结构：具有ADP-核糖-1〃′-磷酸去磷酸化（ADRP）活性的“X”域（Saikatendu）等。, 2005; 埃格洛夫等。, 2006)和木瓜蛋白酶（PL^{赞成的意见})域（Ratta等。, 2006). “X”结构域，也称为ADRP结构域，在所有CoV（Putics）中都是保守的等。, 2005)并且在结构上与宏观H2A样折叠蛋白相关（图2b). 有趣的是，Egloff及其同事的工作表明，这个“X”结构域实际上具有较差的ADRP活性，并能有效地结合聚（ADP-核糖）（Egloff等。, 2006)其在病毒生命周期中的作用尚不清楚。冠状病毒通常具有两种木瓜蛋白酶（PL^{赞成的意见})nsp3中的结构域，称为PL1^{赞成的意见}和PL2^{赞成的意见}然而，SARS-CoV只编码一个PL^{赞成的意见}域。它的结构被发现有一个“拇指-手掌-手指”折叠，与已知的氘化酶有关（图2c（c）). 然而，nsp3 PL的某些关键特性^{赞成的意见}包括锌结合基序和泛素样N末端结构域，将其与其他特征去泛素酶分离。nsp3 PL的可用性^{赞成的意见}结构有助于描述共识（LXGG）裂解位点的蛋白水解过程，并在分子水平上提供了氘化机制的细节，表明该酶具有重要的双重作用。

我们小组鉴定了两种非结构蛋白nsp7和nsp8之间的相互作用，并随后测定了晶体结构nsp7–nsp8蛋白-蛋白复合物显示出一个复杂的中空圆柱形支架的形成，该支架由8个nsp7拷贝和8个nsp拷贝组成（翟等。, 2005). Nsp7（图2d日)，nsp8（图2e）和nsp7–nsp8复合体（图3b)它们都具有新颖的结构，nsp8以两种不同的构象存在于结构中。圆柱形nsp7–nsp8结构的内部尺寸和静电特性使其能够包围核酸，这表明nsp7-nsp8复合物可能是RNA-依赖性RNA聚合酶（nsp12）的加工因子。Imbert及其同事的后续研究（Imbert等。, 2006)据报道，除了nsp12外，nsp8还构成了第二个RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），该聚合酶包括在所有RNA病毒中保守的RdRp结构域。进一步的活性分析证实，nsp8识别ssRNA冠状病毒基因组中的特定短序列，很可能作为一种引物酶催化合成依赖于引物的nsp12的RNA引物，这是冠状病毒的一个独特特征。有趣的是，最近的一项研究也表明nsp8可以与orf6辅助蛋白（Kumar）相互作用等。, 2007)这意味着SARS-CoV的复制涉及许多蛋白质的相当复杂的网络。

2004年报道了nsp9的晶体结构（Egloff等。, 2004; 萨顿等。, 2004)并确定了其作为生物单位为二聚体的单链RNA结合蛋白的未知功能。蛋白质的核心结构是开放的六链β-桶让人联想到但与核酸结合OB（寡糖/寡核苷酸结合）折叠无关（图2如果). 对结构同源性的搜索表明，nsp9与丝氨酸的某些亚结构域相似蛋白酶，包括SARS-CoV M的域II^{赞成的意见}.它们与小核糖核酸病毒3C的相似性蛋白酶，其特征是一个保守的RNA结合基序，表明nsp9也应结合ssRNA。除了在病毒复制周期中的作用外，nsp9的可能功能可能是在复制和转录过程中稳定新生和模板RNA链，以保护它们免受核酸酶加工的影响，或在诸如RNA处理等基础绘制驱动的过程中。

SARS-CoV nsp10已被确定为双十聚体（Su等。, 2006)作为一个单体（约瑟夫等。, 2006). 单体结构具有新颖的折叠，包含两个锌指，其序列基序为C-(X（X）)₂–C–(X（X）)₅–H–(X（X）)₆–C和C-(X（X）)₂–C–(X（X）)₇–C–(X（X）)–C（图2克). 这些锌指基序在三个冠状病毒群中严格保守，这意味着nsp10在所有冠状病毒中都具有重要功能，PFAM搜索结果与以前未经特征化的HIT型锌指蛋白相匹配。虽然锌指蛋白通常在转录中发挥作用，但nsp10在病毒生命周期中的确切功能仍有待确定。在SARS-CoV基因组中，nsp10位于RNA-相互作用蛋白nsp8和nsp9旁边，这表明nsp10也应该与核酸相互作用。然而，我们的实验和Joseph及其同事的实验发现，nsp10与ssRNA和dsRNA之间只有微弱的亲和力。还需要进一步的工作来确定我们小组确定的SARS-CoV nsp10寡聚状态的重要性。我们使用nsp10和nsp11的构建物进行结晶，尽管在随后的结构中没有观察到nsp11，一种11氨基酸肽（Su等。, 2006). nsp11在病毒复制和转录中的确切功能尚不清楚。

Nsp15是一种XendoU核糖核酸酶，已从SARS-CoV（Ricagno）中测定等。, 2006)小鼠肝炎病毒（MHV）（Xu等。, 2006)以活性六聚体形式，从SARS-CoV作为非活性单体（约瑟夫等。, 2007). Nsp15是XendoU内切核糖核酸酶家族的第一个成员，为该酶家族提供了第一个结构和机械特性。nsp15单体结构具有新颖的折叠，由三个子结构域组成：一个由两个α-三股螺旋线β-板材；中间区域包括混合β-薄板，两个更小β-床单和两个短床单α-螺旋线；和由两个β-床单和五张α-螺旋（图2小时). 在Joseph及其同事报道的nsp15的缩短单体结构中，由于缺少单体-单体相互作用，催化环翻转回来占据活性位点间隙。鉴于nsp15在病毒生命周期中的关键重要性，因此它是抗病毒药物设计的一个有吸引力的靶点。抑制剂设计的潜在策略包括活性位点抑制剂、肽模拟物或模拟nsp15催化环的非肽基化合物，以及破坏六聚体物种形成的化合物。

4.结构蛋白

虽然SARS结构生物学的大部分工作都集中在非结构蛋白上，其中包括几个对治疗药物设计有吸引力的保守靶点，但其他研究都集中在结构蛋白上。严重急性呼吸系统综合征冠状病毒基因组编码驱动细胞质病毒组装所需的四种结构蛋白：刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）和包膜蛋白（E）。最近，两种最初标记为辅助蛋白的蛋白质被重新分类为结构蛋白。Orf3a被认为是一种具有三个跨膜螺旋（Ito）的次要结构蛋白等。, 2005; 沈等。, 2005)报告表明，它与棘突蛋白相互作用，并可能影响其在宿主细胞中的贩运（Tan，2005). Orf7a是一种在感染SARS病毒的宿主细胞膜表面表达的完整膜蛋白，也被认为是一种结构蛋白（黄等。, 2006). 尽管全长蛋白的功能尚不清楚，但orf7a的可溶性管腔结构域的结构已经确定（Nelson等。, 2005).

Don Wiley及其同事利用对流感血凝素（HA）的全面研究，提出了I类融合蛋白介导包膜病毒和宿主细胞膜融合的经典机制（Skehel&Wiley，2000; Eckert&Kim，2001年). 自那时以来，通过对正粘病毒、逆转录病毒、副粘病毒和丝状病毒等病毒家族的广泛结构研究，建立了一种常见的融合机制（Eckert&Kim，2001）). SARS-CoV S蛋白是I类病毒融合蛋白的典型代表，因为它可以分为与宿主细胞受体结合的N端半（S1）和负责细胞进入的C端半（S2）通过病毒细胞膜融合（Gallagher和Buchmeier，2001; 苏佩卡等。, 2004).

S2包含两个疏水（七肽）重复区，HR1和HR2（de Groot等。, 1987)其以斜向和反平行的方式组装成一个六螺旋束，其中三个HR2螺旋围绕着三个HR1螺旋的中心螺旋。刺突蛋白（S）融合核心的结构已由三组处于融合后（或融合活性）状态的人报道（图3c（c）)（苏佩卡等。, 2004; 徐，娄等。, 2004; 杜克罗伊等。, 2005). HR1的N端和HR2的C端位于六螺旋束的同一端，这使得融合肽和跨膜区非常接近。SARS-CoV介导的融合机制是根据其他I类融合蛋白的结构从这些结构中提出的，尽管还需要进一步的结构研究来确定HR1和HR2融合的可能构象变化肽类在膜融合过程中。

融合肽类已成功用于开发抗病毒药物。例如，膜融合抑制剂肽T-20以HIV融合前中间体为靶点，最近被美国食品和药物管理局授权为抗HIV药物。CoV S蛋白融合核心具有稳定的融合后结构，类似于HIV-1 gp41（Eckert&Kim，2001). 就SARS-CoV而言肽类来源于严重急性呼吸系统综合征冠状病毒刺突蛋白的HR1和HR2区，通过靶向假定的发夹前中间体阻断病毒进入（Bosch等。, 2004; 线路接口单元等。, 2004; 元等。, 2004).多肽来源于HR2足以抑制严重急性呼吸系统综合征冠状病毒感染（Liu等。, 2004; 博世公司等。, 2004). 有趣的是，HR2的疗效肽类源于SARS-CoV的棘突蛋白低于相应的HR2蛋白肽类抑制MHV感染（博世等。, 2004)这可能是因为与SARS-CoV S2相比，MHV S2的HR1–HR2界面中埋藏的表面积更大（Xu，Liu等。, 2004; 徐，娄等。, 2004; 苏佩卡等。, 2004).

任何病毒结构-功能研究的一个重要部分是表征与可能的宿主细胞受体的相互作用。在SARS-CoV病例中，S蛋白的S1区域与细胞受体结合，包括已知的受体血管紧张素转换酶2（ACE2）（Li等。2003年). Stephen Harrison及其同事用已知的细胞受体ACE2（图3）确定了SARS-CoV S蛋白受体结合域（RBD，覆盖S蛋白的318到510个残基）的结构d日)（李，李等。, 2005). RBD是病毒与受体相互作用的关键决定因素，因此也是病毒宿主范围和向性的关键决定因子。ACE2通过表面互补性明确识别SARS-CoV RBD通过定义良好的界面；RBD与其他棘突蛋白相互作用的相对面更加紊乱。正如作者所揭示的，这两种蛋白质之间的界面显示出重要的残基变化，有助于有效的跨物种感染和人与人之间的传播。ACE2在哺乳动物和鸟类中高度保守，其SARS-CoV受体活性仅受病毒结合位点上少数氨基酸取代的显著影响。人类冠状病毒479和487位RBD残基的细微变化可以增加对人类ACE2的亲和力。例如，棕榈果子狸冠状病毒的479位含有赖氨酸，487位含有丝氨酸，这会降低对人类的亲和力，但不会降低棕榈果子猫ACE2的亲和力。作者进一步建议将截短的二硫稳定RBD变体用于冠状病毒疫苗的设计。

80R是一种有效的中和S1 RBD的人单克隆抗体，与纳米摩尔亲和力（Sui等。, 2004). 已知可以阻断S1与ACE2受体的结合，防止合胞体的形成在体外（隋等。, 2004)并抑制病毒复制体内（隋等。, 2005). A类晶体结构80R与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒RBD的复合物表明80R结合表位与ACE2结合位点重叠，从而为80R抗体的强结合和中和能力提供了结构基础（图3e（电子）)（黄）等。, 2006). 与80R复合的SARS-CoV RBD结构的可用性应促进针对SARS-CoV的免疫治疗药物的设计。

已确定SARS-CoV核衣壳蛋白的两个结构域的晶体结构，该蛋白通过与基因组RNA结合发挥重要作用通过一先导序列，识别作为包装信号的RNA片段，并在组装过程中形成螺旋状核糖核蛋白（RNP）复合物。首先，SARS-CoV N蛋白RNA结合域的结构由五链组成β-折叠与其他RNA结合蛋白无关的薄片（Huang等。, 2004; 赛卡通杜等。, 2007). N蛋白RNA结合域的结构可能构成另一个重要靶点，因为发现与RNA结合域结合的小分子会损害核衣壳的功能（黄等。, 2004). 由于病毒基因组特定包装到病毒粒子中是感染病毒生命周期中的关键步骤，因此该RNA结合域可能是设计抗病毒疗法的可行靶点。第二，全长N蛋白形成二聚体通过其C末端域，以及晶体结构据报道，这种所谓的二聚化结构域覆盖了270–370个残基（Yu等。, 2006). 该结构被确定为二聚体，具有两个原聚体之间广泛的相互作用，与全长蛋白质的二聚体性质一致。

5.辅助蛋白质

SARS冠状病毒基因组编码八种功能不清楚或未知的所谓辅助蛋白，但可能在受感染的宿主中提供选择性优势。这些辅助蛋白的结构特征很差，其功能基本未知，因此尚不清楚这些辅助蛋白是否可能成为抗病毒药物研发的可行靶点。然而，最近有人建议将辅助蛋白orf3a和orf7a重新分类为结构蛋白（Ito等。, 2005; 沈等。, 2005; 黄等。, 2006). 由于副蛋白在不同冠状病毒之间存在差异，因此几乎可以肯定它们不会成为广谱抗病毒药物设计的靶点。迄今为止，已经确定了两个辅助蛋白质结构：orf7a管腔结构域（Nelson等。, 2005)和orf9b，一种脂质结合蛋白（Meier等。, 2006).

6.其他目标

除了SARS-CoV蛋白结构外晶体结构来自SARS-CoV的干环II基序（s2m）RNA元素的分辨率为2.7º（图3如果)（罗伯逊等。, 2005). S2m是一个严格保守的基序，位于SARS-CoV和其他病毒病原体（Jonassen）基因组的3′端等。, 1998)但在人类基因组中没有发现。高度结构化的s2m RNA元素在螺旋轴上有一个显著的90°弯曲。几个长程三级相互作用形成了一个垂直于主螺旋轴的隧道，内部带负电荷，可结合两个镁离子。这些不寻常的特征形成了与保守的宿主细胞成分或病毒功能所需的其他反应位点相互作用的可能表面。作者认为，s2m RNA是16S的530环的功能性大分子模拟物rRNA，一核糖体RNA折叠（温伯格等。, 2000)提出了与其他RNA病毒类似的宿主蛋白质合成的RNA劫持机制（Bushell&Sarnow，2002). 30S核糖体的530环与原核蛋白S12和IF-1结合，进一步表明s2m可能与它们的真核同源物相互作用（罗伯逊等。, 2005). 然而，在其他快速变化的RNA基因组中，s2m的高序列保守性暗示了其致病重要性。s2m的结构特征，再加上在人类基因组中没有发现，表明它可能是抗病毒治疗设计的另一个有吸引力的靶点。设计用于结合s2m的化合物可能会破坏结构，从而抑制SARS-CoV的发病机制。

7.SARS疫苗

疫苗为SARS-CoV提供了另一种治疗干预手段，并在SARS爆发后立即引起了特别关注。已经采用了几种策略来开发疫苗，包括灭活病毒、亚单位疫苗、病毒样颗粒（VLP）、DNA疫苗、异源表达系统以及通过反向遗传学从SARS-CoV基因组衍生的疫苗[见Gillim-Ross&Subbarao（2006）)以供最近的审查]。如上所述，S蛋白RBD可作为开发疫苗的起点，因为SARS-CoV的中和抗体可识别RBD中的表位。正如晶体结构，通过改造SARS-CoV RBD以提高稳定性，可以制造候选疫苗（Li，Li等。, 2005). 在另一个例子中，抗原肽类冠状病毒N蛋白可在感染细胞表面获得，用于T细胞识别（Boots等。, 1991; 伯格曼等。, 1993). 此外，2005年晶体结构人类MHC-I（主要组织相容性复合体I）分子HLA-A*1101与源自SARS-CoV N蛋白的九氨基酸肽（KTFPPTEPK等。, 2005). 尽管它与其他MHC-I分子相似，并显示出类似的肽结合模式，但该结构增加了不断增长的MHC-I结构库，可以用作肽基疫苗设计的模板。

最近的另一份报告表明，复制酶基因5′端编码的非结构蛋白nsp1是一种主要致病因子，可以为冠状病毒疫苗（Zust等。, 2007). Nsp1，其结构最近通过NMR进行了表征（Almeida等。, 2007)，是第一个在宿主细胞细胞质中表达的成熟病毒蛋白（Ziebuhr，2005)可能与宿主细胞有关信使核糖核酸降解和抵消先天免疫反应（Kamitani等。, 2006). 发现MHV中nsp1编码序列的缺失会强烈降低细胞基因的表达，而低剂量的nsp1突变型MHV会诱发强大的细胞毒性T细胞反应（Zust等。, 2007). 此外，接种nsp1突变型MHV的小鼠能够抵抗同源和异源病毒的攻击。Nsp1在所有冠状病毒中都是保守的，因此这种冠状病毒疫苗的开发策略可能对大多数哺乳动物冠状病毒有效。

8.未来展望

SARS-CoV蛋白的结构-功能研究大大提高了我们对冠状病毒的理解，并应加速基于结构的抗病毒治疗药物的发现。然而，许多重要的靶点仍有待阐明，尤其是在复制酶蛋白中。这些包括一些膜蛋白和大型多域蛋白，它们的结构很难确定。在这些蛋白靶点中，最重要的无疑是nsp12，即RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）。典型聚合酶序列基序可在RdRp的C末端部分识别，而冠状病毒RdRp具有一个独特的N末端区域，由380个氨基酸组成，功能未知（Xu等。2003年). 尽管几个小组进行了多次尝试，但事实证明，SARS-CoV RdRp很难生产出足够数量的结晶产品。其他RNA病毒的RdRp已成为抗病毒化合物的主要靶点。例如，NS5A是丙型肝炎病毒（HCV）的RdRp和非核苷抑制剂（NNI）的主要靶点（比斯瓦尔等。, 2005, 2006). 噻吩基NNI的结合位点位于NS5B的“拇指”结构域，与变构GTP结合位点非常接近，距离活性位点约35Å。“拇指”结构域的这一部分显然具有重要的调节功能，由GTP和NNI调节。有趣的是，nsp8还被认为形成第二个RdRp，用于合成nsp12的短RNA引物。由于这种功能是冠状病毒特有的，因此nsp8引物酶可能是抗冠状病毒治疗的有效和特异性靶点。另一个主要靶点是nsp13，即解旋酶，其作用是在复制过程中解开双链基因组和亚基因组RNA，其三维结构尚待确定。Nsp12和nsp13，以及nsp5（M^{赞成的意见})，在三个冠状病毒组中具有最高的序列保守性，应该是广谱抗病毒药物发现的重点（杨等。, 2005).

9.结论

众所周知，病毒蛋白很难处理，尤其是在结晶方面。并非每个SARS-CoV蛋白都一定是治疗干预的靶点，但了解病毒复制和宿主感染的潜在机制将有助于确定潜在SARS-CoV靶点并确定其优先顺序。结构基因组学/蛋白质组学的出现大大推动了SARS-CoV蛋白质结构-功能研究的进展，从而大大提高了我们对冠状病毒的理解。

迄今为止，基于结构的抗冠状病毒治疗药物的发现主要集中在两个领域：阻止病毒进入宿主细胞或抑制病毒复制和转录通过复制酶复合体。在前一种情况下，SARS-CoV S蛋白融合核心结构的可用性将有助于设计通过靶向融合前发夹中间物来阻止病毒进入的抑制剂。SARS-CoV和MHV S蛋白融合核心之间的结构差异表明，设计用于靶向SARS-CoV-S蛋白融合中心的抑制剂对其他冠状病毒的抑制效果较差。在后一种情况下，迄今为止已在冠状病毒中鉴定出三种高度保守的蛋白质：nsp5、M^{赞成的意见}; nsp12，RdRp；nsp13，解旋酶。以这三种蛋白质为靶点，可以设计出具有广谱活性的抗冠状病毒治疗药物。如果出现新的冠状病毒，广谱抑制剂的可用性应该是疫苗可用之前的第一道防线。然而，在撰写本文时，市场上或临床前或临床试验中都没有抗冠状病毒药物。SARS-CoV可能已通过有效的监测和公共卫生措施得到控制，但应注意的是，在SARS之后分离出两种人类冠状病毒，HCoV-NL63和HCoV-HKU1（范德霍克）等。, 2004; 求爱等。, 2005)也发现了SARS样冠状病毒的动物宿主（刘等。, 2005; 李、石等。, 2005).