巨噬细胞向肌成纤维细胞的转化导致新生血管性年龄相关性黄斑变性继发的视网膜下纤维化

摘要

背景

在新生血管年龄相关性黄斑变性（nAMD）中，即使使用抗血管内皮生长因子（VEGF）治疗，黄斑纤维化也会导致无法修复的视力丧失。炎症在黄斑纤维化中起着重要作用，尽管其潜在机制尚不明确。本研究的目的是了解浸润性巨噬细胞和补体蛋白如何导致黄斑纤维化。

方法

使用我们小组开发的两阶段激光方案在C57BL/6J小鼠中诱导视网膜下纤维化。在第二次激光照射后10、20、30和40天收集眼睛，并对浸润的巨噬细胞（F4/80和Iba-1）、补体成分（C3a和C3aR）和纤维血管病变（胶原蛋白-1、Isolectin B4和α-SMA）进行免疫组织化学处理。研究中还使用了患有黄斑纤维化的人视网膜切片。用重组C3a、C5a或TGF-β处理C57BL/6J小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）48和96小时。用qPCR、Western blot和免疫组织化学方法检测肌成纤维细胞标志物的表达。使用C3aR拮抗剂（C3aRA）和C3a阻断抗体在体内外进一步研究了C3a-C3aR通路在巨噬细胞向肌成纤维细胞转化（MMT）和视网膜下纤维化中的作用。

结果

F4/80的约20~30%⁺（或Iba-1⁺)在人类nAMD眼睛和小鼠模型的视网膜下纤维化病变中，浸润巨噬细胞共同表达α-SMA。TGF-β和C3a，而不是C5a治疗，显著上调BMDM中α-SMA、纤连蛋白和胶原-1的表达。C3aRA治疗可阻止C3a诱导的BMDM中α-SMA、纤维连接蛋白和胶原蛋白-1的上调。在诱导视网膜下纤维化的两阶段激光模型中，用C3a阻断抗体而非C3aRA治疗可显著减少血管渗漏和异凝素B4⁺损伤。治疗并未显著改变胶原蛋白-1⁺纤维化病变。

结论

MMT在nAMD继发性黄斑纤维化中起作用。TGF-β和C3a可以诱导MMT，但C5a不能诱导MMT。需要进一步研究以充分了解MMT在黄斑纤维化中的作用。

图形摘要

巨噬细胞向肌成纤维细胞转化（MMT）有助于视网膜下纤维化。视网膜下纤维化病变包含多种细胞类型，包括巨噬细胞和肌成纤维细胞，属于纤维血管性病变。肌成纤维细胞是驱动致病性纤维化的关键细胞，它们通过产生过量的细胞外基质蛋白来实现。我们发现浸润的巨噬细胞可以转分化为肌成纤维细胞，这一现象在黄斑纤维化中被称为巨噬细胞向肌成纤维纤维细胞转化（MMT）。除TGF-β1外，CNV补体激活期间产生的C3a也可诱导MMT导致黄斑纤维化。RPE=视网膜色素上皮。BM=布鲁赫膜。MMT=巨噬细胞向肌成纤维细胞转化。TGFB=转化生长因子β。a-SMA=α平滑肌肌动蛋白。C3a=补体C3a。

背景

老年性黄斑变性（AMD）是一种导致老年人中心视力丧失的疾病。据估计，到2040年，全球将有2.88亿人被诊断患有AMD[1]. 大约10%的AMD患者患有新生血管型疾病（nAMD），其特征是黄斑部异常血管生长，使患者面临严重视力丧失的风险[2]. 如果nAMD仍未得到治疗，最终患者将失明并发展为黄斑纤维化[三,4]. 抗血管内皮生长因子（anti-VEGF）疗法的引入彻底改变了nAMD疗法[5,6]. 然而，即使使用抗血管内皮生长因子治疗，仍有大约三分之一的患者出现黄斑纤维化[7]. 黄斑纤维化仍然是nAMD管理中的一个主要临床挑战。随着人口老龄化和AMD患者的预计增加，这一挑战将成为一个日益严重的问题。

黄斑纤维化病变包含血管，因此被称为纤维血管病变[8,9,10]. 疾病血管向纤维血管瘢痕过渡的具体线索尚不清楚。除了血管外，黄斑病变还含有浸润的免疫细胞、肌成纤维细胞和过多的细胞外基质（ECM）蛋白，如胶原蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白[11,12,13]. 肌成纤维细胞是成纤维细胞的活性形式，在黄斑中不存在。据推测，黄斑纤维化中的肌成纤维细胞起源于常驻视网膜细胞（如视网膜色素上皮细胞）或浸润性炎性细胞的分化[8,14]尽管缺乏直接证据。

先前的研究表明，61%的人类脉络膜新生血管（CNV）病变含有巨噬细胞[15]. 巨噬细胞占实验性CNV所有细胞的20%，约70%的浸润性巨噬细胞来源于骨髓[16]. 巨噬细胞被认为在黄斑纤维化发展中起重要作用，但其潜在机制尚待确定。最近的研究表明，巨噬细胞在TGF-β刺激后可以转分化为肌纤维母细胞样细胞（巨噬细胞向肌成纤维细胞转化；MMT），这一过程有助于肾纤维化[17,18,19].

补体系统失调已被确定为AMD的关键炎症途径[20,21,22,23]. 我们的研究组表明，nAMD黄斑纤维化患者补体成分水平增加，包括3a、4a和5a[24]. 在实验性激光诱导CNV减少新生血管损伤过程中中和C3a和C5a[25]. 据报道，C3a可以通过C3a受体C3aR1诱导近曲小管上皮细胞（PTEC）的上皮-间充质转化（EMT）分化[26]. 在本研究中，我们研究了MMT在黄斑纤维化中的作用。我们进一步研究了C3a和C5a对骨髓源性巨噬细胞MMT和视网膜下纤维化小鼠模型MMT的影响。

方法

动物

本研究使用2至3个月龄的C57BL/6J小鼠（雄性和雌性）。所有动物均在贝尔法斯特女王大学生物服务部饲养和繁殖，并暴露于12小时的光/暗循环中，可自由获取食物和水。所有程序均根据1986年《英国内政部动物科学研究法案》的规定以及ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明进行。

视网膜下纤维化的两阶段激光模型

如前所述，进行了两级激光模型[9]. 简单地说，激光CNV被诱导。激光器的设置如下：激光功率-250mv，持续时间-0.1s，光斑尺寸-100μm。每只眼睛有三个激光点。七天后，使用相同的激光配置对每个CNV病变进行第二次激光烧伤。

C3a在视网膜下纤维化体内模型中的抑制作用

如上所述，使用两阶段激光模型诱导视网膜下纤维化。第二次激光损伤后（第0天），小鼠立即接受玻璃体内注射C3a阻断剂，方法如上所述[27,28]. 20天后（第20天）进行第二次注射。

研究组如下：（1）抗小鼠C3a（大鼠IgG2a，克隆3/11；HyCult生物技术，荷兰乌登，2μg/μl/眼）[25]; （2） 大鼠IgG对照（低内毒素Bio-Rad，美国，2μg/μl/眼）；（3） C3aR拮抗剂（C3aRA）（SB290157-三氟乙酸盐，Cayman Chemical，美国，分类号：15783，1μg/μl/眼）；（4） 1%二甲基亚砜（DMSO）对照品（1μl/眼）；无治疗对照组。使用的剂量如前所述[25].

在第20天使用Micron IV系统和Discover 2.2计划（美国凤凰科技集团）收集眼底图像。使用相同的系统采集眼底荧光血管造影（FFA）图像。腹腔内注射100μl 10%荧光素钠（英国吉林厄姆Sigma-Aldrich，目录号：F6377）后5分钟进行FFA。动物之间的接触水平也保持一致。ImageJ被用来测量每个病灶的渗漏，以一种隐蔽的方式。比较传统激光CNV组和两级激光组每个病灶的平均灰度值。一位盲目的独立研究人员证实了这一发现。

在第二次激光后30天收集眼睛，并用2%多聚甲醛（PFA）固定（Sigma-Aldrich，分类号：158127）。使用胶原蛋白-1的面积测量来测量纤维化病变的大小⁺和异凝集素B4⁺视网膜色素上皮（RPE）扁平支架上的病变大小。

人体样本

从圣地亚哥眼库获得了带有nAMD的人眼样本。本研究在赫尔辛基宣言的参数范围内进行，患者组织按照《人体组织法》（2004年）进行储存。贝尔法斯特女王大学伦理审查委员会批准了这项研究。眼睛被保存在福尔马林中。到达后，对眼睛进行了解剖，并用石蜡包埋。组织切片在4°C的温度下保存在指定用于人类组织样本的冰箱中，直到需要染色为止。本文中的结果代表了单个人体样本。使用Sigma-Aldrich H3136血红素和BDH/VWR 95057-848曙红进行血红素与曙红（H+E）染色。根据制造商的说明，使用Abcam三色染色试剂盒对冰冻切片和蜡切片进行Masson三色染色（Abcam，Cambridge，UK，分类号：ab150686）。

免疫组织化学

通过在抗原回收缓冲液（0.05%柠檬酸，pH 7.4）（Sigma-Aldrich，目录号：C82604）中煮沸载玻片30分钟来进行抗原回收，或使用酶促抗原回收方法用于大鼠抗小鼠F4/80，使用20μg/ml蛋白酶K（英国拉夫堡赛默飞世尔科技公司，分类号：17916）在Tris-Edta（TE）缓冲液中放置2分钟。

抗原提取后，在室温下使用5%BSA（Sigma-Aldrich，分类号：A3803-10G）封闭视网膜切片1小时。样品在一级抗体中培养（表1)在4°C下过夜，然后用二级抗体孵育（表1)在室温下黑暗中放置1小时。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Vector Laboratories，USA，目录号：h-1200）将切片安装在Vectashield中。如前所述，使用我们的方案对RPE平板支架进行染色[29]. 如前所述，在RPE平板支架中测量病变大小[9]. 这一测量结果得到了一位独立的、盲目的研究人员的证实。

表1组织染色抗体条件

骨髓源性巨噬细胞（BMDM）的培养

使用我们小组先前描述的方案，从健康的8–12周供体C57BL/6J小鼠中分离出骨髓[30]. 简单地说，从股骨和胫骨冲洗骨髓。去除红细胞后，将细胞培养在补充有1%青霉素-链霉素（分类号：15140122）、15%胎牛血清（FCS；分类号：10270106）（均来自Thermo Fisher Scientific）和20%L929上清液的DMEM（分类号41965039）中。七天后，使用以下抗体通过流式细胞仪（FACS BD CANTO II，BD Biosciences，San Jose，USA）检查BMDM的表型：F4/80结合eFluor 450（Thermo Fisher Scientific，分类号：48-4801-80）和CD11b结合PE-Cy7（BD Biosciences），分类号为552850）。

C3a的体外治疗和抑制

用10 ng/ml重组小鼠C3a（分类号：8085-C3）或C5a（分类编号：2150-C5-025/CF）处理在10%FCS中培养的BMDM 48–96小时。使用每毫升10纳克TGF-β1（分类号为7666-MB-005）（均来自英国阿宾登研发系统公司）作为阳性对照。根据制造商的说明，将C3aR拮抗剂（C3aRA）SB 290157（三氟乙酸盐）（美国密歇根州Cayman Chemical，目录号：15783）溶解在二甲基亚砜中。将最终浓度10μM添加到培养的BMDM中。DMSO的相应百分比为0.005%。在收集细胞进行qPCR或Western blotting之前，将细胞在6孔板中放置指定的时间，进行或不进行处理，或在24孔板中进行免疫细胞化学。

实时PCR

使用RNeasy plus迷你试剂盒从细胞中提取总RNA（荷兰齐亚根，分类号：74134）。cDNA是使用SuperScript™II逆转录酶试剂盒（Thermo Fisher Scientific，分类号：18064014）合成的。定量PCR（qPCR）是根据制造商的说明使用Lightcycler®480探针主混合物进行的（瑞士巴塞尔罗氏公司，目录号：04707494001）。引物序列如表所示2使用TaqMan探针（Roche，目录号：317139）分析TGF-β基因表达。

表2 qPCR基因序列

免疫组织化学染色

在室温下，BMDM在2%PFA中固定20分钟。洗涤后，将细胞在室温下封闭在用0.02%Triton-x稀释的PBS中的1%BSA（Sigma-Aldrich，Cat no:A3803-10G）中1小时，然后在室温下与第一抗体孵育1小时（表1). 二级抗体（表1)彻底清洗后，在室温下使用1h。进一步彻底清洗后，涂抹DAPI（Sigma-Aldrich，产品目录号：D9542）。抗体状况如表所示1使用兔抗鼠抗体（Abcam，分类号：ab2413）以及Alexa Fluor®488 AffiniPure Donkey anti-rabbit IgG（H+L）（英国剑桥Jackson ImmunoResearch，分类号712-545-150）对BMDM中的纤维结合蛋白进行染色。用二级抗体单独孵育作为阴性对照。

使用DAPI对总细胞进行计数⁺细胞和肌成纤维细胞被定义为α-SMA⁺成纤维细胞形状的细胞（存在拉长的应力纤维）。每个治疗组在每个独立实验中进行三次试验。每个孔随机拍摄三张图像。这一数据得到了一位独立、盲目的研究人员的证实。

蛋白质印迹

在补充有1%蛋白酶抑制剂混合物（PIC；Sigma-Aldrich，分类号：P8340）的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中重新悬浮BMDM。使用Pierce BCA分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，产品目录号：23225）测定蛋白质浓度。以1:7000（Abcam，Cat-No:ab6721）稀释度的山羊抗兔IgG H&L（HRP）作为二级抗体，研究α-SMA（宿主：兔子，稀释度：1:1000，Abcam；Cat-No:ab5694）的蛋白表达。家政蛋白Rab11（稀释度：1:250 Abcam，分类号：ab151279）用作负荷控制（二级抗体包被抗兔IgG，如上所述）。

数据分析

Graph Pad Prism（V6，GraphPad Software，San Diego，USA）用于创建图形和进行统计分析。测试数据的正态性，并测试方差以确保相似性。这是通过Shapiro-Wilks测试和Bartlett测试进行的。通过一名独立学生的t吨测试。在适当的情况下使用单向或双向方差分析。Bonferroni校正用于多重比较测试。

结果

• 1 80层/四层⁺巨噬细胞在视网膜下纤维化病变中表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）

在视网膜下纤维化的两阶段激光模型中，F4/80浸润⁺在整个疾病过程中，在病变部位检测到巨噬细胞（图。1). 如RPE/脉络膜/巩膜扁平支架所示，病变表面存在浸润细胞（图。1a个)以及病变内部（图。1b–e类). 有趣的是，我们发现大约30%的F4/80⁺细胞共同表达α-SMA（图。第1页和图中的高倍图像。1克). 使用ImageJ中的像素强度空间相关分析（Pearson系数=0.74，n个=3，附加文件1图S1A）。在病变区域周围，一些色素细胞（可能是RPE细胞）也是α-SMA⁺（附加文件2：图S2）。我们的结果提示视网膜下纤维化中肌成纤维细胞的异质性起源，可能包括MMT和EMT。

• 2 80层/四层⁺α-SMA⁺在人类黄斑纤维化病变中检测到细胞

图1

α-SMA⁺视网膜下纤维化病变中的巨噬细胞。一第二只激光治疗眼30天后，RPE/脉络膜扁平支架进行胶原蛋白-1和F4/80染色，共焦显微镜成像。b条–e（电子）从第10天开始，蜡嵌的老鼠眼睛(b条), 20 (c), 30 (d日)和40(e（电子）)对两阶段激光纤维化模型的F4/80细胞和DAPI进行染色，并通过共焦显微镜进行成像。（f）两阶段激光模型后30天的蜡包埋切片进行F4/80（绿色）和α-SMA（红色）染色，并通过共焦显微镜成像。箭头指示F4/80⁺α-SMA⁺细胞。比例尺=100μm。克在中黄色框中显示的区域中缩放（f）.小时阴性对照染色。类Ch-choroid；INL—内核层；ONL—外核层；雷雷蒂纳

为了了解MMT现象是否也存在于人类黄斑纤维化中，我们对nAMD眼睛进行了Iba-1和α-SMA双重染色。H+E和三色染色用于识别视网膜下病变（SRL；图。2a、 b）。三色染色显示一个含有大量胶原纤维（蓝色）、血管和浸润细胞的完整病变（图。2b） 。浸润性Iba-1⁺在视网膜和SRL之间的连接处检测到细胞（高倍图像的蓝色方框1，图。2c） 以及病变内部（高倍图像的蓝色方框2，图。2c） ●●●●。免疫荧光发现多个α-SMA⁺SRL中的电池（图。2图中方框区域的放大倍数为d。2e） ●●●●。α-SMA（红色）和Iba-1的双重染色⁺（绿色）识别出几个双阳性细胞（图。2g、 图中放大倍数较高的方框区域。2h、 图中的阴性对照染色。2f） ，约占渗透Iba-1的20%⁺病变处的细胞。这些数据表明MMT存在于nAMD继发的黄斑纤维化中。

• 三。 C3a而非C5a诱导骨髓源性巨噬细胞MMT

图2

α-SMA⁺和Iba-1⁺人类黄斑纤维化中的细胞。一血红素和曙红染色显示nAMD患者的视网膜下病变。b条Masson三色染色显示视网膜下纤维病变。白色箭头表示胶原蛋白（蓝色）丰富的病变。c对nAMD患者的视网膜切片进行Iba-1（棕色）染色，并通过光学显微镜成像。蓝色方框-1显示Iba-1⁺视网膜下病变边缘的细胞。方框2显示Iba-1⁺纤维病变内的细胞。d日人类视网膜下病变组织α-SMA染色（红色）。e（电子）中白色方框所描绘区域的高倍图像(d日)显示α-SMA⁺视网膜下病变中的细胞。比例尺=100 um（a-d）（f）人视网膜下纤维化病变中Iba-1和α-SMA的阴性对照染色。克人类视网膜下纤维化病变的共焦图像染色为α-SMA（红色）和Iba-1（绿色）。小时框的放大面积克显示α-SMA⁺伊巴-1⁺“MMT”单元。GCL神经节细胞层；INL—内核层；ONL—外核层；SRL视网膜下病变

以前，我们发现较高的血浆C3a和C5a水平与nAMD患者的黄斑纤维化有关[24]已知C3a能够诱导EMT[26]。然后我们有兴趣了解C3a或C5a是否有助于MMT。流式细胞术证实BMDM对CD11b和F4/80呈双重阳性（数据未显示）。用C3a或C5a处理BMDM 48–96小时。使用TGF-β1（10 ng/ml）作为阳性对照。相比较显微镜研究发现TGF-β1-和C3a-处理组中有几个伸长的细胞（附加文件三：图S3A，箭头），但不在C5a治疗组（数据未显示）。qPCR显示TGF-β和C3a-处理的细胞中α-SMA mRNA显著上调，但C5a-处理细胞中没有上调（附加图3B公司). 通过计数α-SMA进一步证实了这一点⁺确定分化成肌成纤维细胞的细胞百分比（附加文件三：图S3C、D）。因此，在接下来的研究中，我们重点关注C3a诱导的MMT在视网膜纤维化中的作用。

图3

补体C3a对BMDM的影响。用10 ng/ml重组TGF-β1或C3a处理BMDM，并研究各种肌成纤维细胞标记物的表达。一显示CD11b的共焦图像⁺α-SMA⁺C3a处理48小时后BMDM培养物中的细胞（箭头）。比例尺=25 umb条TGF-β或C3a治疗96小时后肌成纤维细胞基因表达的qPCR分析。数据表示为平均值±SEM，n个=3个样品，代表2个独立实验。统计分析=学生的t吨测试-*第页<0.05治疗组与对照组**第页治疗组与对照组之间的差异<0.01。cα-SMA的百分比⁺TGF-β或C3a处理后的BMDM培养细胞。数据表示为平均值±SEM。n个=3，所示数据代表2个独立实验**第页与同一时间点未经治疗的对照组相比，<0.01t吨测试。d日经重组TGF-β1或重组C3a处理96 h的BMDM培养物的典型共聚焦图像，染色用于α-SMA和F4/80（上面板）或胶原蛋白-1和α-SMA（中面板）或纤维连接蛋白和α-SAM（下面板）。比例尺=50μm。e（电子）TGF-β1或C3a治疗48或96小时后α-SMA的Western blot分析。为了清晰起见，图像已被裁剪。数据显示为α-SMA表达与看家蛋白（rab11）相比的折叠变化，平均值±SEM，n个=来自2个独立实验的5–6个样本**第页< 0.01, ***第页与未经处理的对照细胞相比<0.005，学生的t吨测试

为了进一步证实C3a在BMDM培养物中诱导的MMT，我们对C3a处理48小时的BMDM进行了CD11b和α-SMA双重染色⁺α-SMA⁺通过共焦显微镜鉴定细胞（图。三a） ，并使用ImageJ中的像素强度空间相关分析确认了共同定位（皮尔逊系数=0.61，n个=6，附加文件1：图S1B）。

除α-SMA外，我们还检测了C3a-或TGF-β1处理细胞中纤维连接蛋白和胶原蛋白-1的表达。qPCR显示TGF-β1-或C3a处理的细胞中纤维连接蛋白和胶原蛋白-1（以及α-SMA）显著上调，尽管TGF-。三b） 。免疫组织化学显示F4/80的7-15%和5-10%⁺BMDM分化为α-SMA⁺分别在TGF-β1和C3a治疗后96 h，肌成纤维细胞（图。三c、 d）。所有α-SMA⁺细胞纤维连接蛋白和胶原蛋白-1阳性，尽管胶原蛋白-1⁺α-SMA^-偶尔观察到细胞（箭头，图。三d） ●●●●。Western Blot进一步证实了96小时TGF-β1-和C3a介导的α-SMA上调（图。三e） ●●●●。与TGF-β1治疗后相比，C3a治疗96 h后α-SMA显著增加（图。三e） ●●●●。附加文件中显示了α-SMA和Rab11的代表性原始印迹图像5：图S5和附加文件6：分别见图S6）。

总之，这些数据表明TGF-β和补体C3a可以诱导MMT。

• 4 C3a诱导的MMT通过C3a-C3aR信号通路介导

已知巨噬细胞表达C3aR[31]. 为了了解C3a诱导的MMT是否通过C3aR信号通路介导，我们在研究中使用了C3aR特异性拮抗剂（C3aRA）（图。4a） ●●●●。

图4

C3aRA对C3a诱导MMT的影响。一示意图显示，用补体C3a处理96小时的巨噬细胞分化为a-SMA⁺肌成纤维细胞。在本研究中，我们研究了添加重组C3a和C3aR拮抗剂（C3aRA）的效果。b条–d日在用C3a（10 ng/ml）加C3aRA（10uM）或载体（DMSO）治疗48和96小时后，从BMDM中提取总RNA。对照组由未经治疗的BMDM组成。α-SMA的表达(b条)，胶原蛋白-1(c)和纤维凝集素(d日)用qPCR检测mRNA。平均值±SEM*第页< 0.05, **第页< 0.01. 双向方差分析，Bonferroni修正。e（电子）α-SMA的百分比⁺C3a、C3a+DMSO和C3a+C3aRa处理96小时后BMDM培养的细胞。n个＝3，代表两个独立的实验。平均值±SEM。带Bonferroni校正的单向方差分析，星号显示在组上方，显著性与对照组（未治疗的BMDM）进行比较。如果星号显示在两个条件之间，则表示两组之间的重要性*第页< 0.05, **第页< 0.01. α-SMA的代表性图像⁺左侧面板中显示了不同组中的单元格（红色）。

与之前的观察结果类似，在96小时时观察到C3a诱导α-SMA、胶原蛋白-1和纤维连接蛋白的上调（图。4b–d）。C3aRA治疗抑制C3a介导的α-SMA上调（图。4b） ，胶原蛋白-1（图。4c） 和纤维连接蛋白（图。4d） ●●●●。免疫细胞化学进一步证实，C3aRA降低了C3a处理的BMDM中a-SMA的表达（图。4e） ●●●●。

• 5 视网膜下纤维化病变中TGF-β、补体C3、C3a和C3aR上调

为了了解MMT参与视网膜下纤维化的分子途径，我们检测了两阶段激光模型视网膜下病变中TGF-β、C3a和C3aR的表达[9]。第二次激光治疗后3天和25天，视网膜中TGF-βmRNA显著增加（附加文件4：图S4A）。此外，第二次激光治疗25天后，RPE/脉络膜/巩膜层TGF-βmRNA显著上调（附加文件4图S4B）。共焦显微镜在正常小鼠视网膜中检测到TGF-β，包括RPE细胞（附加文件4图S4C）。在第二次激光治疗30天后，视网膜和视网膜下病变处的TGF-β染色增强（附加图4D（四维），白色箭头）。

与匹配的非激光对照小鼠的组织相比，第二次激光治疗3天后，我们观察到RPE/脉络膜/巩膜中C3基因的表达显著增加（图。5a） 。第二次激光治疗30天后，视网膜中出现补体C3a（图。5b、 箭头）和视网膜下病变（图。5b、 黄色箭头）。病变中也检测到C3aR（图。5c） 和一些C3aR⁺细胞为F4/80⁺巨噬细胞（图。5c） ●●●●。阴性对照染色如图所示。5d.我们的结果表明TGF-β、C3a和C3aR存在于视网膜下纤维化模型的病变中。

• 6 C3a阻断剂对视网膜下纤维化的影响

图5

补体C3/C3a在视网膜下纤维化中的表达。一在第二次激光照射后3天和25天，用qPCR检测视网膜和RPE/脉络膜/巩膜中C3 mRNA的表达。平均值±SEM。n个=每组4-6只眼睛*第页与未经治疗的对照组相比，<0.05。单向方差分析，Bonferroni修正。b条,c在两阶段激光模型后30天，对小鼠眼睛的冷冻切片进行C3a染色(b条)、C3aR（红色）和F4/80（绿色）(c)并通过共焦显微镜成像。b条视网膜（箭头）和视网膜下病变（星号）中的C3a染色。c80层/四层⁺C3aR公司⁺视网膜下病变内的巨噬细胞（黄色细胞，箭头所示）。ONL=核外层，SRL=视网膜下病变。比例尺=100μm。

为了进一步了解C3a/C3aR通路在视网膜下纤维化中的作用，我们在我们的两阶段激光视网膜下纤维化小鼠模型中使用C3a单克隆抗体和C3aR拮抗剂（C3aRA）[9]. 临床检查表明，C3a单克隆抗体治疗20天后，视网膜下纤维血管病变的荧光泄漏显著减少（图。6a–c）。与载体（DMSO）组相比，C3aRA治疗并未显著减少荧光泄漏（图。6a–c）。

图6

C3a阻断剂对视网膜下纤维化小鼠模型的影响。代表性眼底(一)和FFA(b条)来自未经治疗（对照）或用大鼠IgG、抗C3a单克隆抗体或C3aRA或载体（DMSO）治疗的小鼠的两阶段激光视网膜下纤维化模型后20天的图像。c以平均灰度值表示的20天p.l.时荧光素泄漏的定量测量。平均值±SEM，n个=每组6只眼，每组11–18个病灶。单向方差分析，Bonferroni修正*第页<0.05，与未经治疗的对照组相比。d日–克用C3a阻滞剂处理30天两级激光模型的RPE/彩色平板支架，对其进行isolectin B4染色(d日)或胶原蛋白-1(（f）)并通过共焦显微镜成像。比例尺=100μm。e（电子）isolectin B4的定量测定⁺不同组的病变面积。克胶原蛋白-1的定量测定⁺不同组的病变面积。平均值±SEM胶原蛋白-1：n个=每组10-20个病灶，3-5只眼睛。异凝集素B4：n个=每组16–22个病灶，5–7只眼*第页< 0.05. **第页< 0.01. ns=无显著性。单向方差分析，Bonferroni校正

在异凝集素B4（图。6d、 e）和胶原蛋白-1（图。6f、 g）染色。异凝集素B4显著减少⁺IgG组和C3a单克隆抗体组之间的面积为（0.40±0.14 mm²vs 0.06±0.04毫米²)（图。6e） ●●●●。载体（DMSO）组和C3aRA组之间没有显著差异（0.35±0.07 mm²vs 0.29±0.08毫米²)（图。6e） ●●●●。该数据表明，用单克隆抗体阻断C3a可显著降低激光治疗后30天视网膜下病变的血管成分。

玻璃体内注射IgG显著增加胶原蛋白-1⁺与非治疗对照组相比（图。6f、 g）。与IgG组相比，抗C3a单克隆抗体治疗对胶原蛋白-1的减少无显著作用⁺区域（图。6g） （IgG 0.78±0.17毫米²与C3a单克隆抗体相比0.48±0.14毫米²). 载体（DMSO）和C3aRA治疗眼的胶原蛋白-1损伤大小没有差异（0.37±0.09 mm²vs 0.31±0.05毫米²)（图。6f、 g）。

讨论

即使在抗血管内皮生长因子治疗后，nAMD的新生血管也经常发展为纤维血管病变（黄斑纤维化）[32]. 炎症，尤其是固有免疫反应，包括巨噬细胞浸润和补体激活，在nAMD的发展和进展中起着关键作用[21,23,33]. 在本研究中，我们表明浸润性巨噬细胞可能通过转分化成肌成纤维细胞（即MMT）参与纤维血管病变的发展，TGF-β和补体C3a可能参与这一过程。

血管病变部位持续的低度炎症被认为是黄斑纤维化的关键驱动因素[8]. 炎症反应不仅会损伤黄斑细胞（如RPE和感光细胞），而且会导致各种可溶性介质的释放，包括促炎和促纤维化因子。这些介质可以在细胞环境中启动级联反应，导致ECM的积累，在病变血管的沉积中富含纤维胶原和纤维粘连蛋白。已知巨噬细胞积极参与组织纤维化[34]. 在疾病开始阶段，典型活化的巨噬细胞促进炎症和组织损伤，而在疾病解决阶段，活化的巨噬细胞则抑制炎症，促进组织修复和伤口愈合[35]. 巨噬细胞功能失调，无论是在疾病开始阶段还是在消退阶段，都可能导致持续的炎症、致病性伤口愈合和纤维化。巨噬细胞也可能通过向肌成纤维细胞的转化促进纤维化。这种现象以前曾在肾纤维化中观察到[17,18,19]. MMT的一个关键标记是巨噬细胞标记物F4/80和肌成纤维细胞标记物α-SMA的共同表达。我们发现大约20%的Iba-1⁺巨噬细胞在人类nAMD眼睛和30%（F4/80）中共同表达α-SMA⁺巨噬细胞）。我们的结果表明，浸润性巨噬细胞可能通过自身转化为肌成纤维细胞参与黄斑纤维化。

在黄斑纤维化中，除巨噬细胞外，其他细胞也可能引起肌成纤维细胞。RPE细胞以前曾被证明经历过EMT[36]，我们观察到α-SMA⁺视网膜下纤维化小鼠模型中的RPE样细胞（附加文件2图S2），表明RPE可能通过EMT导致黄斑纤维化。肌成纤维细胞也可能通过内皮细胞向间充质细胞的转化（EndoMT）来源于内皮细胞[8]. 其他感兴趣的细胞包括胶质细胞、循环纤维细胞和脉络膜基质细胞[8]. 需要进一步研究以充分了解α-SMA的起源⁺黄斑纤维化中的肌成纤维细胞及其募集和激活的分子途径。

TGF-β是一种公认的纤维化前介质，可以诱导包括上皮细胞在内的多种细胞发生间充质转化[37]、内皮细胞[38]和巨噬细胞[19]. 已知RPE细胞组成性表达TGF-β，以维持视网膜下间隙的免疫抑制微环境[39]. 最近，利用单细胞RNA测序分析，我们报道TGF-β1和TGF-？mRNA分别主要由视网膜小胶质细胞和Müller细胞表达[40]. 在当前研究中，我们发现在我们的视网膜下纤维化模型中，第二次激光治疗后3天和25天，视网膜和RPE中TGF-β1的表达增加。TGF-β可能是MMT在视网膜纤维化中的关键驱动因素。

本研究的另一个有趣的观察结果是补体C3a而非C5a诱导MMT。大约5-10%的C3a处理的巨噬细胞表达α-SMA、纤维连接蛋白和胶原蛋白-1，这种C3a介导的MMT可以被C3aR拮抗剂C3aRA阻止。据报道C3a可诱导PTEC间充质转化[26]. 我们小组以前的一项研究报告，患有黄斑纤维化的nAMD患者的血浆中C3a、C4a和C5a水平较高[24]. 这些数据表明C3a可能通过MMT的诱导参与nAMD的黄斑纤维化。然而，在视网膜下纤维化小鼠模型中，阻断C3a仅抑制视网膜下病变的血管成分，但没有显著降低视网膜下纤维化。C3aRA也未能抑制视网膜下纤维化。先前的一项研究表明，阻断C3a可以缩小CNV病变的大小[25]C3a治疗增加RPE细胞产生VEGF[25]. 此外，我们之前观察到，与完全应答者相比，抗血管内皮生长因子治疗部分应答的nAMD患者的血浆C3a水平较高[24]. C3a-C3aR通路可能在新生血管形成中比在视网膜下纤维化中发挥更重要的作用。也有可能是由于我们研究中使用的治疗方案的局限性，导致缺乏治疗效果。在本研究中，在第二次激光后的第0天和第20天进行C3a阻塞的玻璃体内注射。根据我们的经验，间隔时间小于2周的多次玻璃体内注射会导致眼部创伤和炎症，其严重程度足以影响视网膜疾病[27]. 事实上，我们的IgG治疗组的病灶大小明显大于无玻璃体内注射组（图。6克). 两次注射之间的20天间隔，虽然将注射相关的眼部创伤和炎症降至最低，但可能导致C3a或C3aR的眼内中和不足。需要使用控制药物释放装置或长效药物进行进一步研究来解决这个问题。

结论

总之，我们的研究表明MMT参与了nAMD继发性黄斑纤维化。TGF-β和补体C3a（而非C5a）是黄斑纤维化MMT的潜在诱导剂。进一步研究MMT在黄斑纤维化中的重要性、MMT的关键触发因素、MMT中涉及的巨噬细胞亚群和分子通路，对于了解MMT是否可以作为治疗靶点至关重要。