治疗诊断科技2023; 13(15):5207-5222. doi:10.7150/thno.89033这个问题 引用

研究论文

上调FOXM1刺激Acot12软骨细胞衰老^-/-Nudt7号机组^-/-双基因敲除小鼠

宋金洙^1†、Ee Hyun Kim^2†，杨俊浩¹，Donghyeon Kim¹，阿赫马德·伊哈斯·罗比^三，Se-ah Kim⁴，Sung Young公园^三、Ji Hyun Ryu⁴，Eun-Jung Jin¹

1.旺旺大学健康科学学院生物科学系；韩国Chunbuk Iksan，570-749。
2.Ewha Womans大学药学院药学研究生院；韩国首尔03760。
3.韩国交通大学化学与生物工程系；韩国Chungju 27469。
4.旺旺大学碳融合工程系；韩国Chunbuk Iksan，570-749。
†这些作者贡献均等。

✉ 通讯作者：电子邮箱：jineunjung交流kr。

摘要

理论基础：骨关节炎（OA）是最常见的退行性关节疾病，其特征之一是衰老软骨细胞数量增加。靶向衰老软骨细胞或导致衰老的信号机制可能是治疗OA的一种有希望的新方法。然而，对软骨细胞衰老和OA之间的关键靶点和联系的理解仍不清楚。

方法：衰老软骨细胞来自Nudt7号机组^-/-，Acot12^-/-，缺少双基因敲除小鼠Acot12公司和Nudt7号机组（dKO）并应用于微阵列。在老年人、dKO和内侧半月板（DMM）软骨和关节软骨细胞的不稳定中检测到叉头转录因子M1（FOXM1）的存在，以及福克斯M1采用免疫组织化学、定量实时PCR（qRT-PCR）、细胞凋亡和增殖分析以及藏红O染色法检测过表达和乙酰辅酶A治疗对软骨稳态的影响。交付Rho@PAA-MnO₂（氧化锰₂纳米片）或肝素-ACBP/COS-GA-siFoxM1基因（ACBP-六个FoxM1)纳米颗粒进入DMM软骨.

结果：在这里，我们建议通过传递(福克斯M1小核糖核酸(六个FoxM1)通过抑制软骨细胞衰老轴来防止软骨降解。dKO通过上调福克斯M1并导致严重的软骨损伤。我们发现，dKO小鼠体内乙酰辅酶A的积累可能是导致福克斯M1在OA发病过程中。此外，通过MnO植入清除软骨细胞衰老诱导的活性氧（ROS）₂纳米片或交付六个FoxM1用乙酰辅酶A结合蛋白（ACBP）功能化，使用可注射的生物活性纳米粒子捕获乙酰辅酶a(六个FoxM1-ACBP-NP）显著抑制DMM诱导的软骨破坏。

结论：我们发现Acot12公司和Nudt7号机组通过上调福克斯M1乙酰辅酶A的积累，以及六个FoxM1-ACBP-NP是一种潜在的OA治疗策略。

关键词：骨关节炎，Acot12公司^-/-Nudt7号机组^-/-,福克斯M1, Rho@PAA-MnO₂，肝素-ACBP/COS-GA-六个FoxM1

介绍

骨关节炎（OA）是最常见的进行性慢性关节疾病，其特征是主要对关节软骨和软骨下骨，以及滑膜、韧带和肌肉进行结构修饰，这表明OA发病是一个复杂的过程，涉及并影响软骨和整个关节组织[1]. OA发生和发展过程中关节组织的生理和病理变化是由维持软骨稳态的各种因素相互作用介导的，包括促炎细胞因子，如白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6、，以及抗炎细胞因子，如IL-4和IL-10；生长因子，如转化生长因子-β和成纤维细胞生长因子-21；和脂肪因子[2]. 软骨内这些因素之间的不平衡会损害软骨基质的稳定周转，并导致软骨退化和破坏。传统上，OA的治疗一直局限于使用非甾体抗炎药（NSAID）或止痛药来缓解关节疼痛，而不是针对结构性疾病进展的成分[三]. 然而，由于其副作用常常限制其使用，因此迫切需要新的生物靶点来进行干预和治疗，以预防或逆转OA症状。软骨细胞衰老与骨关节炎的相关性[4,5]靶向衰老软骨细胞或负责任的信号机制可能是OA治疗的新方法。衰老对OA的影响是复杂的，刚刚开始被了解。衰老软骨细胞表达高水平的衰老生物标志物，如p53和细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21和p16^INK4a公司[6]. 最近的研究表明，脐带源间充质干细胞外泌体通过调节p53信号通路对衰老OA软骨细胞具有再生作用[7]. 软骨细胞的年龄相关活性氧（ROS）产生在软骨降解和软骨细胞死亡中起作用[8]. 活性氧积聚功能失调的线粒体，诱导DNA损伤，导致OA患者过早衰老、基质降解和骨量丢失[9].

尽管细胞增殖能力下降，但衰老细胞仍表现出较高的代谢活性。软骨细胞主要依赖厌氧代谢来发展、维持和修复软骨基质。厌氧糖酵解在OA软骨细胞中被刺激，以产生足够的ATP来维持软骨基质中的稳态[10,11]. 丙酮酸激酶M2是参与糖酵解步骤的关键酶，通过生成ATP将磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸，与健康软骨细胞相比，在OA软骨细胞中上调[12]. 此外，在OA组织中，三羧酸循环也被上调，很可能增加修复软骨损伤所需的ATP的生成[13-15]. 脂肪酸β-氧化途径是脂肪酸分子被分解以提供能量的分解代谢过程，是OA发病过程中受影响的另一个代谢途径[16,17]. 脂肪酸的线粒体β氧化在OA的发展和进展中起着重要作用[18,19]. 如骨关节炎软骨中所观察到的那样，氧化脂肪酸衍生物的失调会破坏软骨基质的稳态并降低细胞活性[16,20]. 人类软骨细胞接触亚油酸会刺激IL-6的分泌和前列腺素E2的产生，从而产生与OA严重程度密切相关的生物反应[21]. 棕榈酸诱导软骨细胞凋亡，这与脂滴的积聚有关[22,23]. OA软骨中积累的脂肪酸表明线粒体功能障碍可能与OA的发病机制密切相关，因为线粒体利用脂质作为主要燃料来产生控制许多细胞过程的化学能；即累积的脂肪酸可能通过线粒体功能障碍影响软骨降解的生物途径，包括氧化应激、炎症和软骨细胞凋亡。最近，我们证明了过氧化物酶体和线粒体之间在调节脂质代谢方面的功能相互作用[24]. 此外，调节脂肪酸β-氧化的过氧化物酶体功能受损导致软骨基质稳态失衡，这与OA的发病机制密切相关。过氧化物酶体是一种普遍存在的膜结合的小细胞器，在各种代谢途径中发挥着重要作用，包括超长链脂肪酸（VLCFA）和LCFA的β-氧化、乙醚脂质的合成和胆汁酸代谢。在各种过氧化物酶体酶中，我们的实验室最近提出，水解辅酶A（CoA）二磷酸的nudix水解酶7（NUDT7）在维持软骨内环境稳定中起着重要作用[25]. 的不足Nudt7号机组通过激活有氧糖酵解关键酶之一的磷酸甘油酸变位酶1，破坏过氧化物酶体β-氧化并在软骨中积累乙酰辅酶A，导致炎症和凋亡细胞死亡。此外，我们的实验室显示，酰基-CoA硫酯酶12敲除(Acot12公司^-/-)软骨，乙酰辅酶A的积累刺激从头开始脂肪生成，从而导致软骨基质降解[26]. 这些数据表明脂肪酸的过氧化物酶体β-氧化，尤其是乙酰辅酶A在OA发病过程中维持软骨稳态的重要性。然而，脂肪酸过氧化物酶体β氧化导致OA软骨代谢功能障碍的机制尚不清楚。此外，潜在的监管和信号机制在很大程度上仍然未知。在当前的研究中，我们产生了缺乏音频12和Nudt7号机组（Acot12^-/-Nudt7号机组^-/-，dKO）评估脂肪酸过氧化物酶体β氧化在OA发病机制中的调节作用和信号机制。我们的结果表明，dKO小鼠通过乙酰辅酶A的积累上调叉头转录因子M1（FOXM1），导致细胞衰老水平增加，从而导致软骨基质自发严重降解。最近，针对软骨和滑膜的靶向生物材料被应用于提高OA治疗的疗效。水凝胶、非水凝胶聚合物和无机纳米材料等功能性生物材料广泛用于骨关节炎传递、软骨细胞包裹和软骨工程[27-29]. OA治疗中最常用的水凝胶是多糖(例如壳聚糖、透明质酸、肝素）和蛋白质(例如胶原蛋白、明胶）。使用这些基于生物材料的水凝胶的优点是，它们克服了药物在膝关节内滞留不良的限制。这通过让药物在关节或软骨中停留更长时间并缓慢释放来提高治疗效果。在目前的研究中，我们使用壳聚糖和肝素等生物材料，利用六个FoxM1和乙酰辅酶A结合蛋白（ACBP），并评估治疗效果。

结果

Acot12和Nudt7缺失涉及OA发病机制

我们之前报道过两种过氧化物酶体酶，Acot12公司和Nudt7号机组对维持软骨内环境稳定很重要[25,26]. 此外，由于LCFA和VLCFA的β-氧化受损，乙酰辅酶A的积累Acot12公司^-/--或Nudt7号机组^-/-软骨可能通过调节分解代谢和炎症反应，在软骨稳态调节中发挥关键作用(图S1A） ●●●●。我们生成了Acot12公司^-/-Nudt7号机组^-/-老鼠(图S1B） ●●●●。与我们之前的报告不同，我们的研究表明Acot12公司^-/-[26]或Nudt7号机组^-/-老鼠[25]dKO小鼠的骨骼发育，即出生后小鼠的胫骨和股骨长度以及软骨内骨化发生了显著变化（图1A） ●●●●。此外，与对照组相比，通过花生凝集素（PNA）和阿尔西安蓝染色分别评估，dKO小鼠肢芽间充质细胞的微质量培养显示细胞凝集和软骨分化显著增加Acot12公司^+/+Nudt7号机组^+/+（野生型，WT）间充质细胞（图1B） ●●●●。与WT小鼠相比，12个月龄和20个月龄dKO小鼠的软骨严重退化（图1C） ●●●●。通过测量横截面积分析，12个月和20个月龄dKO小鼠的胫骨前肌（TA）质量也随着过氧化物酶体和线粒体基因谱的失调而显著降低(图S2). 这些数据表明Acot12公司^-/-Nudt7号机组^-/-dKO可能通过与过氧化物酶体和线粒体的功能性相互作用，加剧软骨和肌肉等肌肉骨骼系统的退化。

为了研究dKO对OA发病机制的影响，采用内侧半月板失稳（DMM）诱导OA病理状态。与对照软骨相比，在DMM诱导的dKO软骨中观察到严重的软骨降解，这是通过藏红O染色评估的（图1D） ●●●●。在DMM诱导的dKO软骨中也观察到软骨厚度的显著减少。与WT软骨相比，DMM诱导的dKO软骨中胶原C1,2C阳性细胞的强度和数量显著增加（图1E） 。此外，软骨基质基因的转录水平，如阿坎Col2a1、和Comp公司减少（图1F） 而主要软骨降解酶的表达水平，百万像素13炎症趋化因子和细胞因子，如Cxcl2公司,白介素-6,肿瘤坏死因子α、和第4类和凋亡基因，如案例3和案例9DMM诱导的dKO软骨显著增加（图1G-H）。确定是否恢复音频12或Nudt7号机组dKO软骨可以防止软骨降解，Nudt7号机组- (Lenti-HA-Nudt7系列)或Acot12公司-编码慢病毒(Lenti-HA-Acot12)被引入dKO小鼠的膝关节腔（图1一） ●●●●。关节内注射Lenti-HA-Acot12或-Nudt7号机组显著减少软骨降解，联合注射Lenti-HA-Acot12和-努特7.如中所述Nudt7号机组^-/-和Acot12公司^-/-未成熟小鼠关节软骨细胞（iMACs），细胞增殖显著降低(图S3和图S4A） 以及细胞凋亡增加(图S4B） 线粒体动力学的失调(图S4C） 在dKO iMAC中观察到。然而，与WT-iMAC相比，在dKO-iMAC中，我们没有观察到显著的脂质积聚，如Nudt7号机组^-/-或音频12^-/-iMAC(图S4D-E）。脂质代谢相关基因的表达水平，包括Fasn公司,Scd1号机组、和埃洛夫斯dKO iMACs中的，也减少了，而两者中的Nudt7号机组^-/-或Acot12公司^-/-iMAC(图S4F） ●●●●。

Acot12和Nudt7的缺失通过FoxM1上调显著刺激软骨细胞衰老

为了确定dKO调节软骨降解的因素，我们使用从WT分离的iMAC进行微阵列分析，Nudt7号机组^-/--,Acot12公司^-/--和dKO iMACs小鼠，提取了其表达在努特7^-/--,Acot12公司^-/--和dKO iMAC与WT iMAC进行比较，并分析了丰富的信号通路（图2A-B）。细胞衰老、p53信号通路和FoxO信号通路被认为是常见的富集信号通路，在dKO-iMAC中具有最高意义。体外传代（P2，P4）iMACs分析显示，衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性细胞数量增加Nudt7号机组^-/--,Acot12公司^-/--和dKO iMAC与WT iMAC的比较（图2C） ●●●●。在dKO-iMAC中观察到衰老细胞数量的急剧增加。此外，与WT-iMAC相比，dKO-iMAC中衰老相关分泌表型（SASP）和衰老核心标志基因的转录水平也显著上调（图2D） ●●●●。基因图谱分析表明，细胞周期：G2M DNA损伤检查点调控、ATM信号传导和染色体复制的细胞周期控制是dKO iMAC的顶级典型途径(图S5). 根据对Nudt7中表达显著改变的常见基因的微阵列分析^-/--，Acot12^-/--和dKO iMAC与WT iMAC相比，Bnip3l公司,Cdkn2a公司,Ifn公司,红外线3,Irf7型,福克斯M1,Nkk2.3标准,点对点1,Ptger2型、和拉布尔6建议作为可能的上游调节器（图三A） ●●●●。此外，我们提取了在dKO iMACs微阵列（up=135，down=94）、从OA患者分离的OA软骨细胞的RNA序列（up=102，down=137）和GSE16464[正常与OA软骨细胞核的3D培养（up=108，down=63）]中表达显著改变的常见基因，并对其进行了鉴定1卢比,三氟化碳,无购买力平价,高生长因子,Ptger2型,福克斯M1、和高级服务1（图三B和图S5).福克斯M1通常在年改变Nudt7号机组^-/-,Acot12公司^-/-和dKO iMACs以及OA软骨细胞。的表达式级别福克斯M1随着传代过程的进行，dKO-iMAC的表达水平显著高于野生型iMAC（图三C） ●●●●。我们还证实，与DMM诱导的WT软骨相比，DMM诱导dKO软骨中FOXM1的表达水平上调（图三D） ●●●●。与相比Nudt7号机组^-/-或Acot12公司^-/-软骨以及WT软骨中，在dKO软骨中观察到FOXM1阳性细胞的数量显著增加（图三E） ，以及引入lent-HA-Acot12或-Nudt7号机组进入dKO软骨后，这些增加的FOXM1阳性细胞减少(图S6). 的表达式级别福克斯M1在OA患者中也显著上调（图三F） ●●●●。免疫组织化学分析表明，与OA软骨的非OA区域相比，OA软骨OA区域中FOXM1阳性细胞的数量增加了三倍（图三G） ●●●●。

为了研究FOXM1在OA发病机制中的作用和功能，使用外源性的福克斯M1-编码pcDNA结构(福克斯M1；图S7). 如Nudt7所示^-/--，Acot12^-/--和dKO iMACs，线粒体基因的表达水平，如Cox2公司和Cox4公司，过氧化物酶体基因，如Pmp70型和猫和溶酶体基因，如指示灯1和灯2被引入的福克斯M1到WT iMAC(图S8). Alcian蓝阳性细胞的数量（图4A） 软骨基质基因的表达水平，如第2a1列,Comp公司、和阿坎软骨降解相关基因的表达水平，如百万-3,-9、和-13随着福克斯M1到WT iMAC（图4B） ●●●●。有趣的是，如dKO软骨中所示图S4F、 脂质代谢相关基因的表达水平，如工厂4,抄送36、和Scd1号机组在福克斯M1-引入WT iMAC（图4C） ●●●●。确定小干扰RNA是否特异于福克斯1(六边形xm1)可以克服软骨稳态的抑制作用，三种不同的六个FoxM1被引入dKO iMAC，并对其效率进行了检查(图S9，图4D） ●●●●。在这项研究中，通过引入六个FoxM1进入之内福克斯M1-引入WT或dKO iMAC（图4E左面板）。阿尔西安蓝染色的提取和光度定量（图4E右上面板）和Alcian蓝色染色区域的图像J分析（图4E右下面板）也因引入六个FoxM1到dKO iMAC中。与在dKO-iMAC中观察到的顶级经典途径一致(图S5)，SA-β-gal阳性细胞的数量（图4F） 和表达水平Cdkn1a型（图4G） 由于引入了福克斯M1到dKO iMAC中。软骨基质基因水平降低，如第2a列,Comp公司、和阿坎通过引入福克斯M1通过共同引入福克斯M1-特异性siRNA（图4H） ●●●●。

接下来，我们将WT-iMACs暴露于IL-1β中，IL-1β是参与OA发病的关键细胞因子之一，以形成OA环境。IL-1β暴露于iMAC中显示出典型的OA特征，即软骨基质基因的表达水平显著降低，例如第2a1列和阿坎（图5A） 软骨细胞凋亡增加（图5B） ●●●●。这些变化因联合治疗而加剧福克斯M1在IL-1β的存在下。体内关节内注射透镜-HA-FoxM1DMM诱导的WT小鼠软骨中FOXM1、C1、2C和MMP13阳性细胞数量增加，刺激软骨降解（图5C） ●●●●。相反，关节内注射六个FoxM1DMM诱导的dKO小鼠软骨中的FOXM1、C1、2C和MMP13阳性细胞数量减少，从而显著抑制软骨降解。

为了确定dKO小鼠在OA发病过程中诱导软骨细胞衰老和凋亡的代谢分子，我们搜索了人类代谢组数据库，并确定乙酰辅酶a是一种常见的代谢物（图6A） ●●●●。为了确定乙酰辅酶A水平升高是否是FOXM1诱导的细胞衰老的原因，用醋酸钠处理iMAC以积累乙酰辅酶a(图S10). iMACs暴露于醋酸钠导致典型的OA特征，即降低第2a1列表达和增加百万像素13和亚当斯5表达式。iMACs暴露于醋酸钠后，衰老标志基因的表达水平增加，同时福克斯M1水平。此外，iMAC暴露于乙酰辅酶A也显著增加衰老标志基因的表达（图6B） ，IL-1β诱导的活性氧（图6C） ，福克斯M1（图6D） 和软骨降解基因，如亚当斯4和百万像素13（图6E） ，并降低软骨基质基因的表达水平，如第2a1列,Comp公司、和阿坎（图6F） ●●●●。向DMM软骨关节内注射乙酰辅酶A增加了FOXM1-的数量（图6G） 和TUNEL-（图6H） 软骨严重退化的阳性细胞（图6一） ●●●●。

肝素-ACBP/COS-GA体内靶向衰老软骨细胞-六个FoxM1纳米颗粒减少软骨降解

为了研究去除诱导dKO小鼠软骨细胞衰老的因子是否可以抑制软骨降解，我们使用了一种衰老诱导的ROS响应的荧光负载聚丙烯酸（PAA）-MnO₂系统（图7A） ●●●●。荧光被罗丹明（Rho）和MnO的聚集猝灭₂而通过MnO的裂解回收₂至Mn²⁺以及在衰老诱导的活性氧存在下Rho 5G的释放。Rho@PAA-MnO₂该系统通过粒径减小进行了验证（图7B） 0.5%或1%H后，光致发光（PL）强度增加₂O（运行）₂处理（图7C） ●●●●。H荧光恢复₂O（运行）₂通过488nm的共聚焦显微镜确认(图S11).体外对传代iMAC的分析表明，随着细胞传代的进行，衰老相关信号的强度增加（P4~P9）(图S12). 与WT小鼠的传代iMAC相比Nudt7号机组^-/-，Acot12^-/-,dKO小鼠表现出强烈的衰老信号。特别是，在从dKO软骨分离的传代iMAC中检测到最强的衰老信号。DMM诱导的软骨衰老信号显著增加Nudt7号机组^-/-和dKO小鼠，DMM诱导的dKO软骨中信号最强（图7D） ●●●●。此外，我们证实随着OA发病机制的进展，衰老相关信号增加体内DMM手术后，随着软骨基质降解时间的推移，衰老相关信号增加(图S13). 对于肝素-ACBP/COS-GA-siFoxM1基因（ACBP-六个FoxM1)采用标准碳二亚胺化学合成了没食子酸结合壳聚糖寡糖（COS-GA）纳米粒。通过在COS的胺基和GA的羧酸基团之间形成酰胺键，COS与GA共轭（图7E） 。紫外可见光谱和紫外可见光谱仪都证实了GA与COS主链的共轭。COS-GA的没食子酸质子含量为6.9至7.1 ppm¹H核磁共振波谱（图7F） ●●●●。此外，还观察到由COS-GA的没食子酸基团引起的261 nm处的吸收峰（图7G） ●●●●。如前所述，λ_最大值GA的吸光度受pH值和溶剂的显著影响[30]. 因此，在PBS（pH 7.4）中制备不同浓度的COS-GA溶液和标准溶液。通过紫外-可见光谱研究测量到COS主链中GA的取代度为14.4%。COS-GA的编制程序/siFoxM1基因复合物如图所示7H.带正电COS和带负电COS之间的静电相互作用六个FoxM1随后是没食子酸介导的COS-GA主干的化学交联。

如前所述，含没食子酸的聚合物可以在PBS（pH 7.4）中通过自氧化交联[31]. COS-GA的形态/六个FoxM1脱水后的配合物用扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）进行了检查。COS-GA公司/六个FoxM1配合物为分散良好的球形纳米粒子。使用COS-GA和肝素（Hep）制备ACBP负载纳米粒。如图所示7一、 通过COS-GA与Hep的聚电解质络合反应制备了COS-GA/Hep/ACBP复合物。COS-GA/Hep/ACBP复合物很容易分散在PBS（pH 7.4）中。

PAA-MnO的植入₂将纳米片放入软骨中八周后，显著抑制了DMM诱导的软骨降解（图8A-B）。P16的表达水平和阳性细胞数^墨水4aPAA-MnO的植入显著降低了FOXM1₂纳米片进入DMM软骨。接下来，为了确定从衰老软骨细胞中捕获积累的乙酰辅酶A和FOXM1是否可以抑制OA发病，我们应用了肝素-ACBP/COS-GA-siFoxM1基因（ACBP-六个FoxM1)纳米颗粒（图9A-B）。ACBP简介-六个FoxM1纳米颗粒进入软骨显著抑制DMM诱导的软骨降解。在引入ACBP后，观察到软骨降解受到最显著的抑制-六个FoxM1复杂。

讨论

细胞衰老是一种稳定的细胞周期停滞状态，是一个发生在多种生物过程中的受控过程[32]. 然而，衰老细胞的持续存在和积累会损害多种细胞功能，并诱发与年龄相关的疾病，如OA。与正常软骨相比，人OA软骨中衰老的软骨细胞随着年龄的增长而积累并增加数量[4]. 衰老的软骨细胞位于软骨骨关节炎病变附近，但不位于软骨的完整区域，表明软骨细胞衰老和OA发病之间存在积极联系[4]. 软骨细胞衰老是驱动或促进OA发展的常见分子机制。SASP是一种强健的促炎分泌体，可导致软骨体内平衡失衡，并改变关节中细胞和组织的结构和功能[4,33]. SASP因子的表达，百万-13,白介素-6、和IL-1β刺激炎症和软骨降解，这是OA的特征。最近，细胞衰老对OA的发生和发展起作用的分子机制已被报道。氧化应激可能在软骨细胞衰老和OA发展之间的关系中起主要作用[34-36]. 软骨中细胞内ROS水平的增加导致蛋白质、脂质和DNA的氧化损伤，导致软骨细胞衰老、凋亡和软骨基质丢失，从而导致细胞和组织的老化变化。此外，衰老软骨细胞中氧化应激增加会改变线粒体的质量、电位和形态；堆积功能失调的线粒体；并刺激软骨细胞的炎症和基质分解反应[37,38]. 然而，许多其他问题，如诱导软骨细胞衰老的其他因素或决定导致骨关节炎的关节变性的其他潜在机制，仍有待回答。在本研究中，我们观察到大量具有过氧化物酶体功能障碍的衰老细胞。缺乏双基因敲除小鼠Acot12公司和Nudt7号机组表现为刺激软骨细胞衰老，炎症和软骨分解代谢因子上调，软骨合成代谢因子下调，导致OA发病机制的发展和进展。

内质网、线粒体、内体和细胞代谢物之间细胞器相互作用的放松调节导致细胞衰老，并与衰老有关[39]. 线粒体与细胞衰老密切相关[4]. 线粒体功能障碍/改变相关的衰老产生SASP，衰老肝细胞中的线粒体对脂肪酸氧化能力受损，导致肝脏脂质沉积增加，这是非酒精性脂肪性肝病的典型病理生理特征[40,41]. 在本研究中，我们发现由NUDT7和ACOT12缺陷引起的过氧化物酶体功能障碍也通过乙酰辅酶A的积累诱导软骨细胞衰老。脂肪酸积累引起的脂毒性损害线粒体结构和功能，并导致活性氧水平迅速增加，从而导致细胞衰老[42]. 这里，iMAC暴露于乙酰辅酶A诱导SASP。然而，过氧化物酶体失调诱导的过氧化物酶功能障碍或乙酰辅酶A积累与细胞衰老的相关性尚未阐明。此外，负责这一过程的关键调控机制和分子尚未得到充分研究。在这里，我们发现在软骨细胞中，由于NUDT7和ACOT12缺乏而积累的乙酰辅酶a通过上调福克斯M1是转录因子叉头超家族的成员。FOXM1是许多生物反应的重要调节器，众所周知，FOXM1的失调通过调节细胞增殖、侵袭和转移、癌症干细胞特性、基因组不稳定性和细胞代谢，对肿瘤的发生和癌症的进展起着重要作用[43]. 特别是，FOXM1控制着细胞分裂过程中G2-M转变所需的基因网络，这表明它参与了细胞增殖[44]. FOXM1通过激活Ras和细胞周期蛋白D1在各种人类恶性肿瘤中过度表达，包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肾癌，而FOXM1的缺失足以通过刺激细胞凋亡来减少致癌[45-47]. 与癌细胞不同，FOXM1在软骨细胞中具有相反的作用。在OA患者的关节组织中，以及用IL-1β（OA软骨破坏的关键调节因子）刺激软骨细胞后，FOXM1的水平显著上调[48]. 与癌细胞相反福克斯M1IL-1β诱导的软骨细胞提高了细胞活力并减轻了炎症反应。在本研究中，我们发现NUDT7和ACOT12缺乏诱导的FOXM1上调是OA发病过程中软骨细胞衰老的刺激因素。总之，在本研究中，我们发现NUDT7和ACOT12缺陷诱导的过氧化物酶体功能障碍通过乙酰辅酶A积累上调FOXM1，从而激活软骨细胞衰老，从而刺激软骨降解。此外，MnO的注入₂纳米片清除衰老软骨细胞产生的ROS或递送六个FoxM1与ACBP结合显著抑制OA发病过程中软骨细胞衰老和软骨降解。

材料和方法

道德认可

所有动物研究均由旺旺大学动物护理和使用委员会批准，并按照机构指南（#WKU21-36、#WKU 22-40、#WK U22-41、#WKuU 22-42）进行。人类关节软骨标本取自接受全膝关节置换术的患者。人软骨组织采集得到了旺旺大学医院人体受试者委员会的批准，研究按照机构指南（WKUH 201605-HRBR-041）进行。在实验开始之前，所有成年患者或每个患者的至少一名监护人均已获得书面知情同意。

人类OA标本

人类关节软骨标本取自接受全膝关节置换手术的患者，并分为相对健康（非OA）和严重受损（OA）区域。将人关节软骨标本切成块，并立即将一些块固定在10%中性缓冲福尔马林中。

动物

Nudt7号机组^-/-和Acot12公司^-/-如前所述，用TALEN或RGEN诱导的突变产生小鼠[25,26]. dKO小鼠是由Nudt7号机组^-/-带有Acot12公司^-/-老鼠。野生型C57BL/6N小鼠购自Samtako BioKorea，Inc.（韩国Osan）。所有小鼠均置于22±1℃的环境中，进行12小时的光/暗循环，相对湿度为50±5%，并提供食物和水随意在8周大的小鼠中进行DMM，并在手术后8周分析膝关节。使用国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分系统对软骨降解程度从0到6进行评分。

新生儿骨骼的茜素红/阿尔西安蓝染色

对出生后的0只幼崽实施安乐死、去皮和去内脏，包括眼睛和脂肪。在95%乙醇中固定24小时后，在室温（RT）下将标本浸泡在阿尔西安蓝溶液中过夜。标本在95%乙醇中去渍，然后转移到2%氢氧化钾中清洗组织。在RT时，将小鼠浸泡在茜素红染色液中24小时，以对骨骼进行复染。在分别用20%甘油/1%KOH、50%甘油/1%KOH和80%甘油/1%KOH清洗组织24小时后，将样品储存在100%甘油中。

组织学分析

软骨固定在10%中性缓冲福尔马林中，并在14%EDTA（pH 7.4）中脱钙。将组织包埋在石蜡中，并切片至5μm厚。复水后进行藏红O染色，并测量Mankin评分。对于免疫组织化学，使用0.01 M柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）进行抗原检索，并用正常马血清封闭切片。用以下主要抗体隔夜培养切片：C1,2C（1:100，50-1035，加拿大IBEX制药公司）、FOXM1（1:100、sc-376471，美国圣克鲁斯）、MMP13（1:200、3533，美国BioVision）、Aggrecan新表位（1:200，100-74350，美国NOVUS）和P16INK4A（1:100；ab189034，英国abcam）。在用过氧化物酶缀合的第二抗体孵育后，用ImmPACT DAB底物（Vector Laboratories，USA）进行检测。

iMAC文化

使用先前公布的方法从出生后第5天的幼崽中分离出iMAC[25]. 将iMAC与Dulbecco改良的Eagle’s培养基（DMEM；Gibco）、10%胎牛血清（FBS；美国Gibco₂.pcDNA-FoxM1和/或六个FoxM1转染24小时后，添加或不添加5 ng/ml IL-1β，再转染24 h。50μM乙酰辅酶A或25、50和100μM醋酸钠处理24 h。

原代细胞培养

间充质细胞（密度为2×10⁷细胞/ml）来源于E9至E12.5小鼠胚胎的肢芽，并在含有10%FBS、100单位/ml青霉素和链霉素的Ham’s F-12培养基中培养。

细胞分化和软骨前凝结的分析

用6 M胍基HCl萃取与硫酸化糖胺聚糖结合的阿尔西安蓝，并通过在600 nm处测量提取物的吸光度进行量化。用100μg/ml生物素化花生凝集素（美国Sigma-Aldrich）培养培养物，并用VECTASTAIN ABC和DAB底物溶液试剂盒进行可视化。

使用小鼠软骨细胞的微阵列

使用Affymetrix GeneChip whole transcript PLUS试剂进行小鼠全转录表达阵列分析。使用基因芯片全转录扩增试剂盒合成cDNA。然后将Sense cDNA片段化，使用GeneChip WT终端标记试剂盒用TdT标记生物素，并在45°C下与Affymetrix GeneChip-Mouse 2.0 ST阵列杂交16小时。杂交阵列经过清洗，在GeneChip Fluidics Station 450上染色，并使用GGCS3000扫描仪（美国Affymetrix）进行扫描。使用Affymetrix GeneChip命令控制台软件计算信号值。

人类软骨细胞RNA测序

使用Illumina HiSeq4000仪器进行RNA测序，使用定量实时PCR（qPCR）定量文库，并使用安捷伦科技2100生物分析仪检查文库质量。使用Cufflinks软件将原始数据计算为每个样本每千基转录本每百万映射读取数（FPKM）的片段数。使用分位数归一化方法对数据进行对数转换和归一化。

逆转录聚合酶链反应

使用RNAiso Plus（日本高原）分离总RNA，并使用5X RT Master Mix（高原）逆转录。使用AMPIGENE qPCR Green Mix Hi-ROX（Enzo，美国）在ABI StepOnePlus仪器（Applied Biosystems，美国）上进行定量PCR，并将其归一化为18S rRNA表达水平。本研究中使用的qRT-PCR引物序列列于补充表1.

标记法

安就地根据制造商的说明，将细胞死亡检测试剂盒（瑞士罗氏）用于脱蜡软骨切片。4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色后，通过荧光显微镜获得图像。

细胞凋亡和增殖测定

按照制造商的说明，使用Muse Annexin V&Dead Cell Kit（MCH100105，Luminex，USA）分析细胞凋亡，并使用带有Muse Cell Analyzer（Merck Millipore，USA。

SA-β-半乳糖染色

按照制造商的说明，使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒（9860，Cell Signaling Technology，USA）对细胞衰老进行成像。

中性脂质染色

固定细胞或小鼠软骨用BODIPY染色^493/503（Thermo Fisher Scientific，USA）20分钟，用DAPI安装介质（Vector Laboratories）安装。使用软骨图像获取荧光图像。

壳聚糖-FITC/乙酰辅酶A复合物的制备

用pH 7.4 PBS将壳聚糖-FITC储备溶液（在0.05 N HCl中的1 mg/ml壳聚糖-FICT）稀释10倍，并添加10µL乙酰辅酶A（50 mM）。在反应6小时以确保形成壳聚糖-FITC/乙酰-CoA络合物后，通过透析（MWCO:12-14 kDa，SpectraPor，USA）对DDW进行纯化1天。

纳米氧化锰脱羧聚丙烯酸（PAA-MnO）的合成₂)

PAA（Mw:400.000，Sigma-Aldrich）溶解于50 ml dH中₂O和高锰酸钾溶液（KMnO₄，Sigma-Aldrich）（75 mg溶于10 ml dH₂O） 。然后，45毫升2-(N个-缓慢添加吗啉基）乙磺酸（MES，Sigma-Aldrich）（0.1 M，pH 6.0），并让其在室温下反应4 h，直到溶液颜色逐渐从紫色变为棕色。4小时后，针对dH透析溶液（MWCO:3.5 kDa）₂O和冻干。

罗丹明6G负载PAA-MnO的合成₂(Rho@PAA-MnO₂)

荧光染料罗丹明6G负载到PAA-MnO上₂基于罗丹明6G与PAA-MnO的重量比₂（0.5%和1%）。简单地说，1克PAA-MnO₂溶解在20 ml dH中₂向PAA-MnO中添加O和5 mg罗丹明6G₂解决方案。在室温下搅拌反应12小时后，根据dH透析溶液₂O（MWCO 1 kDa）6小时，冻干后获得Rho@PAA-MnO₂(0.5%).

没食子酸颗粒壳聚糖寡糖（COS-GA）的合成

使用EDC偶联剂合成COS-GAs。简言之，将1g COS（Mn 5kDa，TCI，Japan）溶于100ml dH中₂O.然后，0.49 g GA（Sigma-Aldrich）、0.34 g 1-（3-二甲基氨丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，日本东京）和0.34 gN个-将羟基琥珀酰亚胺（NHS，Sigma-Aldrich）逐滴添加到COS溶液中，并在pH值为5.0的条件下反应12 h。将产品与HCl溶液（pH 2；MWCO:1 kDa）进行透析4 h并冻干。

COS-GA的制备与表征/六个FoxM1复合体

聚电解质复合物六个FoxM1使用COS-GA形成。简单地说，将4.5 mg COS-GA溶解在724μl PBS缓冲液（pH 7.4）和50μl 20 nM中六个FoxM1溶液作为储备溶液配制。siFoxM1基因与COS-GA以N/P比10在4°C下络合15分钟。

COS-GA/肝素/ACBP复合物的制备与表征

为了制备COS-GA/肝素/ACBP复合物，将1μl 2μg/μl酰基-CoA结合蛋白（MyBioSource，美国）和2μl 2.5 mg/ml肝素（Sigma-Aldrich）混合30分钟。然后，添加2μl COS-GA溶液，所得溶液反应3小时。

统计分析

数据以至少三个实验的平均值±SD表示。使用Student t检验和GraphPad Prism进行单因素或双向方差分析（ANOVA）对结果进行分析。显著性定义为*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001和***P<0.0001。

补充材料

补充图表。

致谢

我们感谢前任和现任实验室成员的技术支持和有益意见。

资金

这项工作得到了韩国政府（MSIT）资助的韩国国家研究基金会（NRF）的资助（2022R1A4A1031259和2021R1IIA3041149），以及贸易、工业和能源部（MOTIE）资助E-J J的韩国工业技术评估研究所炼金师项目（KEIT 20018560，NTIS 1415180625）的支持。

作者贡献

概念化：E-J J；方法：JSS、EHK、AIR、SAK；调查：JSS、EHK、JHY、DHK、E-J J、JHR、SYP；可视化：JSS、EHK、JHY、DHK；资金收购：E-J J；项目管理：E-J J、JHR、SYP；监理：E-J J，JHR；撰写初稿：E-J J、EHK、SYP；写作审查和编辑：E-J J、JHR、SYP。

数据和材料可用性

所有数据都可以在正文或补充材料中找到。

竞争性利益

提交人声明，不存在竞争利益。

工具书类

1Martel-Pelletier J、Barr AJ、Cicuttini FM、Conaghan PG、Cooper C、Goldring MB。等.骨关节炎.Nat Rev Dis底漆。2016;2:16072

2L J Sandell，T Aigner。关节软骨和关节炎的变化。骨关节炎的细胞生物学.关节炎研究。2001;三:107-13

三。Kolasinski SL、Neogi T、Hochberg MC、Oatis C、Guyatt G、Block J。等.2019年美国风湿病学院/关节炎基金会手、髋和膝盖骨关节炎管理指南.关节炎护理研究。2020;72:149-62

4Price JS、Waters JG、Darrah C、Pennington C、Edwards DR、Donell ST。等.软骨细胞衰老在骨关节炎中的作用.老化细胞。2002;1:57-65

5Rim YA、Nam Y、Ju JH。软骨细胞肥大和衰老在骨关节炎发生和发展中的作用.国际分子科学杂志。2020;21:2358

6Ashraf S、Cha BH、Kim JS、Ahn J、Han I、Park H。等.软骨细胞衰老相关信号机制对软骨组织再生的调控.骨关节炎软骨。2016;24:196-205

7曹H、陈明、崔X、刘Y、刘Y和邓S。等.脐带源间充质干细胞靶向软骨细胞外泌体缓释治疗无细胞骨关节炎，使老化软骨细胞再生.ACS纳米。2023;17:13358-76

8Bolduc JA、Collins JA和Loeser RF。活性氧、衰老与关节软骨稳态.自由基生物医药。2019;132:73-82

9Liu Y，Zhang Z，Li T，Xu H，ZhangH。骨关节炎的衰老：从机制到潜在治疗.关节炎研究与治疗。2022;24:174

10Maneiro E、Martín MA、De Andres MC、López-Armada MJ、Fernández-Sueiro JL、Hoyo P。等.患有骨关节炎的人类关节软骨细胞线粒体呼吸活动发生改变.大黄性关节炎。2003;48:700-8

11Wu X、Liyanage C、Plan M、Stark T、McCubin T、Barrero RA。等.骨关节炎患者能量代谢失调损害软骨细胞功能.骨关节炎软骨。2023;31:613-26

12Yang X、Chen W、Zhao X、Chen-L、Li W、Ran J。等.丙酮酸激酶M2调节骨关节炎软骨细胞和细胞外基质的糖酵解.DNA细胞生物学。2018;37:271-7

13Adams SB、Setton LA、Kensicki E、Bolognesi议员、Toth AP、Nettles DL。人类骨关节炎滑膜的整体代谢谱.骨关节炎软骨。2012;20：64-7

14Kim S、Hwang J、Kim J、Ahn JK、Cha HS、Kim KH。膝关节骨性关节炎患者滑液代谢变化与影像学严重程度的关系.关节骨脊柱。2017;84:605-10

15沈J、王C、李D、徐T、迈尔斯J、阿什顿JM。等.DNA甲基转移酶3b通过改变代谢调节关节软骨稳态.JCI洞察力。2017;2：e93612

16Loef M、Schoones JW、Kloppenburg M、Ioan-Facsinay A。脂肪酸与骨关节炎：不同类型，不同影响.关节骨脊柱。2019;86:451-8

17Abshirini M、Ilesanmi-Oyeller BL、Kruger MC。长链多不饱和脂肪酸对骨细胞和软骨细胞代谢的潜在调节机制.程序脂质研究。2021;83:101113

18Ruiz-Romero C、Calamia V、Mateos J、Carreira V、Martínez-Gomariz M、Fernández M。等.骨关节炎患者关节软骨细胞线粒体失调的蛋白质组学分析：线粒体超氧化物歧化酶的减少表明氧化还原失衡.分子细胞蛋白质组学。2009;8:172-89

19姜恩、邢乙、彭瑞、尚杰、吴乙、肖鹏。等.抑制Cpt1a通过调节线粒体功能障碍和激活线粒体吞噬功能减轻氧化应激诱导的软骨细胞衰老.机械老化发展。2022;205:111688

20Lee SW、Rho JH、Lee SY、Chung WT、Oh YJ、Kim JH。等.膳食脂肪相关的骨关节炎软骨细胞通过PKCK2/STAMP2/FSP27获得抗脂毒性.骨骼研究。2018;6:20

21Bastiaansen-Jenniskens YM、Siawash M、van de Lest CHA、Verhaar JAN、Kloppenburg M、Zuurmond A-M。等.单不饱和和饱和，而非n-6多不饱和脂肪酸在炎症条件下减少软骨破坏：一项初步研究.软骨。2013年；4：321-8

22Alvarez-Garcia O、Rogers NH、Smith RG、Lotz MK。棕榈酸酯对关节软骨具有促凋亡和促炎作用，并与白细胞介素-1协同作用.风湿性关节炎。2014;66:1779-88

23Tan L、Harper LR、Armstrong A、Carlson CS、Yammani RR。膳食饱和脂肪酸棕榈酸酯促进小鼠膝关节软骨损伤并激活未折叠蛋白反应途径.公共科学图书馆一号。2021;16：e0247237

24宋杰、康毅、尹S、春秋、晋江。HIF-1α：CRAT:miR-144-3p轴失调促进骨关节炎软骨细胞凋亡和VLCFA积累.Oncotarget公司。2017;8:69351-61

25Song J、Baek IJ、Chun CH、Jin EJ。NUDT7-PGAM1轴的失调是骨关节炎发病过程中软骨细胞死亡的原因.国家公社。2018;9:3427

26Park S、Baek IJ、Ryu JH、Chun CH、Jin EJ。PPARα-ACOT12轴通过调节新生脂肪生成来维持软骨内环境稳定.国家公社。2022;13:3

27李杰、张浩、韩毅、胡毅、耿Z、苏杰。骨关节炎的靶向性和反应性生物材料.热学。2023;13:931-54

28张浩，吴斯，陈伟，胡毅，耿Z，苏杰。骨/软骨靶向水凝胶：策略和应用.生物活性物质。2023;23:156-169

29Sahranavard M、Sarkari S、Safavi S、Ghorbani F。脱细胞细胞外基质生物印迹的三维生物展示用于软骨再生：一项系统综述.Biomater Transl.公司。2022;三:105-15

30Pinho E、Soares G、Henriques M。环糊精对没食子酸体外抗菌活性的调节.包括酚类大环化学杂志。2015;81:205-14

31Lee JS、Cho JH、An S、Shin J、Choi S、Jeon EJ。等.原位自交联、长期稳定的透明质酸填充剂，通过没食子酸自氧化进行组织增强和皱纹矫正.化学材料。2019;31:9614-24

32Di Micco R、Krizhanovsky V、Baker D、D'Adda Di Fagagna F。衰老中的细胞衰老：从机制到治疗机会.Nat Rev Mol细胞生物学。2021;22:75-95

33Coryell PR、Diekman BO、Loeser RF。骨关节炎细胞衰老的机制及治疗意义.国家风湿病研究所。2021;17:47-57

34Yudoh K、Nguyen van T、Nakamura H、Hongo-Masuko K、Kato T、Nishioka K。氧化应激在软骨衰老和骨关节炎发展中的潜在作用：氧化应激诱导软骨细胞端粒不稳定和软骨细胞功能下调.关节炎研究与治疗。2005;7：R380-91

35Brandl A、Hartmann A、Bechmann V、Graf B、Nerlich M、Angele P。氧化应激诱导软骨细胞衰老.矫形研究杂志。2011;29:1114-20

36Yagi M、Endo K、Komori K、Sekiya I。氧化应激和炎症应激对大鼠软骨细胞衰老影响的比较.科学代表。2023;13:7697

37尚杰、林恩、彭瑞、姜恩、吴乙、邢乙。等.抑制Klf10通过调节线粒体吞噬减轻氧化应激诱导的软骨细胞衰老.分子。2023;28:924

38Kim S、Lee K、Choi YS、Ku J、Kim H、Kharbash R。等.线粒体双链RNA控制软骨细胞的应激反应，促进骨关节炎的发展.单元格代表。2022;40:111178

39黄J，孟P，王C，张Y，周L。细胞器相互作用与细胞衰老的相关性.热学。2022;12:2445-64

40Ogrodnik M、Miwa S、Tchkonia T、Tiniakos D、Wilson CL、Lahat A。等.细胞衰老导致年龄依赖性肝脂肪变性.国家公社。2017;8:15691

41Dabravolski SA、Bezsonov EE、Orekhov AN。线粒体功能障碍和肝脏衰老在NAFLD发生发展中的作用.生物药物治疗。2021;142:112041

42澳大利亚Gurkar Hamsanathan S。脂质作为细胞衰老的调节器.前生理学。2022;13:796850

43卡拉希尔D，约翰S，奈尔AS。FOXM1与癌症：错误的细胞信号破坏体内平衡.前Oncol。2021;10:626836

44Fischer M、Schade AE、Branigan TB、佐治亚州米勒、JA迪卡普里奥。协调细胞周期中的基因表达.生物化学科学趋势。2022;47：1009-22

45Cai Y、Balli D、Ustiyan V、Fulford L、Hiller A、Misetic V。等.前列腺上皮细胞中Foxm1的表达对前列腺癌的发生至关重要.生物化学杂志。2013年；288:22527-41

46王IC、Ustiyan V、Zhang Y、Cai Y、Kalin TV、Kalinichenko VV。Foxm1转录因子是致癌KrasG12D启动肺肿瘤发生所必需的.致癌物。2014;33:5391-6

47Anders L、Ke N、Hydbring P、Choi YJ、Widlund HR、Chick JM。等.CDK4/6底物的系统筛选将FOXM1磷酸化与癌细胞衰老抑制联系起来.癌细胞。2011;20：620-34

48曾R-M，卢X-H，林J，胡J，荣Z-J，徐伟川。等.敲除FOXM1减轻人类骨关节炎软骨细胞的炎症反应.国际免疫药理学。2019;68:74-80

作者联系人

通讯作者：电子邮件：jineunjung交流kr。

---

收到日期：2023-8-10
2023-9-13接受
发布日期：2023-9-25

---

引文样式

---

©2024Ivyspring国际出版社.使用条款