本文在以下内容中提到：

介绍

色素异常的疤痕是不受欢迎的皮肤伤口愈合的后果，是全世界每个人都面临着风险。色素沉着异常使伤疤更加明显，伤疤可能严重而深刻心理暗示(1,2).

颜料的生产复杂且受控由于多种外在和内在因素，以及疤痕重新着色模式无法预测。因为目前还没有明确的可用的治疗方案，这对医生。因此，识别关键分子调节异常色素沉着的机制具有重要意义兴趣。

以前的研究表明血管紧张素II（AngII）可能参与伤口愈合的所有阶段(三)包括炎症细胞侵袭，细胞增殖、细胞迁移、新生血管和纤维化(4). 已观察到AngII增加血管通透性，招募炎症细胞(5,6)促进角质形成细胞增殖(4,7,8)以及皮肤伤口封闭(9).

炉笼等首先描述了AngII在人皮肤中的表达及可能的作用(10)以及角质形成细胞的调节，真皮肌成纤维细胞和内皮细胞增殖也有已报告(9,11). 炖牛肉等(10)据报道，人类皮肤表达AngII 1型（AT1）受体和2型（AT2）受体建议参与皮肤伤口愈合(三). 炖牛肉等(12)后来证明AT1和AT2受体的表达水平显著表皮和真皮内瘢痕增多。在添加，Otake等报告AT1的抑制受体通过减少肿瘤体积限制小鼠黑色素瘤生长和微血管密度，证明AT1的重要性黑色素瘤生长中的受体(13). 之前的一项研究也进行了调查mRNA的表达自动变速箱1，但不是自动变速箱2，培养中原代黑素细胞(10).

尽管AngII的几个功能性角色提示AngII是否通过在伤口愈合过程中调节黑素细胞系统仍有待进一步研究阐明。在本研究中，AngII在对人类黑素细胞进行了研究对黑素细胞进行了表征。

材料和方法

化合物和药物

兔多克隆抗AT1抗体（sc-1173），小鼠多克隆抗酪氨酸酶抗体（sc-20035）和辣根过氧化物酶相关山羊抗兔（sc-2004）或山羊抗鼠抗体（sc-2005）购自圣克鲁斯生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。蛋白质定量试剂盒和琼脂糖购自Bio-Read Laboratories，Inc。（Hercules，加利福尼亚州，美国）。聚合酶链反应（PCR）主混合物从Promega（美国威斯康星州麦迪逊）购买。商业来源其他产品如下：庆大霉素、磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）、M254培养基和人黑素细胞生长补充剂来自Cascade Biologics（英国曼斯菲尔德）；胎牛血清（FBS）和RNeasy迷你试剂盒来自Qiagen（美国加利福尼亚州巴伦西亚）；AngII，AT1受体拮抗剂，氯沙坦（LOS），乙炔溴、氯化钠、钾2人事军官4，氯化钙2,硫酸镁4，L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA），葡萄糖，牛血清白蛋白、EDTA、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS）Tris来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。

黑素细胞培养

从表皮分离出正常黑素细胞从泌尿外科获得的人类包皮（一般中国人民解放军北京军区医院）。现在该研究得到了综合医院伦理委员会的批准中国人民解放军北京军区。获得书面知情同意来自患者。皮肤移植被切成小块（5×5 mm），用胰蛋白酶-EDTA（2.5 g/l胰蛋白酶，0.2 g/l）孵育EDTA）在4°C下过夜。分离需要胰蛋白酶活性真皮的表皮。第二天，胰蛋白酶活性通过以1:1的比例添加FBS中和，并将其替换为PBS溶液。表皮和真皮用无菌镊子。进行彻底的移液以分离细胞，从而形成富含细胞的悬浮液。这个去除固体组织废物，并对悬浮液进行离心1000 x g，持续5分钟。黑素细胞在补充人类黑素细胞生长的规定M254培养基补充。细胞数量调整为2.5×104细胞/厘米2培养物保持在37°C加湿95%空气和5%CO2大气。培养基是每隔2-3天更换一次。对培养物进行常规检查污染和细胞生长。然后在在室内通过5分钟胰蛋白酶（2.5 g/l）处理汇合温度。细胞每周传代一次实验使用第二代和第二代之间的细胞进行四个。

单独或联合应用AngII治疗与AT1受体拮抗剂结合

将融合细胞接种在亚融合处密度（2×105细胞）在6孔板中生长持续4天，直到融合。随后对细胞进行处理不同浓度的AngII（0.01、0.1、1、10和100nM）在37°C下持续24小时。在某些实验中，细胞暴露在1000 nM LOS下自动变速箱1受体拮抗剂，in添加到AngII和/或之前暴露在LOS下30分钟对AngII刺激。取出培养基在添加新鲜的分析培养基之前，用PBS清洗两次补充0.1%FBS 24小时。培养后，黑色素进行含量测定，酪氨酸酶活性和细胞测量增殖。细胞匀浆和上清液使用RNeasy迷你试剂盒（生物试剂盒Technologies，Inc.）用于蛋白质定量，基于布拉德福德法(14).

酪氨酸酶活性测定

黑素细胞用AngII和/或LOS处理持续24小时，然后用1X冰镇PBS清洗。溶解缓冲器，含150μl 1%Triton X-100在0.1 M磷酸盐中将缓冲液添加到每个6孔板中。细胞被刮除转移到1.5毫升试管中，用三到五次溶解液氮中的冻融循环，5000×g离心在4°C下持续5-10分钟。样品（300–500μ克/80μl）被转移到一个新的96英尺的冰板上。左旋多巴（20μl；将5 mM）添加到每个孔中，培养板在37°C持续1 h，在475 nm处使用分光光度计（DU-70；Beckman Coulter，Brea，CA，USA）。

黑色素含量测定

如前所述，测定黑色素含量以前(15). 简单地说细胞用200μl 1M NaOH并反复吸管使样品均匀化。随后对细胞提取物进行转移到96-well板中，相对黑色素含量通过使用酶联免疫吸附测定（ELISA）平板阅读器（SynergyH1MF；BioTek，Winooski，VT，USA）。

四氮唑分析

一个3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）用黄色四唑试验检测细胞增殖(14). 遵循Ang II和/或LOS治疗，100μl份如上文所述，收集细胞并将其电镀平底96-well板（2.5×104细胞/厘米2). 细胞被允许附着和生长在37°C下过夜。根据制造商说明。formazan沉淀物是通过使用ELISA测量562 nm处的吸光度进行量化平板读取器。

RT-qPCR

总RNA提取和RT反应为执行，如前所述(16)和mRNA表达水平自动变速箱1用qPCR检测酪氨酸酶。总RNA在药物治疗24小时后使用TRIzol试剂盒提取（Invitrogen Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）和使用RT套件（ReverTra Ace®定量PCRRT试剂盒；丰田、大阪、日本）。半定量PCR使用引物(表一)用于AT1受体和酪氨酸酶（北京鼎国生物科技有限公司。，中国北京）。qPCR使用C100 ThermalCycler（Bio-Read Laboratories，Inc.）和着陆协议如前所述(17)，使用以下程序：94°C下1次循环2分钟，92°C下12次循环持续20秒，68°C持续30秒，70°C持续45秒（减少每循环1°C）和92°C下22次循环20秒，55°C下30秒70°C和45秒。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳及乙炔显示溴（0.5μg/ml）在室温下染色5分钟。使用Quantity One软件测定PCR带强度（v4.62；Bio-Read Laboratories，Inc.），并表示为与β-actin相对强度。

表一 反向使用的底漆转录定量聚合酶链反应。

表一

反向使用的底漆转录定量聚合酶链反应。

底漆	顺序(5′–3′)	大小（bp）
血管紧张素II型1
福沃德	ATTGCCAACCTATCT公司	270
反向	CCATCCCCTGGTCCTTA公司
酪氨酸酶
福沃德	ACGATGTGACGAGTGT公司	133
反向	CAGAGGCAGGTGAAGGT公司
β-肌动蛋白
福沃德	ATCATGTTTGAGACCTTCAACA公司	318
反向	CATCTCTTGCTCGAAGTCCA公司

蛋白质印迹

AT1和酪氨酸酶的蛋白表达水平用western印迹法检测。人类包皮被切开了小切片，用胰蛋白酶-EDTA（2.5 g/l胰蛋白酶，0.2 g/l EDTA）在4°C下过夜。胰蛋白酶活性需要用于把表皮和真皮分开。随后分离和培养月经母细胞，并用AngII处理单独或与AT1受体拮抗剂联合使用。这个然后在裂解缓冲液中收集Menlancells并离心在4°C、15000×g的温度下保持30分钟。收集上清液蛋白质浓度是用比新康宁测定的酸法（Bio-Read Laboratories，Inc.）。蛋白质（20μg） 用SDS样品缓冲液变性，煮沸5分钟并分离到10–12%的聚丙烯酰胺凝胶上（Novex，San Diego，加利福尼亚州、美国）。电泳后，蛋白质被转移1X转移缓冲液中含有25 mM Tris、192 mM甘氨酸和0.1%十二烷基硫酸钠和20%甲醇（pH 8.4），添加到0.45μ米Immobilon-P聚二氟乙烯膜（Millipore，Temecula，CA，美国）在微型Protean II转移细胞中（Bio-Read实验室，在120 mV的恒定电压下放置2小时被封闭在含Tris缓冲盐水（TBS）的5%脱脂干牛奶中在室温下至少保持1小时。随后出现了斑点用兔抗AT1抗体或小鼠在4°C下孵育过夜抗酪氨酸酶（1:1000稀释）。膜清洗了三次含1%Triton X-100（TBS-T）的TBS培养时间辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔或山羊抗鼠抗体（1:2000稀释）在室温下2小时用TBS-T洗涤四次。免疫反应带为通过将膜斑点暴露于增强型化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国），感兴趣的蛋白质在X射线胶片上可见（英国电信电影公司；Carestream Health，中国厦门）。三个独立的实验一式三份。

统计分析

使用SPSS 14.0进行统计分析（SPSS公司，美国伊利诺伊州芝加哥）。数据表示为平均值±平均值的标准误差。组间统计分析采用方差分析。考虑了P<0.05以显示统计上的显著差异。

结果

AngII对酪氨酸酶活性的调节，通过AT1受体的黑色素含量和细胞增殖

酪氨酸酶活性和黑色素含量增加在使用安哥拉II(图1A和C). 当时有酪氨酸酶和黑色素活性显著增加细胞孵育后含量增加24小时AngII（0.1–100 nM）和AngII的浓度h、 分别是。在100 nM时观察到最大增加AngII（P<0.01）。增加约17%（114±16.89；P<0.05）100nM处理后观察到酪氨酸酶活性AngII公司(图1A). 使用<0.01 nM AngII对酪氨酸酶活性没有影响使用控件(图1A). 在0.01–1 nM AngII，未观察到黑色素含量的差异与对照相比(图。1摄氏度). 酪氨酸酶活性和黑色素含量受到抑制与100 nM AngII单独孵育24小时或之后暴露于1μM LOS是一种选择性AT1受体拮抗剂，AngII治疗前30分钟(图1B和D). 有一个边缘，但细胞增殖无明显增加（P>0.05；图1E).

图1 （A） 酪氨酸酶活性用不同浓度的Ang II和（B）进行治疗单独或联合使用Ang II和LOS治疗。（C）不同浓度处理后的黑色素含量Ang II和LOS治疗后的Ang II或（D）单独或组合。（E） MTT法检测黑素细胞活性用不同浓度的AngII进行处理。数据表示为平均值的平均值±标准误差。*与对照组相比，P<0.05和**P<0.01；$P<0.05，而AngII为100 nM。血管紧张素；洛杉矶，洛沙坦。

AngII对mRNA表达的调节AT1的

以前的研究报告称AngII调节AngII受体亚型在非眼部的表达水平组织和人视网膜色素上皮组织(18,19).炖牛肉等检查培养的原代黑素细胞和检测了AT1的mRNA表达，但没有自动变速箱2(10). 本研究调查AngII是否调节自动变速箱1受体在培养的人黑素细胞中。确定有效范围AngII，用0.01–100 nM AngII处理细胞24小时，并且AngII对自动变速箱1被评估。在0.1–100 nM时，AngII增加了自动变速箱1.在100 nM AngII时观察到最大增加，增加了信使核糖核酸表达自动变速箱12.7倍（63.21±10.59%；P<0.01）。10 nM AngII治疗增加了自动变速箱11.67倍（38.94±6.54%；P<0.01），而0.1和1 nMAngII增加了自动变速箱11.44和1.53倍（33.47±3.91和35.54±6.821%）（P<0.05）。然而，0.01 nM AngII治疗对mRNA没有影响的表达式自动变速箱1与对照相比(图2). 阻止LOS的预处理mRNA表达的最大上调自动变速箱1通过100 nM安哥拉II(图2). 因此，AngII调节自动变速箱1在人体内黑素细胞和LOS抑制了这些作用。

图2 AngII上调mRNA表达AT1培养的人类黑素细胞和选择性AT1拮抗剂抑制这种作用。（A） 反向转录定量聚合酶链反应分析存在不同浓度AngII的AT1单独暴露24小时或暴露于LOS（1μM）30分钟AngII刺激。（B） AT1的mRNA表达为针对β-肌动蛋白进行标准化。数据表示为平均值±平均值和的标准误差由三个独立的实验*P<0.05和**P<0.01，与。控制$与100 nM AngII相比，P＜0.05。C、 控制；安，血管紧张素；洛沙坦LOS；AT1，Ang类型1。

mRNA和蛋白质的调节Ang II通过AT1受体表达酪氨酸酶

酪氨酸酶是黑色素的关键调节酶生物合成(20). 现在研究检测了AngII是否改变mRNA和蛋白表达人类黑素细胞中酪氨酸酶的水平。RT-qPCR分析酪氨酸酶在24小时后转录无变化用0.01 nM AngII孵育(图。三). 然而，转录的显著增加是在较高浓度的AngII（0.1–100 nM；图3).

图3 AngII上调mRNA表达培养的人黑素细胞中酪氨酸酶和选择性AT1拮抗剂抑制了这种效应。（A） 反向转录定量聚合酶链反应分析酪氨酸酶在不同浓度AngII单独暴露24小时或暴露于LOS（1μM）下30分钟AngII刺激前。（B） 酪氨酸酶的mRNA表达为针对β-肌动蛋白进行标准化。数据表示为平均值±平均值和的标准误差由三个独立的实验*P<0.05和**P<0.01，与。控制$与100 nM AngII相比，P<0.05。C、 控制；安，血管紧张素；洛沙坦LOS；酪氨酸，酪氨酸酶；AT1，Ang类型1。

用0.1和1 nM AngII孵育后分别增加38.562和46.259%（P<0.05）10nM AngII治疗后增加57%（P<0.01）(图3). 最大增加100nM治疗后观察到59.5%（P<0.01）安哥拉II(图3). 然而，LOS预处理消除了这种影响(图3B). 进行蛋白质印迹比较AngII对分泌酪氨酸酶比率的影响蛋白质。在与100 nM AngII孵育24小时后黑素细胞中酪氨酸酶显著增加(图4). 阻止LOS的预处理AngII诱导的酪氨酸酶和自动变速箱1(图。4)，表明自动变速箱1受体介导血管紧张素Ⅱ诱导人黑素细胞酪氨酸酶升高它与酪氨酸酶信号耦合。

图4 AngII对蛋白质的影响人类黑素细胞中酪氨酸酶和AT1的表达水平。（A）不同浓度酪氨酸和AT1的Western blot分析单独使用AngII 24小时或暴露于LOS（1μM）刺激AngII前30分钟。（B） 蛋白质酪氨酸酶和AT1的表达水平被量化针对β-肌动蛋白进行标准化。数据表示为平均值±平均值和的标准误差由三个独立的实验*P<0.05和**P<0.01，与。控制$与100 nM AngII相比，P<0.05。C、 控制；安，血管紧张素；LOS，氯沙坦；酪氨酸，酪氨酸酶；AT1，Ang类型1。

讨论

尽管对色素细胞进行了广泛的研究和伤口愈合，目前对疤痕色素沉着的理解皮肤损伤后仍然有限，其机制AngII与创伤后色素异常的相关性愈合情况尚待阐明。值得注意的是AngII及其在皮肤中的受体(10,11,21)暗示了其可能具有显著的病理作用AngII，正如先前调查受伤的研究所证明的那样皮肤愈合(11,22).

本研究旨在描述AngII受体在人黑素细胞和研究AngII对异常色素沉着的作用。AngII调节自动变速箱1人的受体黑素细胞，证实这些受体在单元格类型。此外，AngII改变了正常的人类黑素细胞生理学，导致酪氨酸酶的良好上调。之前的研究检查本地化自动变速箱1和在2受体使用免疫组织化学方法对整个人类皮肤进行研究，发现的表达式自动变速箱1黑素细胞中的受体，但不是在2受体(10). 这个目前的研究直接利用了分子生物学技术应用于分离的人类黑素细胞。使用这种方法证实了自动变速箱1受体在人类中表达黑素细胞作为mRNA和蛋白质，与Steckeling一致et（等）铝(10). 然而黑素细胞中这些受体的相对表达水平仍然存在有待阐明。基于以下事实自动变速箱1受体赋予AngII积极的生理作用，其调节对于确定AngII的作用至关重要。调查调节这些受体的表达可能有助于了解他们是如何参与生理或病理事件。在本研究中，黑素细胞表达出明显低水平的自动变速箱1受体亚型完全没有AngII或存在0.01 nM AngII。0.1 nM AngII处理增加了自动变速箱1受体。相比之下，AngII浓度较高（1–100 nM）增加了自动变速箱1受体呈剂量依赖性。这些影响是AngII受体介导的AngII受体拮抗剂LOS被消除AngII对自动变速箱1黑素细胞中的受体。这由支持证据表明自动变速箱1/自动变速箱2受体参与其他组织类型的病理事件(23–25).之前的一项研究确定自动变速箱1受体表达在人类皮肤中(10)、和本研究证实AngII调节自动变速箱1黑素细胞转录水平的受体。是否这些受体在这种细胞类型中也是有功能的调查。据报道自动变速箱1受体属于G蛋白偶联的七跨膜受体家庭(24,26). 本研究表明刺激自动变速箱1AngII受体被转导到增加酪氨酸酶水平的细胞内信号。这个结果证明自动变速箱1受体表达于人类黑素细胞功能活跃，可能有效然而，与酪氨酸酶转导途径耦合，上调自动变速箱1受体转导途径尚待调查。黑素细胞在色素沉着异常的发病机制异常色素沉着的机制尚待阐明，证据表明酪氨酸酶可能参与(19,27).以前的研究表明，物理刺激调节酪氨酸酶的活性(28).本研究调查了AngII是否影响调节酪氨酸酶的表达，并观察到mRNA和蛋白质的增加酪氨酸酶的表达水平。此外自动变速箱1拮抗剂LOS消除了AngII对酪氨酸酶的影响活性和黑色素含量，表明AngII诱导酪氨酸酶活性通过自动变速箱1受体。黑素细胞用AngII治疗只有24小时，因此长时间接触可能不能排除诱导酪氨酸酶增加的可能性。

酪氨酸酶蛋白水平升高暴露于100 nM AngII后，通过自动变速箱1受体，表明了自动变速箱1受体开启人类黑素细胞中酪氨酸酶上调。这表明AngII诱导的某些效应可能特定于细胞靶向。本研究证明AngII受体抑制剂可能会阻止这些变化。

值得注意的是，本研究的结果表明AngII在酪氨酸酶调节中的潜在作用自动变速箱1受体，并支持AngII、，酪氨酸酶和自动变速箱1受体激活，可能是通过上调酪氨酸酶参与异常色素沉着黑色素细胞。

功能的识别自动变速箱1人类黑素细胞中的受体为黑素细胞生理学。这些受体的性质附加功能活动及其调控机制需要进一步调查以评估AngII在皮肤病理生理学。

致谢

作者想感谢北京军区总医院皮肤科解放军（中国北京）感谢他们在这份手稿。作者还要感谢教授敖俊宏感谢他们的技术援助和温岭教授感谢王老师批判性地阅读手稿。这项研究是由首都医疗基金会资助发展与研究（编号：2007-3027）和第二个五年军事医学科学技术研究基金计划（编号CWS11J218）。

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