J癌症 2022; 13（6）：1837-1847年。 doi:10.7150/jca.66126 这个问题 引用
研究论文
LPCAT1通过上调肺腺癌EGFR/PI3K/AKT信号通路促进吉非替尼耐药 丁江华 1* 、丁馨静 2* 、梁朝晖 1
1.中国江西省九江市九江大学附属医院血液肿瘤科。 2.中国江西省南昌市南昌大学医学院本科生部。 *这些作者为这项工作做出了同等贡献。
引用： 丁J，丁X，冷Z.LPCAT1通过上调肺腺癌EGFR/PI3K/AKT信号通路促进吉非替尼耐药。 J癌症 2022; 13(6):1837-1847. doi:10.7150/jca.66126。 https://www.jcancer.org/v13p1837.htm
复制 其他样式 摘要 目前，表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药机制已成为临床研究的热点。 尽管获得性EGFR-TKI耐药的大多数机制已被揭示，但约30%的非小细胞肺癌（NSCLC）病例尚未完全阐明，尤其是肺腺癌（LUAD）。 最近，LPCAT1是磷脂代谢的一种重要酶，被发现可以在癌基因和代谢重编程之间架起桥梁。 在非小细胞肺癌中，LPCAT1已被证明参与进展和转移。 然而，LPCAT1在获得性EGFR TKI抗性中的作用尚不清楚。 在本研究中，相对于相应的EGFR-TKI敏感细胞系（PC-9），在EGFR-TKI抗性细胞系（PC-9R）中观察到LPCAT1表达升高。 体内 和 在体外 基因功能研究表明，LPCAT1参与了LUAD吉非替尼耐药的发病机制，形成LPCAT1-EGFR正反馈环，然后调节其EGFR/PI3K/AKT信号通路的下游信号分子。 这些结果从磷脂代谢的角度为EGFR-TKI获得性耐药机制提供了新的见解。 这些发现表明LPCAT1可能是EGFR-TKI耐药NSCLC患者的潜在治疗靶点。
关键词 ：LPACTA1、吉非替尼耐药、EGFR/PI3K/AKT信号、肺腺癌
介绍 肺癌是中国癌症死亡的主要原因，2020年有714699人死于肺癌[ 1 ]. 非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌的85%，肺腺癌（LUAD）是NSCLC最常见的组织学亚型，占80%的病例[ 2 ]. 随着新型靶分子疗法的不断出现，尤其是对表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的患者，晚期LUAD患者的预后发生了革命性变化。 因此，一线EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）单一疗法，如吉非替尼、厄洛替尼和西美替尼，目前被推荐为标准疗法。 迄今为止，据报道，奥西米替尼最长的无进展生存期为18.9个月[ 三 ]. 同时，由于价格低廉，吉非替尼已成为携带EGFR-阳性突变的晚期非小细胞肺癌患者在中国使用最广泛的药物。 不幸的是，几乎所有这些患者最终都对EGFR TKI产生获得性耐药性，这直接影响了他们的临床预后和总体生存率。
除了经典的EGFR-T790M突变和转化为小细胞肺癌（SCLC）表型外，还发现了导致EGFR-TKI耐药的旁路信号通路异常激活，如c-MET扩增和PI3K/AKT通路异常激活[ 4 ]. 特别是，EGFR/PI3K/AKT信号被证实参与了NSCLC细胞化疗耐药的发病机制[ 5 ]. 然而，大约三分之一的EGFR-TKI耐药肺癌患者的EGFR-TKI耐药获得机制尚不清楚。 因此，有一个尚未满足的临床需要，即阐明控制EGFR-TKI耐药性的新机制。
众所周知，代谢重编程正在成为癌症研究领域的一个热点。 癌细胞可以改变其代谢碳水化合物、脂类和蛋白质的能力，以争取细胞增殖和生存，包括肺癌细胞[ 6 - 9 ]. 最近，据报道，脂代谢酶溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1（LPCAT1）过度表达，并在前列腺癌、胃癌和肝癌等多种癌症中发挥促肿瘤作用[ 10 - 12 ]. 在脑胶质瘤细胞中，LPCAT1有助于膜脂的重塑，并诱导细胞膜上EGFR信号通路的激活，从而刺激细胞增殖并进一步促进LPCAT1的合成[ 13 ]. 这些结果表明，LPCAT1和EGFR信号的激活之间存在正反馈调节机制，可以称为“LPCAT1-EGFR反馈回路”[ 13 ]. 上述结果强烈提示非小细胞肺癌患者LPCAT1和EGFR信号通路之间存在潜在关联。 此外，LPCAT1通过上调PI3K/AKT/MYC通路促进LUAD的脑转移[ 14 ]. 然而，LPCAT1在吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞中的作用尚不清楚。
在本报告中，选择了三种细胞系（MRC-5、PC-9和PC-9R），分别代表正常人胚肺细胞、含有EGFR外显子19缺失突变的吉非替尼敏感细胞和吉非替尼布耐药细胞。 由于EGFR TKI在中国的广泛应用，吉非替尼被选为研究代理。 我们首先研究了三种细胞系中LPCAT1的基线水平，我们的数据显示，LPCAT1在PC-9R细胞中的表达显著高于PC-9或MRC-5细胞。 然后，进行LPCAT1基因敲除，发现该基因敲除与恢复PC-9R细胞对吉非替尼的敏感性密切相关。 最后，PI3K/AKT通路被证实积极参与LPCAT1介导的吉非替尼耐药的发展 在体外 和 体内 .
材料和方法 细胞系、动物和试剂 PC-9和PC-9R细胞系购自Beinabiology Co.，Ltd.（中国北京），MRC-5细胞系购于Procell Life Science&Technology Co，Ltd（中国武汉）。 5周龄雄性BALB/c裸鼠取自湖南四甲实验动物有限公司（中国长沙）。 吉非替尼（CAS:184475-35-2）和PI3K/AKT通路抑制剂LY294002（CAS:154447-36-6）分别购自上海源业生物技术有限公司（中国上海）和美国新泽西州蒙茅斯交界市MedChemExpress。
细胞培养 PC-9、PC-9R和MRC-5细胞系在罗斯韦尔公园纪念研究所1640培养基（Gibco，Grand Island，NY，USA）中培养，该培养基含有10%胎牛血清和1%双重抗生素（中国北京索拉比奥），然后保持在标准条件下（即5%CO 2 和95%大气，37°C）。 每三天更换一次培养基，当细胞密度达到80%至90%时，用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化。
细胞转染 细胞达到80%融合后，将培养基换成无血清培养基。 根据说明书，使用Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）进行细胞转染。 使用来自GeneChem公司（中国上海）的慢病毒shRNA技术构建稳定表达LPCAT1特异性短发夹RNA（shRNA）或扰乱对照shRNA的PC-9和PC-9R细胞系。 LPCAT1 shRNA是根据小干扰RNA（siRNA）序列（GenBank识别号：79888）设计的。
用于获得LPCAT1过表达序列的引物如下：F:5’-CCCTGGACCATGACGTGTGGT-3’，R:5’-TGAATGCAGTTGAAGGT-3’。 同时，用于LPCAT1过表达阴性对照（NC）的引物如下：F:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'； R： 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3型。
另外，所使用的LPCAT1 shRNA序列如下：（1）F:5'-GGACAG AUACUCCAGAAAGATT-3’，R:5'-UCUUUCUGAGUAUCUCUCCTT-3’； （2） 5'-CCAUUG ACCAGAGGAGAATT-3'，R:5'-UUCUCCUUGGUCAAGGAGAGTT-3'； 和（3）F:5'-CUGAGGAGAGAGAAGAGAATT-3'，R:5'-UUCCUUCCUCCUCAGTT-3'。 最后，羧基荧光素（FAM）标记的NC siRNA序列如下：F:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'； R： 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。 所有引物对均由Beyotime（中国上海）合成。
细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测 使用KeyGEN Biotechnology（中国南京）的CCK-8试剂盒进行细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测。 PC-9和PC-9R细胞系在1.0×10的96个平板上进行电镀 4 细胞/孔，然后用不同浓度的吉非替尼处理 ( 5 nM、500 nM、1μM、20μM或40μM ) 48小时。 随后将细胞与10%CCK-8溶液在37°C下孵育2小时。 最后，使用多功能酶联分析仪（美国弗吉尼亚州Bio-Tec）测量450 nm处的吸光度。 每个实验至少重复三次。
细胞凋亡的流式细胞术 总计1×10 6 收集各组细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并悬浮在500μL的结合缓冲液中。 然后，根据制造商的说明，在室温下用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶凋亡检测试剂盒（BD Biosciences，San Diego，CA，USA）对细胞进行10分钟的染色。 流式细胞仪检测细胞凋亡。
定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析 定量实时转录-PCR（qRT-PCR）用于检测 LPCAT1型 基因。 使用超纯RNA试剂盒（CoWin Biosciences，中国北京）提取总RNA； 然后，使用HiScript®II Q RT SuperMix进行qPCR逆转录（Vazyme，中国南京）。 使用2×SYBR Green PCR Master Mix（中国厦门Lifeint）在实时荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR（CFX Connect；Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）。 β-肌动蛋白基因被用作内部参考基因，并使用2 -ΔΔct 方法。 PCR引物来自Beyotime（中国上海）。 所有实验都是根据制造商的协议进行的。 实验至少进行了三次。
使用的PCR引物序列如下：LPCAT1（F）5'-CCCTGGACCATGACGTGTGGT-3，（R）5'-TGAATGCACAGGTTTGAAGGT-3’和β-actin（F）5’-TGGCACCCAGCACATGAA-3’，（R。
蛋白质印迹分析 从不同组收集的细胞在放射免疫沉淀分析裂解缓冲液中进行裂解（中国北京阿普里根）。 随后，将细胞以12000rpm离心10分钟。 然后，取上清液，通过双茚四酮酸测定法（CoWin Biosciences）测定总蛋白。 用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质，并转移到聚偏氟乙烯膜（Millipore，Burlington，MA，USA）。 然后，用5%牛血清白蛋白（Solarbio）封闭膜，随后使用各自的一级抗体在4°C下探测过夜。 然后将膜与辣根过氧化物酶结合的二级抗体（ZSGB-BIO，中国北京）在室温下孵育2小时。 最后，通过增强化学发光（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）和Chemi Doc™XRS+系统（Bio-Rad Laboratories）测量靶蛋白。 甘油醛3-磷酸脱氢酶（GADPH）（AB-P-R-001#，1:1000稀释，中国杭州GOODHERE）作为内部控制。 主要抗体信息如下：抗LPCAT1（ab214034，1:1000稀释，Abcam，Cambridge，MA，USA），抗EGFR（A-10，1:1000，Santa Cruz，CA，USA，），抗p-EGFR（F-3,1:1000稀释，Santa Cruz，加利福尼亚州，USA， t-AKT（C67E7，1:1000，CST，MA，USA）和辣根过氧化物酶（HRP）结合的抗兔二级抗体（ab205718，1:5000稀释，Abcam，Cambridge，MA，US）。
体内 异种移植试验和伦理声明 通过悬浮1×10制备PC-9R细胞 6 细胞接种在200μL无血清PBS中，然后皮下接种到5周龄雌性BALB/c裸鼠的右后侧翼。 通过将250-mg临床级片剂溶于150μL 0.05%吐温-80（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）的无菌水中制备吉非替尼。 当移植瘤体积达到100 mm时 三 （体积=0.5×a×b 2 ，其中a是长直径，b是短直径），用如下所示的不同药物治疗小鼠（每组3个）。 每三天在可触及时测量一次异种移植瘤体积。
（1）吉非替尼（10 mg/kg）每日口服一次，（2）LY294002（2.5 mg/kg）每三天腹腔注射，（3）吉非替尼和LY29400 2以相同剂量联合治疗，或（4）等量稀释剂作为对照治疗。 治疗12天后，用常规颈椎脱位法对小鼠实施人道安乐死。 肿瘤被切除并解剖以进行进一步的病理评估。 苏木精和伊红染色评估异种移植瘤组织的病理和形态学变化。 本研究获得九江大学附属医院伦理委员会的伦理批准。
统计分析 数据表示为平均值±标准偏差值。 通过Student t检验评估两组之间的组间差异。 通过单因素方差分析评估多组之间的差异。 经方差分析后的组间比较采用Student-Newman-Keuls方法进行验证。 在本研究中，所进行的实验是独立进行的，至少一式三份。 重大差异定义为 第页 < 0.05.
结果 LPCAT1在PC-9R和PC-9细胞系中的表达 以正常人胚肺细胞（MRC-5细胞）为对照细胞系。 如所示 图 1 LPCAT1在PC-9R细胞系中的mRNA表达显著高于PC-9和MRC-5细胞系。 与MRC-5细胞系相比，PC-9细胞系显示LPCAT1 mRNA水平增强( 图 1 A类 ). 同样，LPCAT1蛋白水平按表达降序排列如下：PC-9R、PC-9和MRC-5细胞系( 数字 1 B和 1 C类 ).
PC-9和PC-9R细胞对吉非替尼的敏感性 为了探讨吉非替尼对PC-9和PC-9R细胞株的敏感性，我们采用CCK-8方法进行了细胞活性分析。 如所示 数字 2 B类 和 二维 、IC 50 PC-9和PC-9R细胞系中吉非替尼的值分别为12653nM（12.653μM）和53480nM（53.48μM），这进一步验证了PC-9R和PC-9细胞对吉非替尼比的耐药性。 考虑到实验效率，我们选择12.653μM和53.48μM的浓度作为以下实验的最佳浓度。
qRT-PCR和western印迹法验证LPCAT1转染 在本研究中，我们首先分别用LPCAT1过表达载体和空载体转染PC-9和PC-9R细胞系。 如所示 图 三 ，在PC-9或PC-9R细胞系中，与用空载体和NC处理的组相比，用LPCAT1过表达载体处理的组中LPCAT1mRNA和蛋白质水平显著升高( 数字 三 A和 三 C类 ). 此外，我们设计了三个siRNA来干扰PC-9和PC-9R细胞系中LPCAT1的表达，如 图 三 ，siRNA组中的PC-9或PC-9R细胞系表现出比空载体组和NC组更低的LPCAT1mRNA和蛋白质水平。 这些发现证实了转染是成功的。
由于PC-9R细胞系的干扰效率最高，我们选择siRNA2-LPCAT1进行后续实验( 数字 三 B和 三 D类 )（以下称为“干扰”组）。
LPCAT1基因敲除对PC-9和PC-9R细胞增殖和凋亡的影响 在前一节中，PC-9R细胞的LPCAT1水平明显高于PC-9细胞。 因此，我们进一步探讨了LPCAT1对PC-9和PC-9R细胞系中细胞增殖和凋亡的影响。 根据本研究中前面提到的方法，在PC-9或PC-9R细胞系中通过siRNA成功地敲除LPCAT1，即干扰处理。
图1 LPCAT1在PC-9R和PC-9细胞系中的表达。 （A） LPCAT1 mRNA表达从高到低的顺序为：PC-9R、PC-9和MRC-5细胞系。 （B） 通过western blotting验证LPCAT1的蛋白表达水平为相同的顺序。 （C） 使用Quality-One软件（Bio-Read Laboratories）通过密度测定法分析色带（*p<0.05 vs.MRC-5组； # 与PC-9组相比，p<0.01）。
图2 PC-9R和PC-9细胞株对吉非替尼的敏感性。 （A和B） 用不同浓度的吉非替尼处理PC-9细胞48小时。 IC 50 PC-9细胞总数为12653 nM。 （C和D） PC-9R细胞株暴露于不同浓度的吉非替尼48小时。 IC 50 PC-9R的含量为53480 nM。 （B、D） 横坐标表示log10C，C表示浓度； 然后，纵坐标表示百分比（与对照组相比p<0.05）。
如中所示 图 4 与吉非替尼/干扰NC组、吉非替尼组和对照组相比，吉非替宁/干扰组PC-9或PC-9R细胞的细胞活力显著降低( 数字 4 A和 4 D类 )这强烈表明LPCAT1敲除恢复了吉非替尼的敏感性，并抑制了PC-9R细胞系中的细胞增殖。
在PC-9细胞系中，吉非替尼/干预组的细胞凋亡率显著高于其他三组( 数字 4 B和 4 C类 ). 然而，LPCAT1 siRNA的干扰未能诱导PC-9R细胞凋亡。 这些结果表明，其他机制（如阻止细胞周期）与转染LPCAT1 siRNA的PC-9R细胞的增殖抑制有关。
LPCAT1对PC-9R细胞EGFR/PI3K/AKT通路的影响 在本研究中，根据Jiao的文献，选择25μM的PI3K/AKT途径抑制剂LY294002作为实验浓度 等。 [ 15 ]. 为了探讨LPCAT1表达如何影响LUAD中吉非替尼耐药，我们使用LPCAT1 siRNA和过表达载体干扰和上调LPCAT1，并使用LY294002抑制PC-9R细胞系中的PI3K/AKT通路，荧光素酶siRNA作为对照组。
如所示 图 5 A类 与对照组相比，吉非替尼治疗显著降低PC-9R细胞中EGFR、p-EGFR、PI3k和p-AKT蛋白的水平。 与吉非替尼组相比，干扰LPCAT1加吉非替尼治疗显著降低了PC-9R细胞中EGFR、p-EGFR、PI3K和p-AKT蛋白的表达。 未观察到总AKT（t-AKT）蛋白表达的显著变化。 如所示 图 5 B类 ，与吉非替尼组相比，吉非替尼和LY294002联合治疗显著降低了PI3K和p-AKT蛋白的水平。 与吉非替尼单药治疗相比，LPCAT1过度表达显著提高了EGFR、p-EGFR、PI3K和p-AKT蛋白的表达水平。 此外，与LPCAT1过表达加吉非替尼治疗组相比，添加LY294002明显降低PC-9R细胞中EGFR、p-EGFR、PI3K和p-AKT蛋白的水平。 同样，t-AKT表达也没有显著变化。 上述结果表明，LPCAT1是调控PC-9R细胞EGFR/PI3K/AKT信号通路的重要上游分子。
图3 通过qRT-PCR和western blotting验证LPCAT1转染。 （A） PC-9细胞系转染LPCAT1过表达。 （B） 用LPCAT1 siRNA转染PC-9细胞株，敲除LPCAT1。 （C） 用LPCAT1过表达转染PC-9R细胞系。 （D） 用LPCAT1 siRNA转染PC-9R细胞株，敲除LPCAT1。 通过qRT-PCR和western blotting检测LPCAT1 mRNA和蛋白的表达水平。 [*p<0.05与对照组（PC-9或PC-9R）相比； # 与PC-9 NC或PC-9R NC相比，p<0.01。
LPCAT1基因敲除对PC-9R细胞荷瘤小鼠异种移植的影响 由于上述结果表明，LPCAT1介导的PC-9R细胞对吉非替尼的耐药性与EGFR/PI3K/AKT通路密切相关，我们接下来通过建立荷瘤小鼠模型验证了这一结果。
如中所述 数字 6 和 7 与对照组相比，吉非替尼组和干扰NC加吉非替尼组异种移植瘤体积略有减少( 数字 6 A类- 6 C和7 ). 然而，与吉非替尼单一疗法相比，吉非替尼加干预组的治疗显著减少了异种移植瘤的体积( 数字 6 B、 6D和7 ). 类似地，与干扰NC加吉非替尼相比，添加LY294002实质上触发了肿瘤缩小( 数字 6 C、 6E和7 ). 特别是，与其他五组相比，干扰、LY294002和吉非替尼联合组异种移植瘤的体积显著缩小( 数字 6 A类- 6 E和7 ).
此外，苏木精和伊红染色用于阐明异种移植瘤组织的病理和形态学变化。 如中所示 图 8 与对照组相比，吉非替尼治疗导致轻微的细胞坏死和较小的细胞核( 数字 8 A和 8 B类 ). 与吉非替尼组相比，无论是干扰加吉非替尼组还是干扰NC组，LY294002加吉非替尼组肿瘤细胞的细胞核明显更小，细胞坏死更大，细胞间隙更大 （图 8 B、 8D-8E） 值得注意的是，与其他五组相比，干扰素、LY294002和吉非替尼的联合治疗导致大量肿瘤细胞坏死、细胞核固缩和肿瘤内血管减少( 数字 8 A类- 8 E类 ).
讨论 EGFR-TKI，尤其是吉非替尼，已广泛用于晚期非小细胞肺癌EGFR-sensitive突变患者，并显著改善了非小细胞肝癌的临床结局。 然而，几乎所有的NSCLC患者最终都会发展为EGFR-TKI耐药状态。 EGFR-TKI获得性耐药的机制非常复杂，包括T790M阳性和T790M-阴性耐药，每种耐药约占50%[ 4 ]. 对于后者，除了一些c-MET扩增和RET重排外，EGFR-TKI抗性的确切分子机制尚未完全阐明。
图4 LPCAT1基因敲除对PC-9和PC-9R细胞活性的影响 . （A） 通过CCK-8测定法分析PC-9细胞的细胞增殖。 （B和C） 流式细胞仪显示PC-9细胞凋亡。 （D） 采用CCK-8法检测PC-9细胞增殖。 （E和F） 流式细胞术检测PC-9R细胞凋亡（与对照组相比，*p<0.05； # 与吉非替尼组相比p<0.01）。
图5 LPCAT1 siRNA和过度表达对PC-9R细胞EGFR/PI3K/AKT通路的影响。 （A） LPCAT1 siRNA稳定转染PC-9R细胞。 细胞接受载体（对照）和/或吉非替尼治疗。 （B） 用LPCAT1过表达载体转染PC-9R细胞。 用载体（对照）、吉非替尼和/或LY294002处理细胞。 western blotting检测EGFR、p-EGFR、PI3K、p-AKT和t-AKT蛋白的表达。 干扰：LPCAT1 siRNA； 干扰NC:LPCAT1 siRNA阴性对照； OE：LPCAT1过度表达（*p<0.05，与对照组相比； # 与吉非替尼组相比p<0.05； ! p<0.001 vs.吉非替尼+LY294002联合治疗组）。
图6 不同组异种移植瘤的大体形态。 （A） 对照组； （B） 吉非替尼组； （C） 干扰NC； （D） 干扰加吉非替尼； （E） 干扰NC，LY294002加吉非替尼； 和 （F） 干扰，LY294002加吉非替尼。 干扰：LPCAT1 siRNA； 干扰NC:LPCAT1 siRNA阴性对照。
图7 不同组异种移植瘤体积的变化。 当异种移植物肿瘤的体积达到100毫米时 三 ，开始使用不同的药物进行治疗。 经过12天的治疗后，这些小鼠被人道地安乐死。 每三天测量一次异种移植物肿瘤体积的变化。 图表显示了平均值±标准偏差值（*p<0.05，与对照组相比； # 与吉非替尼组相比p＜0.01）。
图8 不同组异种移植瘤的苏木精和伊红染色。 （A） 对照组； （B） 吉非替尼组； （C） 干扰NC； （D） 干扰加吉非替尼； （E） 干扰NC，LY294002加吉非替尼； 和 （F） 干扰，LY294002加吉非替尼。 干扰：LPCAT1 siRNA； 干扰NC:LPCAT1 siRNA阴性对照。
近年来，包括脂质代谢在内的代谢重编程已被证实有助于肿瘤的发展、转移和耐药性[ 16 - 18 ]. 值得注意的是，LPCAT1是磷脂代谢的一种重要酶，已引起肿瘤学研究人员的广泛关注，并参与致癌和肿瘤进展[ 19 ]. 例如，LPCAT1过度表达与癌症进展呈正相关，可能是前列腺癌预后的新生物标记物[ 20 , 21 ]. 此外，LPCAT1在三阴性乳腺癌、胃癌和结直肠癌中过度表达，这与不良预后相关，并预测早期复发[ 22 , 23 ]. 在胶质瘤细胞中，LPCAT1诱导溶血磷脂酰胆碱从不饱和状态转化为饱和状态，伴随着膜脂质的重塑，导致EGFR通路的激活和补充，进而进一步促进LPCAT1的生物合成。 这被称为LPCAT1-EGFR正反馈回路[ 19 ]. 上述发现表明LPCAT1在癌基因和代谢重编程之间架起桥梁，从而促进肿瘤生长[ 24 ].
在正常肺组织中，LPCAT1被发现高度表达并调节表面活性剂脂质的生成[ 25 ]. 在非小细胞肺癌患者中，LPCAT1的患病率为80%，高于正常肺组织。 临床分析发现，与LPCAT1表达水平低的患者相比，LPCAT1高表达水平的NSCLC患者的中位总生存期显著增加。 动物实验表明LPCAT1促进非小细胞肺癌的脑转移 体内 [ 14 ]. 这些结果表明LPCAT1参与了非小细胞肺癌的肿瘤发生和发展。 然而，LPCAT1在非小细胞肺癌细胞对EGFR-TKIs耐药中的作用尚不清楚。
一项研究 在体外 结果显示，LPCAT1在PC-9细胞系（EGFR 19 del E746_A750）中的表达明显高于A459细胞系（表皮生长因子受体野生型，K-RAS突变）和H460细胞株（表皮生长激素受体野生型）[ 14 ]. 这一发现强烈表明LPCAT1与非小细胞肺癌患者EGFR基因突变密切相关。 在我们的研究中，我们发现PC-9R细胞系的LPCAT1水平显著高于其亲本细胞系PC-9。 细胞活性的进一步分析表明，LPCAT1敲除恢复了吉非替尼的敏感性，并抑制了PC-9R细胞系的细胞增殖。 然而，与PC-9细胞系中LPCAT1基因敲除的促凋亡不同，沉默LPCAT1不会诱导PC-9R细胞的细胞凋亡。 潜在的机制可能是由于抑制PC-9R细胞中的LPCAT1而导致细胞周期阻滞在G1期[ 14 ].
根据上述文献，LPCAT1-EGFR正反馈回路有助于神经胶质瘤细胞的肿瘤发生[ 19 ]. 在皮肤鳞状细胞癌中，LPCAT1通过EGFR-介导的AKT/p38MAPK信号通路促进进展[ 26 ]. 巧合的是，EGFR/PI3K/AKT信号转导与NSCLC细胞耐药的发生以及LUAD向肺鳞癌的转化密切相关[ 5 , 27 , 28 ]. 受这些结果的启发，我们研究了LPCAT1如何介导PC-9R细胞系对吉非替尼的耐药性。 在本研究中，我们发现敲除LPCAT1确实显著降低了PC-9R细胞系中EGFR、PI3K和AKT蛋白的表达水平。 相反，LPCAT1的过表达显著增强了PC-9R细胞系中EGFR、PI3K和AKT蛋白的水平。 基于这些发现，我们可以得出结论，EGFR/PI3K/AKT级联是LUAD中LPCAT1的重要下游信号通路。 最后，一个 体内 本研究旨在观察LPCAT1基因敲除对PC-9R细胞荷瘤小鼠的影响。 我们发现，在异种移植模型中，LPCAT1沉默导致PC-9R细胞系中肿瘤缩小并恢复吉非替尼敏感性。 进一步 体内 实验表明，LY294002在LPCAT1基因敲除的基础上，基本上规避了吉非替尼的耐药性，并促进了吉非替尼诱导的异种移植瘤收缩。 巧合的是，周的研究 等。 据报道，LY294002对埃洛替尼化疗的EGFR野生型NSCLC细胞系具有致敏活性[ 29 ]. 这些结果强烈表明，LPCAT1可以通过激活EGFR/PI3K/AKT信号通路，促进LUAD对吉非替尼的耐药性。
结论 总之，我们的研究报告显示，与相应的EGFR-TKI敏感细胞系相比，在EGFR-TK1耐药细胞系中观察到LPCAT1增强。 一项功能研究发现，LPCAT1参与了LUAD中吉非替尼耐药的发病机制，其机制可能至少部分归因于EGFR/PI3K/AKT信号级联的正调控。 本研究还从磷脂代谢的角度对EGFR TKIs获得性耐药的机制提供了新的见解。 由于LPCAT1在多种癌症中高表达，LPCAT1可能成为靶向治疗的潜在靶点。
当然，这项研究也有不足之处。 一是只研究了少数几种单细胞类型； 另一个原因是LPCAT1与主要耐药突变（如T790M突变）的关联性尚未被探索。 这些问题需要在我们未来的研究中进一步探讨。
致谢 我们感谢LetPub（www.LetPub.com）在编写本手稿期间提供的语言帮助。
基金 这项工作得到了中国江西省教育厅（批准号：190901）的支持。
竞争性利益 提交人声明，不存在竞争利益。
工具书类 1 曹伟，陈HD，于玉伟，李恩，陈文清。 全球和中国癌症负担的变化：2020年全球癌症统计数据的二次分析 . 《中华医学杂志》（英文）。 2021; 134 :783-91
2 Butnor KJ公司。 肺腺癌组织学分型的争议与挑战 . Transl肺癌研究。 2020; 9 :839-46
三。 Ramalingam SS、Vansteenkiste J、Planchard D、Cho BC、Gray JE、Ohe Y、Zhou C、Reungwetwattana T、Cheng Y、Chewaskulyong B。 等 . 奥西莫替尼治疗未经治疗、EGFR-突变的晚期非小细胞肺癌的总体生存率 . N英格兰医学杂志。 2020; 382 :41-50
4 高杰，李HR，金C，蒋建华，丁俊英。 克服EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌获得性耐药性的策略 . 临床转化肿瘤。 2019; 21 :1287-301
5 Zhang Y，Han CY，Duan FG，Fan XX，Yao XJ，Parks RJ，Tang YJ，Wang MF，Liu L，Tsang BK.张Y，韩CY，段FG，范XX，姚XJ，帕克斯RJ，唐YJ，王MF，刘L，曾BK。 p53通过升高活性氧物种和抑制EGFR/PI3K/AKT信号转导而使耐药非小细胞肺癌增敏 . 癌症细胞国际。 2019; 19 :188-201
6 Martinez-Reyes I，Chandel NS。 癌症代谢：展望 . Nat Rev癌症。 2021; 21 :669-80
7 Vanhove K、Graulus GJ、Mesotten L、Thomeer M、Derveaux E、Noben JP、Guedens W、Adriaens P。 肺癌的代谢景观：糖代谢紊乱的新见解 . 前Oncol。 2019; 9 :1215-34
8 Merino SM、Gomez DCM、Moreno RJ、Falagan MS、Sanchez MR、Casado E、Ramirez DMA、Sereno M。 脂质代谢与肺癌 . Oncol Hematol评论。 2017; 112 :31-40
9 Mohamed A、Deng X、Khuri FR、Owonikoko TK。 谷氨酰胺代谢改变与肺癌的治疗机会 . 临床肺癌。 2014; 15 :7-15
10 杜毅，王强，张X，王X，秦C，盛Z，尹H，蒋C，李J，徐T。 透明细胞肾癌中溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1上调及伴随的磷脂改变 . 实验临床癌症研究杂志。 2017; 36 :66-77
11 Uehara T、Kikuchi H、Miyazaki S、Iino I、Setoguchi T、Hiramatsu Y、Ohta M、Kamiya K、Morita Y、Tanaka H。 等 . 胃癌中溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1的过度表达及伴随的脂质改变 . 安·苏格·昂科尔。 2016; 23 （补充2）：S206-13
12 Zhou X、Lawrence TJ、He Z、Pound CR、Mao J、Bigler SA。 溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1（LPCAT1）的表达水平与前列腺癌的进展相关 . 实验分子病理学。 2012; 92 :105-10
13 Bi J、Ichu TA、Zanca C、Yang H、Zhang W、Gu Y、Chowdhry S、Reed A、Ikegami S、Turner KM。 等 . 生长因子信号通路中的癌基因扩增导致肿瘤依赖于膜脂重塑 . 单元格元数据。 2019; 30 :525-38
14 Wei C、Dong X、Lu H、Tong F、Chen L、Zhang R、Dong J、Hu Y、Wu G、Dong X。 LPCAT1通过上调PI3K/AKT/MYC通路促进肺腺癌脑转移 . 实验临床癌症研究杂志。 2019; 38 :95-111
15 焦德、王杰、陆伟、唐十、陈杰、牟赫、陈庆英。 姜黄素通过调节c-Met依赖的PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制肺癌中HGF诱导的EMT和血管生成 . Mol-Ther-Oncolytics公司。 2016; 三 :16018
16 Momcilovic M，Shackelford DB。 癌症代谢成像 . Biomol Ther（首尔）。 2018; 26 :81-92
17 巴甫洛娃NN，汤普森CB。 癌症代谢的新特征 . 单元格元数据。 2016; 23 :27-47
18 戈麦斯DCM、拉米雷斯DMA。 微靶向肿瘤代谢：基于脂质代谢打开新的治疗窗口 . 脂质研究杂志。 2016; 57 :193-206
19 Swinnen合资公司，Dehairs J，Talebi A。 膜脂重塑在生长因子受体驱动的癌症发展中占据中心地位 . 单元格元数据。 2019; 30 :407-8
20 Zhou X、Lawrence TJ、He Z、Pound CR、Mao J、Bigler SA。 溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1（LPCAT1）的表达水平与前列腺癌的进展相关 . 实验分子病理学。 2012; 92 :105-10
21 刘毅，杨C，张Z，姜浩。 肠道微生物失调通过增加LPCAT1表达和增强DNA修复途径加速前列腺癌进展 . 前Oncol。 2021; 11 :679712
22 Lebok P、von Hassel A、Meiners J、Hube-Magg C、Simon R、Hoflmayer D、Hinsch A、Dum D、Fraune C、Gobel C。 等 . 溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1（LPCAT1）上调与乳腺癌预后不良有关 . 老龄化（纽约州奥尔巴尼）。 2019; 11 :7796-804
23 Mansilla F、Da CK、Wang S、Kruhoffer M、Lewin TM、Orntoft TF、Coleman RA、Birkenkamp-Demtroder K。 人结直肠癌中溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1（LPCAT1）的过度表达 . 《分子医学杂志》（柏林）。 2009; 87 ：85-97
24 Swinnen J V、Dehairs J、Talebi A。 膜脂重塑在生长因子受体驱动的癌症发展中占据中心地位 . 单元格元数据。 2019; 30 :407-8
25 Lin S、Ikegami M、Moon C、Naren AP、Shannon JM。 溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1（LPCAT1）与磷脂转移蛋白StarD10特异性相互作用促进肺泡II型细胞中表面活性剂磷脂的转运 . 生物化学杂志。 2015; 290 :18559-74
26 黄毅、王毅、王毅、汪N、段祺、王S、刘敏、马比拉尔、郑毅。 LPCAT1通过EGFR-介导的AKT/p38MAPK信号通路促进皮肤鳞癌 . 皮肤病学投资杂志。 2021; 142 :303-13
27 Park S、Shim JH、Lee B、Cho I、Park WY、Kim Y、Lee SH、Choi Y、Han J、Ahn JS。 等 . EGFR突变肺腺癌转化鳞状细胞癌的配对基因组分析 . 肺癌。 2019; 134 :7-15
28 王B、蒋H、王L、陈X、吴K、张S、马S、夏B。 MIR31HG lncRNA表达增加通过EGFR/PI3K/AKT信号通路增加非小细胞肺癌细胞株对吉非替尼的耐药性 . Oncol Lett公司。 2017; 13 :3494-500
29 周X，王X，朱H，顾G，詹Y，刘C，孙G。 PI3K抑制使EGFR野生型NSCLC细胞系对厄洛替尼化疗敏感 . 实验-治疗-医学。 2021; 21 :9-15
作者联系人 通讯作者：中国江西省九江市旬阳东路57号九江大学附属医院血液肿瘤科丁江华博士。 电子邮箱：6160063 教育网。
收到日期：2021-8-16 2022-1-8年验收 发布日期：2022-3-21
引文样式 亚太地区 复制 丁J.、丁X.、冷Z.（2022）。 LPCAT1通过上调肺腺癌中EGFR/PI3K/AKT信号通路促进吉非替尼耐药性。 癌症杂志 , 13(6), 1837-1847. https://doi.org/10.7150/jca.66126。
ACS公司 复制 丁，J。； 丁，X。； Leng，Z.LPACT1通过上调肺腺癌中EGFR/PI3K/AKT信号通路促进吉非替尼耐药性。 J.癌症 2022, 13 (6), 1837-1847. DOI:10.7150/jca.66126。
国家土地管理局 复制 丁J，丁X，冷Z.LPCAT1通过上调肺腺癌EGFR/PI3K/AKT信号通路促进吉非替尼耐药。 J癌症 2022; 13(6):1837-1847. doi:10.7150/jca.66126。 https://www.jcancer.org/v13p1837.htm
CSE公司 复制 丁J，丁X，冷Z.2022。 LPCAT1通过上调肺腺癌EGFR/PI3K/AKT信号通路促进吉非替尼耐药。 J癌症 . 13(6):1837-1847.
这是一篇根据知识共享署名许可条款发布的开放存取文章( https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ). 请参见 http://ivyspring.com/terms 完整条款和条件。
