成年斑马鱼视网膜干细胞及其生态位的分子特征

摘要

背景

几十年来，人们已经知道视网膜干细胞在成年硬骨鱼体内的持续存在，它展现了真正的“成年干细胞”的所有特征，即自我更新、多向分化，以及通过有丝分裂激活对损伤作出反应的能力，并能再生分化的组织。然而，这些成人视网膜干细胞的特殊细胞和分子特征以及支持其在分化视网膜中维持并在生长和再生过程中调节其活性的微环境生态位尚未阐明。

结果

我们的数据表明，斑马鱼视网膜有两种特殊的小生境来维持视网膜干细胞：1）神经视网膜和睫状上皮交界处的神经上皮生发区，称为睫状缘区（CMZ），是视网膜周长的一个连续环，和2）分化的视网膜中一些穆勒神经胶质周围的微环境。在未受损的视网膜中，分散的Müller胶质细胞（更常见的是外周视网膜中的胶质细胞）与增殖的视网膜前体细胞簇相关，这些前体细胞仅限于视杆感光细胞谱系，但在损伤后，苗勒相关视网膜前体细胞可以作为多能干细胞来再生其他类型的视网膜神经元。CMZ与成年哺乳动物大脑中的神经原生态位有几个共同特征，包括接近顶端上皮表面以及与血管密切相关。硬骨部视网膜中的Müller胶质细胞对局部损伤有复杂的反应，其中包括反应性胶质增生的一些特征（胶质纤维酸性蛋白、GFAP的上调和重新进入细胞周期）以及CMZ中多能干视网膜祖细胞的表型和分子特征的去分化和重新获得（N-钙粘蛋白的扩散分布，Notch-Delta信号的激活，以及rx1，vsx2/Chx10，以及pax6a型)以及与放射状胶质细胞相关的特征（脑脂结合蛋白的表达，BLBP）。我们还描述了一种针对Müller glia的新的特异性标记，载脂蛋白E.

结论

在完整、生长和再生的硬骨视网膜中支持多谱系视网膜祖细胞的干细胞龛具有神经上皮和神经源性放射状胶质细胞的特性。成年斑马鱼视网膜的再生能力及其替换丢失的视网膜神经元的能力为发现导致受损神经组织功能修复的分子调节器提供了机会。

背景

中枢神经系统中产生神经元和胶质细胞的神经前体细胞的鉴定和表征是一个备受关注的课题。现在人们普遍认为，神经干细胞存在于成年哺乳动物前脑的特殊“小生境”中，在那里它们产生大量选定类型的神经元[1——三]. 最近最有趣的发现之一是，这些成年神经干细胞具有胶质细胞的某些特性[4,5]发育中的哺乳动物和鸟类胚胎脑的某些区域的神经元也来源于放射状胶质细胞[6]. 在成人大脑中，称为“小生境”的微环境隔间提供了一个类似胚胎的环境，以支持具有自我更新和多潜能基本特性的神经干细胞的维持，即.多谱系分化能力[5,7]. 尽管仍知之甚少，但大脑和其他地方成人干细胞壁龛的一些明确特征开始显现[8——13]. 神经干细胞及其生态位的一些共同特征包括：显著的钙粘蛋白介导的粘附连接，丰富的细胞外基质，通过整合素介导的连接与特殊的基底膜接触，与血管密切相关，细胞表面碳水化合物标记物(例如.，阶段特异性胚胎抗原-1，SSEA-1，也称为Lewis X，LeX或分化白细胞簇15，CD15），BLBP（脑脂质结合蛋白，由该基因编码脑型脂肪酸结合蛋白7,FABP7公司)，表达选定类别的中间丝蛋白(例如.，nestin），对IGF（胰岛素样生长因子）、TGFβ/BMP（转化生长因子β/骨形态发生蛋白）家族、Wnts、Shh（声波刺猬）、Notch和LIF（白血病抑制因子）等外源信号的反应性。可能并非巧合，这些外源性调节因子代表了所有对早期胚胎发育至关重要的信号通路的主要家族[14].

神经视网膜是前脑的胚胎衍生物，但与大脑皮层不同，哺乳动物视网膜中尚未描述成年神经干细胞体内除鱼类和两栖幼体外，脊椎动物的视网膜神经发生在胚胎或胚胎后早期发育期间完成[15——17]. 具有产生视网膜神经元能力的神经祖细胞可以从神经诱导的最早阶段通过一系列指定视网膜身份的转录调节因子的区域化表达来识别[18,19]. 这些早期的“视野转录因子”包括配对类同源异型盒基因第6页和接收，是的成员眼正弦同源异形盒家族，Six3合金和LIM-homeobox基因，Lhx（磅）.配对类同源异型盒家族的其他成员，通道10（称为vsx2金鱼和斑马鱼[20])和Crx公司出现在发展中的光学杯的后期[17]. 这些同源盒转录因子的持续共表达是多能干视网膜祖细胞的一个显著特征[16,21——24].

在幼体两栖类和硬骨鱼类中，视网膜神经发生在神经视网膜和睫状上皮之间的界面（称为睫状边缘区（CMZ）或周生发区）在胚胎后继续进行[25——29]. 在这些物种中，CMZ产生了成年人眼睛中发现的大部分视网膜组织[26,30]，但支持维持和调节成年鱼眼视网膜干细胞活性的CMZ生态位的特殊细胞和分子特征尚未阐明。最近在出生后的小鸡和有袋类哺乳动物中发现了一种短暂的CMZ减少[31]在基因损伤的小鼠中可以看到残留的CMZ，这种损伤会增加声音刺猬信号的活性[22]. 虽然成年哺乳动物视网膜的睫状上皮可能保留一些神经生成潜能体内[32]和在体外[33,34]在这些物种中，神经发生的任何内源性能力都是潜在的，没有功能性后果。

除CMZ外，视网膜前体细胞的另一来源仍然存在于成年硬骨鱼视网膜中，尽管这些细胞的身份和特征尚不清楚。在未受伤的分化视网膜中，随着鱼眼的生长，杆状光感受器积聚在视网膜中央，它们是由位于分化杆状细胞核中的外核层（ONL）的谱系受限杆状前体细胞快速分裂产生的[35]. 杆状前体来源于内核层（INL）中增殖较慢的祖细胞，这些祖细胞产生快速增殖的祖细胞簇（转运扩增细胞），它们沿着幼虫Müller胶质细胞的径向纤维迁移到外核层[35]和成人[36,37]鱼。并非所有的Müller胶质细胞都与神经发生有关，杆前体细胞和INL前体细胞簇的空间分布不同，因为它们在CMZ附近密度更大，即.，在最近生成的视网膜中[36,37]. INL中缓慢分裂的祖细胞对Pax6具有免疫反应性[37]但尚不清楚它们是否表达CMZ中发现的其他视网膜前体转录因子。ONL中的杆前体不表达Pax6，但它们确实表达神经前体bHLH转录因子，神经元D表明这些ONL祖细胞可能与光感受器谱系有关[38].

尽管他们的身份尚未确定，但很明显，多能干细胞（具有生成所有类型视网膜神经元的能力，不仅仅是视杆感光细胞）不仅存在于CMZ的生发区，而且也存在于中央视网膜。成年硬骨鱼有强大的能力再生视网膜神经元，并在手术损伤、神经毒素、激光或光损伤造成的损伤后恢复适当的层流视网膜结构[29,39,40]. 所有这些研究都得出结论，视网膜中央再生神经元的来源是一个固有的祖细胞群体，而不是CMZ。在完整的视网膜中，INL祖细胞的后代仅分化为视杆感光细胞，但一些作者推测这些祖细胞可能保留产生多谱系的能力[29]. 另外，有人认为，Müller胶质细胞在视网膜损伤后迅速增殖，可能保留在鱼类视网膜中生成神经元的潜在能力[40——42].

在本研究中，我们定义了生长和再生成年斑马鱼视网膜中视网膜前体细胞的分子特征，并检查了它们所在的细胞龛的特性。我们介绍了一种用于视网膜再生分析的简单热损伤范式，描述了锥体光感受器再生的时间过程，并检查了损伤诱导的增殖前体细胞（产生再生锥体）的分子分布。我们的数据显示，成鱼视网膜有两种特殊的微环境小生境，可以维持多能、自我更新的视网膜干细胞：外周CMZ和分化视网膜中一些穆勒神经胶质形成的微环境。我们进一步证明，CMZ生发区的视网膜干细胞生态位和再生视网膜中损伤诱导的干细胞生态位有一个共同的分子特征，包括激活的Notch信号、N-钙粘蛋白的弥散分布、BLBP的表达和视网膜同源盒基因的表达rx1，pax6a和vsx2/Chx10Müller胶质细胞形成视网膜干细胞龛，并可能在再生视网膜中生成视网膜干细胞。与CMZ的神经上皮细胞（视网膜干细胞和祖细胞）一样，它们与视网膜玻璃体表面的血管特殊基底层有关，其细胞核在与视网膜下间隙（前脑心室腔的胚胎衍生物）接触的顶面分裂。

结果

斑马鱼CMZ视网膜干细胞和祖细胞的分子特征

斑马鱼视网膜神经元的初始分化和视网膜纹层的形成在受精后3天胚胎发育结束时完成，在此之后，增殖的视网膜前体细胞集中在视网膜周边边缘的一个生发区，由汇聚的视网膜层形成一个楔形细胞，称为睫状缘区CMZ（图。1安培). 斑马鱼CMZ中增殖的视网膜前体细胞亚群表达与视网膜规范相关的配对类同源盒转录因子，包括rx1型在ONL的分化（有丝分裂后）锥体光感受器中也有表达（图。1B、C、F),vsx2/Chx10（图。一维)和pax6a型（图。1E级). 在靠近睫状上皮的生发区的最外围区域，pax6a型与共同表达rx1型（图。1楼)，这表明具有多谱系能力。

图1

斑马鱼视网膜CMZ胚胎后神经发生的分子特征.A）和B）斑马鱼幼鱼（4 dpf）。A） CMZ中有丝分裂视网膜前体细胞（箭头所示）对PCNA呈免疫反应（绿色）。B）rx1型（品红色）在CMZ（箭头）和在外核层（ONL）中的分化锥中。五十、 透镜；GCL、神经节细胞层、INL、内核层。比例尺=50μm。C） –J）2个月大的斑马鱼幼鱼视网膜。C） 外围CMZ中的单元格带有双标签（白色箭头）rx1型（洋红色）和PCNA（绿色）。D） 外围CMZ中的单元格带有双标签（白色箭头）对比x2（洋红色）和PCNA（绿色）。E） INL中的无长突细胞和GCL中的神经节细胞表达pax6a型和许多PCNA⁺CMZ中的细胞被双重标记为第6页（白色箭头）。F） 外周CMZ细胞共表达rx1型（洋红）和pax6a型（绿色）。比例尺=50μm。G） CMZ（箭头）表达式中的单元格缺口1a（洋红色）。H） PCNA公司⁺CMZ中的细胞（绿色）、相邻睫状缘中的非色素细胞和CMZ附近分化视网膜中的Müller胶质细胞（箭头所示）是BLBP⁺BLBP-免疫活性在Müller胶质细胞中逐渐消失。一） 周围血管（BV）和内丛状层窄带（IPL）周围SSEA-1/LeX（绿色）的免疫反应性。J） N-钙粘蛋白（Cdh，洋红）的免疫反应性完全包围PNCA的细胞体⁺CMZ中的（绿色）有丝分裂细胞和相邻的无色素睫状上皮中的细胞。在分层视网膜中，N-钙粘蛋白定位于外界膜（箭头）和突触层的粘连小带连接处。一种孤立的PCNA⁺内核层的细胞（箭头所示）是杆谱系中的INL祖细胞。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

图1A–E表明PCNA占领的领土⁺CMZ中的增殖细胞比视网膜前体转录因子的表达域宽。在爪蟾幼虫视网膜中，这些和其他分子标记物在CMZ祖细胞中的模式和空间分布已被解释为反映视网膜发育的时间序列：多能祖细胞(即视网膜干细胞）与睫状上皮相邻，而命运受限的视网膜前体细胞更集中[43]. 为了确定斑马鱼CMZ中是否存在类似的组织，我们系统地检查了这些基因的选定子集的表达模式。我们将CMZ分为四个解剖学定义的区域：外围、中间、中央-外部和中央-内部（图。2). 然后我们通过以下方法分析基因表达就地在2个月龄斑马鱼的CMZ中进行杂交，并将四个区域的信号水平分为强（秩=3）、中等（2）、弱（1）或不可检测（0）。因为就地杂交不是一种定量分析工具，不能得出关于基因表达绝对水平的结论，也不能将信号缺失作为无表达的证据，因为其他更敏感的技术检测到较低水平的mRNA转录。然而就地杂交是指它提供异质组织中不同细胞群体相对表达水平的空间信息，这是我们分析的主要目标。结果如表所示1.

图2

用于区域化基因表达分析的CMZ区域定义定义CMZ中四个区域的组织学地标示意图：外围、中间、中心-内部和中心-外部（阴影区域）。外丛状层（OPL）将中央-内部和中央-外部分开。最终神经节细胞层（GCL）来源于中间CMZ，反映了它们的早期出生顺序。中央-内部CMZ中的前体细胞定位于内核层（INL），而中央-外部区域在外核层（ONL）中产生锥形光感受器。箭头、血管；视网膜色素上皮；OLM，外界膜；IPL，内丛状层；M、 米勒胶质细胞。

表1 CMZ中原位杂交信号的相对强度。在CMZ的四个区域中，信号水平被估计为强（秩=3）、中等（2）、弱（1）或不可检测（0）（如图2所示；周=外围，中=中间，中=中心）。对于每个探针，对2到4个视网膜的11到32个切片进行评估。报告秩的算术平均值，并按外围CMZ中的秩降序排列每个探针的数据。大于1.0的值用粗体显示以强调。

在生发区的外围区域rx1，vsx2/Chx10，以及pax6a型显示我们检查的所有探针的最高信号水平（表1). 的表达式pax6a型在外周生发区中含量较高，在中部和中部-内部区域仍较强，这与该基因在分化的无长突细胞中持续表达一致。的级别rx1型外周生发区信号中等rx2码略弱。两者接收基因在中间生发区急剧下调，但在分化的视锥光感受器中重新出现在中央外部区域。个人资料vsx2/Chx10类似于rx1/rx2在外周CMZ中表达水平最高，在中间CMZ中急剧下调。的表达式vsx2/Chx10在分化的INL中再现，可能在双极细胞中，但在CMZ外[20]. 这些转录因子的表达域从CMZ延伸到邻近的睫状上皮（图。1C至F).

一些脊椎动物物种中与视网膜前体相关的其他转录调控因子是神经前体基因的基本螺旋-环-螺旋（bHLH）家族的成员[21]. 哺乳动物/小鸡的斑马鱼直系亲属Mash1/现金1，已调用ascl1a公司（原名扎什1a)在外围CMZ中具有中等信号水平，在中部降低，在中央区域不存在（表1). 与无调性的家庭，例如神经D，通常在神经元分化级联的后期激活，并与特定神经元细胞类型的确定相关[44]. 在视网膜中，神经D指定斑马鱼的光感受器[38]. 这个神经D探针在CMZ的外围和中间只产生非常微弱的信号，但在感光细胞分化的中央区域，尤其是外部区域，信号急剧增加（表1). 所有这些结果都与最原始的(即多能干细胞位于靠近睫状上皮的CMZ最外围区域，更多限制性视网膜前体细胞靠近分化的视网膜。

Notch-Delta信号通路在视网膜细胞命运选择中起着重要作用，特别是在决定是否分化为神经元或Müller胶质细胞或保持未分化状态方面[45,46]. 这种双向信号通路的几个成分在斑马鱼幼鱼和幼鱼的CMZ中表达，包括Notch配体增量A、增量B、增量C、增量D，几个Notch家族成员(缺口1a、缺口1b,缺口3)和激活Notch的下游介体，她的6，哺乳动物的斑马鱼直系同源物赫斯1和her2/Hes5（图。1G个和数据未显示）。对相对表达水平的分析表明，在Notch-Delta信号级联的CMZ成分的大多数外围区域，会发出适度的信号（表1). CMZ中部和中部区域的表达水平较低。以下信号缺口3与槽口1paralogs（未显示数据）。这些数据表明，Notch-Delta信号通路在视网膜前体细胞中被激活，包括多能干细胞，这些细胞共同表达一组转录调节因子，这些转录调节因子与维持视网膜细胞的多向性和指定视网膜细胞的命运有关。

斑马鱼CMZ的微环境具有典型的神经干细胞生态位特征

放射状胶质细胞/星形胶质细胞标记物BLBP与哺乳动物大脑中的成人神经干细胞生态位有关[47]. 我们使用了一种针对人BLBP合成肽的多克隆抗体，该合成肽与预测的斑马鱼同源基因氨基酸序列90%相同，工厂7a[48]. 我们发现CMZ中的视网膜干细胞和祖细胞以及未成熟的Müller胶质细胞对BLBP具有免疫反应性（图。1小时). BLBP免疫反应延伸至整个CMZ和邻近的睫状上皮。在斑马鱼幼体视网膜（1周龄）中，分布在视网膜上的CMZ和未成熟Müller胶质细胞是BLBP⁺（数据未显示），但在2个月大的幼鱼中，只有最近生成的、最接近CMZ的未成熟Müller胶质细胞被标记（图。1小时). 因此，BLBP蛋白随着斑马鱼Müller胶质细胞的成熟而下调。

在哺乳动物中，细胞外基质相关碳水化合物表位SSEA-1/LeX/CD15是胚胎干细胞和成人神经干细胞的表面标志物[12]以及胚胎视网膜前体细胞的亚群[49]. 抗原是三糖，3-岩藻糖基-N-乙酰氨基乳糖，它是来自各种组织的膜糖脂和糖蛋白的一种成分。斑马鱼的SSEA-1表位在环血管周围高水平存在[28,50]位于神经视网膜和覆盖在CMZ上的睫状上皮交界处的玻璃体表面（图。1I公司)以及排列在玻璃体表面上的其他血管周围（数据未显示）。第二个高表达部位是内丛状层中一个不确定特性的离散层流区（图。1I公司)可能在无长突细胞过程中[51]. 视网膜色素上皮（RPE）也表达SSEA-1（数据未显示）。

钙依赖性、嗜同性细胞黏附蛋白N-cadherin（由基因编码钙粘蛋白-2)弥散分布于CMZ和邻近睫状上皮中视网膜干细胞和祖细胞的基底外侧质膜上（图。1焦耳)类似于胚胎视网膜原基中未分化神经上皮祖细胞上N-钙粘蛋白的分布[52]. CMZ中增殖的视网膜前体细胞被包裹在钙粘蛋白介导的与邻近细胞的粘附相互作用网络中。相反，在分化的视网膜中，N-钙粘蛋白靶向形成外界膜（视网膜顶面）的粘连小带、突触（丛状）层和视网膜神经节细胞的轴突（图。1焦耳和[52]).

具有视网膜干细胞分子特征的前体细胞在分化的视网膜中被热损伤局部激活

为了确定负责损伤后视网膜再生的视网膜干细胞是否具有与CMZ中的细胞相似的分子结构，我们在成年斑马鱼的视网膜中创建了主要局限于RPE和潜在光感受器的局部热损伤（图。3A–D级). 受损区域的直径为200至400μm。损伤后1天内，感光细胞明显丢失，核固缩填满ONL和视网膜下神经视网膜与RPE之间的间隙（图。3A、B). zpr1免疫反应的缺失显示病变内锥体光感受器的破坏（图。3C公司)斑马鱼双锥体（由专门的细胞-细胞连接点连接的红色和绿色锥体对）的高度特异性细胞表面标记[53]).

图3

损伤诱导增殖视网膜祖细胞表达 rx1，vsx2 ，以及 pax6a型A）–D）1和3 dpl热损伤视网膜的组织学；A）中的方框区域在B）中放大。细胞丢失主要局限于视网膜色素上皮（RPE）和外核层感光细胞（ONL）。CMZ（A中的箭头）位于神经视网膜和睫状上皮（CE）之间的交界处，与虹膜上皮（IE）在前部连续。比例尺（A）=150μm。C） 在3dpl时，病变区缺少zpr1双锥体免疫反应（红色），内核层出现细长细胞核（白色箭头）。DAPI（蓝色）复染。D） 到3dpl时，病变区域内可见核内层Müller胶质细胞的放射状纤维（黑色箭头），表明存在反应性胶质增生。比例尺=50μm。D） 5 dpl时损伤区（星号）视网膜内外核层的增殖细胞加入4 dpl时注射的BrdU（绿色）。E） 损伤诱导的增殖细胞对增殖细胞核抗原PCNA（绿色）也呈免疫反应，并与米勒神经胶质的径向纤维（品红色，抗人GFAP）有关。注：此处使用的商业多克隆GFAP抗体对斑马鱼中的GFAP没有选择性，但标记了其他中间丝（数据未显示）。相反，针对斑马鱼蛋白质产生的单克隆zrf1选择性标记斑马鱼GFAP[97]。比例尺=50μm。F） –L）4或5 dpl的4小时或24小时BrdU脉冲标记在INL和ONL之间延伸并表达的细胞核簇（洋红）rx1型（F） 和vsx2（J） 如所示就地杂交（红色）。DAPI（蓝色）；zrf1（绿色，抗斑马鱼GFAP）。比例尺=25μm。放大倍率更高的视图rx1型（G、H、I）和vsx2BrdU中的（K，L）⁺zrf1篮中的祖细胞⁺米勒胶质纤维。

热损伤引起视网膜有丝分裂活性的局部增加，开始于2 dpl（数据未显示）。在受损区域，与米勒胶质细胞放射状纤维相关的细长细胞簇以3 dpl的速度出现（图。3D、E). 这些簇中的细胞包含BrdU（图。三维). 我们证实BrdU的掺入反映了有丝分裂细胞的分裂，而不是DNA修复对损伤的反应[54]通过增殖细胞核抗原PCNA的免疫染色（图。第三方). 这些有丝分裂细胞与Müller胶质细胞的放射状纤维密切相关，所有这些纤维都对胶质纤维酸性蛋白GFAP抗体具有强烈的免疫反应性（图。第三方). 活化的Müller胶质细胞的细胞核也重新进入细胞周期，并从INL迁移到ONL（RLB和PAR，未发表的观察结果），正如我们之前在金鱼视网膜再生中所显示的那样[42,55].

在4和5 dpl时，损伤诱导的与GFAP相关的增殖细胞⁺放射状Müller纤维在高水平上共同表达视网膜干细胞标记物rx1，vsx2/Chx10（图。3F–L（左）)和第6页（未显示数据）。溴化铀⁺有丝分裂簇表现强烈rx1型（图。3F–I级)和vsx2/Chx10信号（图。3J–L型). 这些转录因子在病变中的表达垂直延伸到分化视网膜中其各自表达域的层流边界之外（图。1C至F).

热损伤后受损视网膜中Notch-Delta信号通路的成分也强烈上调（图。4A–D级). 4至7 dpl之间，增量C，缺口1b和缺口3探针在病变区域产生的信号强度与CMZ相当。部分（但不是全部）BrdU⁺4dpl联合标记病变区细胞增量C（图。4B类). 这个增量C和缺口信号主要位于相邻的细胞中，并不是共存的（图。4C，D段). 这个增量A、增量B、增量D，以及her6/Hes1探针同样在病变区域产生强信号（数据未显示）。总之，损伤诱导的与米勒神经胶质径向纤维密切相关的增殖细胞表达视网膜干细胞转录因子并激活Notch信号传导。

图4

损伤诱导增殖的视网膜前体细胞的分子特征与CMZ中的视网膜干细胞相似.A）4 dpl时增量C表达式(数据链路控制器; 洋红色）在CMZ（箭头）和病变下方INL细胞（星号）中上调。比例尺=150μm。B） 在4 dpl时，CMZ（箭头）和标记有2小时BrdU脉冲（绿色）的损伤区域的细胞也表达增量C（品红色）。C）缺口1b(n1b型; 绿色）和D）缺口3(第三名; 绿色）也上调，但通常不与增量C（品红色）。E） 在4dpl时，N-钙粘蛋白免疫反应性（Cdh2；品红色）在损伤区域（星号）强烈上调并弥漫性定位。插图：受损视网膜（7 dpl）Müller胶质放射状纤维中zrf1，抗斑马鱼-GFAP（绿色）与N-钙粘蛋白免疫反应（品红色）共存。F） 7 dpl时，BrdU⁺细胞核（绿色）与Müller胶质放射状纤维相关，这些纤维对N-钙粘蛋白（品红色）具有强烈的免疫反应性。DAPI（蓝色）。G） 在3 dpl时，局限于损伤区域的活化Müller胶质细胞（星号）表达BLBP（品红色），这是未成熟Müler胶质细胞的标记，并且它们具有有丝分裂活性（PCNA⁺，绿色）。H） 损伤激活的Müller胶质细胞的径向纤维为zrf1⁺（蓝色）。增殖的Müller核是PCNA⁺（绿色）和许多已经迁移到顶端表面（光受体缺失的前ONL），并且是BLBP⁺（洋红色）。

损伤诱导视网膜干细胞龛，重建CMZ的微环境

病变激活的Müller胶质细胞具有CMZ和胚胎视网膜中视网膜干/祖细胞的一些特征。活化的Müller胶质细胞上调了N-钙粘蛋白的表达，该蛋白像在CMZ的视网膜干细胞和祖细胞中一样弥散分布在整个质膜上（图。第四版). 图中的插图。第四版显示活化的Müller胶质细胞的放射状纤维，与斑马鱼GFAP（zrf1）特异性单克隆抗体和斑马鱼N-钙粘蛋白多克隆抗体共同标记。相比之下，在未受损的分化斑马鱼视网膜中，N-钙粘蛋白免疫反应主要定位于Müller胶质细胞在视网膜顶面（外界膜）形成的粘附连接处、内外丛状层的突触神经膜以及视网膜神经节细胞轴突[56]. BrdU损伤诱导簇⁺细胞核与放射状Müller纤维紧密相连，这些纤维对N-钙粘蛋白具有免疫反应性（图。4楼).

病变区域激活的米勒神经胶质细胞也上调BLBP的表达（图。4G，高)这是CMZ和未成熟Müller胶质细胞中视网膜干/祖细胞的特征（图。1小时). BLBP之间的边界⁺和BLBP^-米勒胶质细胞非常突兀（图。1G个)这表明只有Müller胶质细胞直接受到视网膜损伤的影响，才能去分化并重新获得未成熟的分子图谱。

锥体光感受器在一周内再生

热损伤诱导的一些有丝分裂活性细胞是分化为视网膜神经元的视网膜干/祖细胞，从而修复视网膜损伤。为了确定负责视网膜神经元再生的视网膜干细胞，我们首先需要知道再生的神经元是什么时候出生的，这样我们就可以专注于在此期间和/或之前增殖的细胞。并非病变后每一个间隔的有丝分裂细胞都是视网膜干细胞；例如，小胶质细胞在视网膜损伤后迅速增殖[42,57]吞噬死亡细胞和碎片。分化的Müller胶质细胞在损伤后增殖，即使在不能再生神经元的哺乳动物视网膜中[58].

在本研究中，我们将视网膜神经元再生的时间进程分析局限于锥体感光器，因为它们具有独特且高度专业化的形态和几个独特的细胞特异性标记。为了记录锥体再生，我们首先用BrdU在3到10 dpl的浓度下标记增殖细胞，然后等待几天到一个月，让有丝分裂细胞的后代分化。然后我们用zpr1抗体鉴定了双锥（图。3C公司). 当BrdU暴露4 dpl后4小时检查视网膜时，损伤区域的有丝分裂细胞被标记（图。5A级). 在这个阶段，小胶质细胞（血管衍生的常驻巨噬细胞，用4C4抗体特异性标记[59])位于外界膜和RPE之间的视网膜下间隙，不属于视网膜内增殖细胞池的一部分（数据未显示）。当鱼在BrdU后存活4天（至7 dpl）⁺细胞已经开始分化并表达双锥体标记物zpr1，与病灶附近的完整锥体相比，它们较小且不成熟（图。5亿). 在31 dpl时，再生的视锥细胞完全分化，与周围的感光细胞无法区分，但其细胞核保留BrdU标记（图。5摄氏度). 在生存期较长的所有病变中，持续性BrdU⁺在INL中可以看到核（图。5摄氏度). 我们不知道这些细胞的身份，尽管它们不具有Müller胶质细胞的形态特征，也不具有小胶质细胞特异性抗体4C4的免疫反应性（数据未显示）。我们推测其中大多数是视网膜神经元，这些神经元是在由于损伤而丧失后再生的，正如其他几种硬骨鱼视网膜再生模型中所记录的那样[29,39].

图5

损伤诱导的视网膜前体细胞在一周内再生锥体光感受器.A）在4 dpl时，增殖细胞（BrdU；品红色）充满受损区域（星号），其中zpr1（绿色）的双锥免疫反应缺失。比例尺=250μm。B） 到7dpl时，一些在4dpl时被BrdU（品红色）标记的视网膜祖细胞已开始分化为锥体，并被zpr1（绿色）双重标记。插图中以更高的放大率显示方框区域；双标记细胞为白色。C） 通过31 dpl完全分化，再生的锥状光感受器（zpr1；绿色）用3 dpl注射的BrdU（品红色）标记（双重标记的白色细胞核由黑色箭头指示）。未识别的BrdU⁺视网膜内侧可见细胞核。D） 核糖探针与视锥蛋白的鸡尾酒会（绿色）识别BrdU⁺（洋红），再生锥在31 dpl（双标记白色核用黑色箭头表示）。溴化铀⁺棒核（洋红）位于外核层ONL的内部。E） 转基因斑马鱼Tg中的Müller胶质细胞(绿色食品添加剂：GFP）^2001年3月标有抗GFP（绿色）和共表达载脂蛋白E（洋红，就地杂交）。F） 4 dpl时，大多数BrdU⁺增殖核位于外核层，ONL，但少数载脂蛋白E⁺米勒胶质细胞也是BrdU⁺（插图）。米勒胶质细胞的放射状纤维用zpr1/抗GFAP标记（蓝色）。

为了确定锥体光感受器再生的时间进程，我们在3、4、7或10 dpl时用BrdU标记增殖细胞，并在31 dpl时计数双标记锥体光感受器。由于zpr1抗体仅标记红绿色双锥和斑马鱼有两种额外的单锥类型，它们表达蓝色或紫外线敏感的视蛋白，因此我们对四种视蛋白类别（红色）使用了混合RNA探针(lws-1型)，绿色(rh2-1型)，蓝色(软件2)和紫外线(交换机1)–标记所有锥体类型（图。5天). 我们还统计了BrdU⁺病变区域ONL中的杆状光感受器（图。5天). 细胞计数（图。6A级)表明斑马鱼的再生锥在3到7 dpl之间出生，而大多数杆状体在7 dpl或更晚出生（图。6A级和数据未显示）。在发育中的斑马鱼视网膜中，视锥细胞先于视杆细胞出生，就像它们在哺乳动物胚胎视网膜中一样[60,61]. 在我们之前对金鱼视网膜再生的研究中，我们发现，当锥体的补体恢复时，有丝分裂前体中不断产生的视杆感光器基本上停止了[62,63]这里我们显示斑马鱼也有类似的过程。视网膜干细胞产生的光感受器细胞类型分布的这种时间性变化表明，它们对变化的微环境因子作出反应，类似于在发育中的胚胎视网膜中发现的微环境因素，这些微环境因子调节视网膜神经元的顺序产生。

图6

A） 视锥和视杆感光器再生的时间过程BrdU的编号⁺在31 dpl时，每个截面上的视杆和视锥感光器绘制为BrdU注射时间的函数（损伤后天数）。每个条形图是通过结合两个视网膜和每个视网膜4至17个截面的计数数据计算得出的每个截面的平均数。在ANOVA显示每个时间点视网膜平均计数之间没有显著差异后，将数据汇总。误差条代表一个SEM。将平均值与单因素方差分析进行比较表明，在3 dpl时比在4 dpl时出生的锥体略多（p<0.05），在7 dpl时较少（p<0.001），在10 dpl时几乎没有锥体（数据未显示）。相比之下，在3和4 dpl时，杆比锥出生的要少得多（p<0.001），但在7（p<0.01）和10 dpl时出生的杆比锥要多得多（数据未显示）。B） 2 dpl时的大多数增殖细胞是Müller胶质细胞将视网膜受到热损伤的鱼暴露于2、3或4 dpl的BrdU脉冲中4小时。视网膜经过处理就地与载脂蛋白E标记米勒胶质细胞体和BrdU免疫细胞化学的探针。每个条形代表一个病变，每个病变计算2至9个截面。所有BrdU⁺对细胞核进行计数和评分载脂蛋白E.BrdU的平均数⁺每个截面的原子核在每根杆的上方给出。通过单因素方差分析对数据进行统计分析表明载脂蛋白E⁺BrdU中的电池⁺2dpl时的种群数量大于3dpl（p<0.01）或4dpl（p<0.01），但3dpl与4dpl没有差异。

损伤激活视网膜干细胞/祖细胞的鉴定

纵向出生日期分析确定，在3至7dpl之间增殖的细胞为视网膜祖细胞，其后代分化为视锥细胞感光器。由于锥体光感受器通常不会在完整视网膜的分化区域产生，这些数据表明，多能干细胞存在于中央视网膜中，能够通过改变其谱系剖面来对损伤作出反应，以补偿特定神经元亚型的丢失。如上所述，此时损伤区的大多数有丝分裂活动位于与Müller胶质细胞的放射状纤维密切相关的INL中增殖细胞的细长簇中(例如.，图。3E–L型,4F、H). 这些增殖细胞簇已在以往所有硬骨鱼类视网膜再生研究中观察到，并已注意到它们与未受损视网膜的视杆感光细胞谱系中的祖细胞相似[64]. 潜在视网膜干细胞的另一个潜在来源是Müller胶质细胞本身[29,41,42,65,66]. 这个问题很难解决，因为杆系中的视网膜前体细胞与未受损视网膜中Müller胶质细胞的放射状纤维紧密相关[35]和再生视网膜（图。3E–L型,4F、H)以及包裹相邻细胞的Müller过程的复杂性[67]. 这些紧密而复杂的解剖关系使得很难用荧光显微镜和标准的、细胞质Müller特异性标记来确定，例如GFAP、细胞视网膜醛结合蛋白（CRALBP）和谷氨酰胺合成酶，是否为特定的BrdU⁺细胞核属于Müller细胞或相关的祖细胞。

为了用更好的技术来研究这个问题，我们寻找了一个局限于细胞体的米勒特异性标记。载脂蛋白E（ApoE）是几种不同脂蛋白的一种小蛋白成分，由包括胶质细胞在内的许多细胞分泌[68]. 确定是否载脂蛋白E通过Müller细胞表达，我们使用转基因斑马鱼[69]其中增强型绿色荧光蛋白（GFP）由斑马鱼的转录调控元件控制绿色食品添加剂基因。该转基因系中的GFP报告基因是细胞质的，充满了Müller胶质细胞的细胞体和所有过程。我们发现了斑马鱼载脂蛋白E在中选择性地高水平表达绿色食品添加剂：GFP⁺分化的Müller胶质细胞，信号主要局限于INL中的细胞体（图。第五版). 这个载脂蛋白E探针还与杂交到rlbp1-l型(视黄醛结合蛋白1样)Müller神经胶质标记CRALBP（细胞视黄醛结合蛋白）的斑马鱼直系同源物[70]（未显示数据）。因此，它是识别BrdU的有用标记⁺增殖的Müller胶质细胞。

如果Müller神经胶质细胞在受损视网膜中起到视网膜祖细胞/干细胞的作用，那么它们应该在再生视锥光感受器出生之前和/或期间增殖(即进行末端有丝分裂），我们发现其在2-4dpl之间。很少有细胞在1 dpl时合并BrdU（数据未显示），但在2 dpl时约80%的增殖细胞载脂蛋白E⁺/溴化铀⁺米勒胶质细胞（图。6亿). 的分数载脂蛋白E⁺/溴化铀⁺增殖细胞群中的苗勒胶质细胞减少了约50%，分别减少了3和4dpl，而BrdU的总数⁺细胞核从2 dpl时平均每节34个增加到3 dpl时的每节85个，到4 dpl时每节235个（图。6亿). 这些数据与几种解释一致。米勒-格里亚表示载脂蛋白E当BrdU的大小为2 dpl时，占增殖细胞的绝大多数（80%）⁺人口最少。剩余20%的BrdU⁺单元格载脂蛋白E^-此时可能是杆状谱系或去分化苗勒胶质细胞的祖细胞，也可能是表达下调的苗勒胶质的后代载脂蛋白E表达式。对罕见BrdU的进一步研究⁺具有视网膜干细胞和祖细胞特异标记物的2 dpl前早期细胞(例如，rx1、pax6a、vsx2、neuroD、crx)可能会回答这个问题。扩张的BrdU的Müller胶质部分的下降⁺3和4dpl时的群体可以用增殖的Müller细胞的去分化和/或非Müler视网膜祖细胞的更快增殖速度来解释。最后，这些数据也符合以下假设：损伤诱导的视网膜干细胞可能来源于Müller胶质细胞，在2 dpl或之前开始增殖，去分化并产生视网膜干细胞。

讨论

我们对斑马鱼视网膜干细胞维持的两种特殊小生境的分子微环境进行了表征：1）周边视网膜边缘的睫状边缘区（CMZ）和2）分化视网膜中的一些Müller胶质细胞（图。7). 斑马鱼CMZ中的视网膜干细胞生态位与成年哺乳动物大脑中的神经原生态位有几个共同特征，包括脑室下区（SVZ）和齿状回颗粒下区（SGZ），它们被描述为“移位的神经上皮”。成体神经干细胞是专门的星形胶质细胞，既充当神经干细胞又充当小生境细胞；它们延伸突起，在心室表面形成心尖连接，也与血管周围的基底层广泛接触[5,7]. 斑马鱼CMZ中共同表达的视网膜干细胞rx1，pax6a和vsx2/Chx10接触根尖表面和基底层，并靠近SSEA-1大血管（ora收集血管）⁺（图。7). 模仿发育中神经管和视网膜的神经上皮细胞的其他特征包括Notch信号级联的激活（通过表达notch1a/1b、notch3、dlA、dlB、dlC、her6/Hes1、her2/Hes5：RLB和PAR，未发表的观察结果）和N-钙粘蛋白在质膜上的扩散分布[52]. 放射状胶质标记物BLBP是Notch信号的下游靶点[71]和Pax6[72]两者都与神经干细胞命运的维持有关。斑马鱼的CMZ细胞表达放射状胶质标记物BLBP，睫状上皮细胞和视网膜色素上皮细胞以及未成熟的Müller胶质细胞也是如此。金鱼胰岛素样生长因子（IGF）刺激CMZ中的有丝分裂活性[64]以及Wnt或声波刺猬（Shh）对小鸡、小鼠和爪蟾视网膜的影响[26,73,74]. SSEA-1碳水化合物结合Wnts[8,49]，其与斑马鱼的ora收集血管的联系可能有助于维持CMZ处神经上皮的特殊微环境。RPE靠近心尖侧是另一个可能促进CMZ神经上皮特性的分泌信号的潜在来源。斑马鱼的RPE表达BLBP，是Shh的来源[75]. 我们尚未在斑马鱼中寻找PEDF（色素上皮衍生因子），但这种生长因子由SVZ的成分分泌，支持小鼠成年神经干细胞的自我更新[76].

图7

斑马鱼视网膜中的干细胞小生境神经视网膜和睫状上皮（CE）交界处的生发区是神经上皮细胞（红色）的周向楔形物，称为睫状缘区（CMZ）。多潜能视网膜干细胞跨越靠近CE的视网膜上皮的宽度，更多限制性视网膜前体细胞依次产生1）视网膜神经节细胞（GC）、2）无长突细胞（AC）、3）双极细胞（BP）和水平细胞（HC）以及4）视锥细胞。CMZ通过一个狭窄的视网膜下间隙与视网膜色素上皮（RPE）分离。眼集合血管（BV）在CMZ包围视网膜；玻璃体循环的其他血管沿玻璃体表面分布。米勒神经胶质细胞（蓝色）横跨视网膜的宽度，形成一个小生境，支持光感受器谱系中最后一个出生的视网膜神经元的视网膜祖细胞（绿色）。视网膜祖细胞/干细胞及相关细胞类型的特异性标记物的表达。视网膜损伤导致Müller细胞/杆谱系生态位重组，产生再生生态位（紫色），反映细胞组织和基因表达模式中的CMZ生态位。

一些Müller胶质细胞在分化的视网膜内创建了一个独立类型的视网膜干细胞龛。视网膜Müller胶质细胞经常与发育中大脑的放射状胶质细胞相比较[77]. 与放射状胶质细胞一样，米勒胶质细胞的突起跨越视网膜上皮的宽度，从顶部上皮表面（外界膜）到玻璃体表面的基底层，并表达星形胶质细胞的结构和功能标记（图。7). 在硬骨鱼的完整视网膜中，快速增殖的INL祖细胞（视杆感光细胞系中的转运放大细胞）聚集在放射状Müller细胞纤维周围，它们利用这些放射状突起作为迁移到ONL的向导[36,64]正如我们之前通过序列重建电子显微镜所示[35]. 并非所有的Müller胶质细胞都与INL祖细胞相关，并且在视网膜周边附近的频率最高（最年轻的视网膜，最近由CMZ生成）[36,64]. 我们还不知道这些神经原生态位是否与Müller胶质细胞的一个特殊亚群有关。在完整的视网膜中，这些假定的Müller细胞小生境中的视网膜祖细胞仅定向到杆状谱系中，但在损伤后，神经原性簇的频率增加[78]，视网膜祖细胞的命运被改变[65]以及Müller胶质细胞变化的结构和分子特征[41,79]（当前数据）。受损鱼类视网膜中的Müller胶质细胞表现出许多与反应性胶质增生症相关的表型变化，例如GFAP上调[42,55]通常被认为是压力和病理过程的指标[80]然后重新进入细胞周期[58]. 在这里，我们发现它们也表现出表明脱分化的表型变化，例如BLBP的重新表达和细胞核向顶面迁移，这两种变化都是斑马鱼幼体视网膜中未成熟Müller胶质细胞的特征（RLB、LKB和PAR，未发表的观察结果）。损伤诱导的视网膜干细胞/多能干细胞前体缠绕在Müller过程中，Müler过程对Notch-Delta信号通路和N-钙粘蛋白(cdh2) [81]. N-钙粘蛋白分布在活化的Müller胶质细胞的基底外侧膜上，类似于其在神经上皮细胞上的分布。

哺乳动物胚胎脑中的放射状胶质细胞是神经原性祖细胞[6,82,83]成年哺乳动物脑中的特殊星形胶质细胞作为神经干细胞发挥作用[2,4,84]因此，毫不奇怪，我们和其他人提出米勒胶质细胞可能在硬骨鱼体内产生损伤诱导的视网膜干细胞[41,42,66,79]尽管使用选择性和永久性谱系示踪剂绘制Müller胶质细胞命运图的直接证据尚未完成。费舍尔和雷赫[57,85]根据眼内注射神经毒素（NMDA、红藻氨酸或秋水仙碱）或生长因子（IGF和FGF2，在大鼠视网膜上也进行了类似的观察[86]. 然而，仅在硬骨鱼类中发现视网膜神经元丢失的生理相关再生修复[40]和一些两栖动物[26].

受伤的鱼视网膜最显著的形态学变化之一是增殖的视网膜祖细胞和米勒细胞核迁移到顶端表面，随后重建神经上皮；这种解剖结构是视网膜神经元再生的必要条件，而不依赖于损伤机制[39,55,63]. 例如，选择性破坏成年金鱼内层视网膜神经元的神经毒素无法引发视网膜干细胞反应，缺失的神经元也无法被替换。只有当光感受器被破坏时，再生过程才会被触发，视网膜才会被修复，包括内部神经元和光感受者。对这种不同损伤反应的一个可能解释是，受损的感光细胞释放因子，刺激视网膜干细胞并创造“再生生态位”。另一种并非相互排斥的可能性是，在没有感光细胞的情况下，增殖的视网膜前体细胞重新与顶面接触，从而重建类似于CMZ中发现的神经上皮组织。由于哺乳动物视网膜中的Müller胶质细胞在受损或营养不良的哺乳动物视网膜中也有类似的行为，但不产生神经元，因此在光感受器丢失后Müler核向顶面迁移显然不足以触发再生干细胞反应[87]. 关键的未回答问题是，什么样的外部信号是必要的，并且足以刺激再生视网膜干细胞生态位的形成？在早期发育中，与维持神经祖细胞未分化、多能状态相关的几种细胞外因子可促进后期的胶质细胞分化，包括LIF和Notch信号的激活[88,89]. 在发育中的视网膜中，Notch信号的激活要么维持未分化的祖细胞，要么促进Müller胶质细胞分化，这取决于阶段相关的上下文线索[45,46,90]. LIF通路也可能涉及：从新生小鼠视网膜分离并通过暴露于生长因子诱导增殖的Müller胶质细胞表达LIF[91]LIF是小鼠嗅上皮损伤诱导神经发生所必需的[92].

结论

我们的数据表明，成年鱼视网膜中的Müller胶质细胞对局部损伤有复杂的反应，包括一些反应性胶质增生症的特征（GFAP上调和重新进入细胞周期）以及去分化和重新获得多潜能视网膜前体细胞的表型和分子特征（N-钙粘蛋白的扩散分布、Notch-Delta信号的激活以及rx1，vsx2/Chx10，以及第6页和BLBP）。这种损伤诱导的胶质细胞活化的结果并不像哺乳动物视网膜中那样产生更多的Müller胶质细胞和形成胶质瘢痕[80,87]相反，视网膜干细胞龛被重建，其分子和形态特征反映了神经源性CMZ。我们的数据表明，在受损的视网膜中，激活的穆勒神经胶质细胞定义了视网膜干细胞生态位，我们的结果与视网膜干细胞来源于增殖的穆勒神经胶质的说法一致。这个想法符合成人神经干细胞的新兴观点体内是放射状胶质细胞衍生的一个亚群，具有神经生成潜能。

方法

视网膜热损伤

根据标准程序，对来自我们远缘野生型群体的斑马鱼进行了饲养。成年鱼在0.04%Tricaine（3-氨基苯甲酸乙酯；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）中麻醉，并在体视显微镜上定位于鱼的侧面。通过对腹侧眼睛施加压力使其在眼窝中扭转，使眼球的背侧巩膜表面暴露出来。用鳄鱼夹将直径为0.2–0.3 mm的铜线连接到焊接笔上（型号#64-2055A，Radio Shack，Fort Worth TX），焊接笔安装在微操作器上，设置为15瓦。将加热的铜线接触巩膜外表面5秒钟。鱼被复活，并在损伤后1至31天内恢复（dpl）。密歇根大学动物使用和护理大学委员会批准了所有实验程序。

增殖细胞的溴脱氧尿苷标记

采用两种方法将视网膜细胞暴露于胸腺嘧啶类似物5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU；Sigma-Aldrich）。斑马鱼从1至10 dpl腹腔内注射BrdU[66]. 或者，将鱼放置在含有5 mM BrdU的水族馆系统水中2小时[41]. 从4小时到31天后，处死鱼，并按以下所述对眼睛进行组织学检查。

组织学和免疫细胞化学

组织学检查，将受损眼睛摘除，固定在2.5%戊二醛/1%多聚甲醛中0.08M磷酸盐缓冲液、3%蔗糖、1mM MgSO中₄（pH 7.4），并嵌入Epolate 12树脂中（Ted Pella，加利福尼亚州雷丁）。半薄（1μm）切片用1%亚甲蓝、1%天青II在1%硼酸钠中染色。

为了进行免疫细胞化学，从~10 hpf开始用0.2 mM PTU（1-苯基-2-硫脲）处理斑马鱼幼体，以阻止RPE中黑色素的形成。将完整的幼鱼、幼鱼（2个月龄）、去核的眼睛和成年鱼（≥1岁）固定在4%多聚甲醛中的0.1 M磷酸盐缓冲液中，并按前述方法制备冷冻切片[93]. 用4%多聚甲醛在95%乙醇中固定用于PCNA（增殖细胞核抗原）免疫细胞化学的组织。用于BrdU免疫细胞化学的载玻片用2N HCl预处理30分钟。一些载玻片通过孵育20分钟来处理抗原回收。在98℃下，在10 mM柠檬酸钠（pH 6.0）中加入0.05%吐温20，然后冷却并在0.1 M磷酸盐缓冲盐水中冲洗。

主要抗体和稀释液包括：单克隆抗体-抗PCNA（Sigma-Aldrich），1:1000；zrf1（Zebrafish国际资源中心，ZIRC，尤金，俄勒冈州），1:5；zpr1（ZIRC），1:200；大鼠抗BrdU（Accurate Chemical，Westbury，NY），1:50；4C4（来自伦敦大学学院乔纳森·斯科尔斯），1:200；SSEA-1/LeX，碳水化合物表位（MC-480，发育研究杂交瘤银行，爱荷华州爱荷华市），1:5。多克隆抗体-抗人GFAP（DakoCytomation，Carpindia，CA），1:100；抗人BLBP（马萨诸塞州剑桥Abcam），1:1000；亲和纯化的抗斑马鱼N-钙粘蛋白（N-末端肽）[52], 1:500; 抗GFP（Invitrogen，Carlsbad，CA），1:200。

1:200稀释度的次级抗体包括：抗鼠IgG、Alexa 488结合物；抗鼠IgG，Alexa 647偶联物；抗兔IgG，Alexa 555结合物（来自Invitrogen的Alexa结合物）；抗鼠IgM，FITC（异硫氰酸荧光素）偶联物；抗鼠IgG、Cy-3、FITC和AMCA（7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸）共轭物（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.）。载玻片安装在ProlongGold防褪色试剂（Invitrogen）中，与核染色DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）预混合。

原位杂交

地高辛（DIG）标记或荧光素（FL）标记RNA探针的合成和杂交方法[94]修改如下：Hauptmann杂交缓冲液[95]，杂交温度为65℃，无核糖核酸酶处理，杂交后严格性增加[96]. 使用从斑马鱼cDNA模板（最小长度：741 bp）转录的探针，浓度如下：缺口1a,缺口1b,槽口2,缺口3（来自阿德莱德大学迈克尔·拉德利）0.8μg/ml；her1，her6（来自Jose Campos-Ortega，已故）8μg/ml；增量A,增量D（来自范德比尔特大学Bruce Appel）8μg/ml；增量B,三角洲C（摘自伦敦大学学院朱利安·刘易斯）8μg/ml；rx1、rx2、rx3（来自西弗吉尼亚大学彼得·马瑟斯）4μg/ml；vsx2（来自Nisson Schechter，SUNY Stony Brook）4μg/ml；pax6a型（来自辛辛那提儿童医院Nadean Brown）1μg/ml；绿色食品添加剂（来自宾夕法尼亚州詹姆斯·沃伦）8μg/ml；ascl1a数字（来自Nadean Brown）4μg/ml；神经D（来自密歇根大学彼得·希区柯克）4μg/ml；载脂蛋白E（来自密歇根大学Susan Lyons）0.5μg/ml；视锥蛋白基因sws1、sws2、rh2-1、lws-1（摘自圣母大学托马斯·维特利奇），250 ng/ml。

对于双色就地杂交[94]将DIG标记和FL标记探针混合并杂交到组织，然后分别用与碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（POD）结合的抗DIG或抗FL抗体检测。AP（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）的快速红（FR）彩色底物之后是间接酪氨酸信号放大（TSA）荧光系统（TSA-生物素/亲和素-FITC），以检测POD结合抗体（马萨诸塞州波士顿珀金埃尔默生命与分析科学公司）。或者，为了避免致密FR沉淀物掩盖TSA-FITC信号的任何可能性，抗FL和抗DIG抗体都与POD结合。首先用抗FL POD结合抗体孵育，然后用间接TSA-生物素/亲和素-FITC检测FL标记的探针，如上所述。然后用3%的H孵育使POD失活₂O（运行）₂在0.1 M PBS中培养15分钟，用抗DIG POD结合抗体孵育切片，并使用直接TSA-Cy3（Perkin Elmer）检测。

细胞计数

对视网膜受损的鱼以3、5、7或10dpl的剂量腹腔注射BrdU，31dpl的浓度固定视网膜并冷冻切片。斑马鱼视锥蛋白基因的DIG标记探针(sws1、sws2、rh2-1、lws-1)以每种250 ng/ml的浓度组合，杂交，并用抗DIG（用FR显示AP-结合物）检测，然后用BrdU免疫荧光检测。

为了确定光感受器再生的时间进程，用BrdU识别再生光感受者的区域⁺INL中的细胞核。标签制作者就地与视锥蛋白鸡尾酒杂交鉴定出视锥光感受器，与BrdU杂交鉴定出的视锥光感受器⁺计数细胞核。溴化铀⁺还对INL中由BrdU标记限定的视网膜节段内的杆状核进行计数。（注意BrdU⁺受损区外的视杆感光器不是再生神经元，而是硬骨鱼视网膜正常生长时新加入的。这些没有计算在内。）对每个病变的4至17个切片进行评分，并对BrdU的平均数量进行评估⁺计算每个截面的锥体和杆。

为了量化损伤激活的Müller胶质细胞增殖的时间进程，在损伤后2、3或4天，用2小时BrdU脉冲标记的鱼视网膜进行处理就地用米勒标记杂交载脂蛋白E.BrdU（制动踏板）⁺对每个视网膜的2至9个切片中的细胞核进行计数，并用ApoE进行双重标记评分。最大化BrdU数量⁺我们检查了每一个样本的细胞核，切片切向病灶。

成像

对于光学显微镜，我们使用了AxioVision软件（德国耶拿卡尔蔡司）支持的外荧光复合显微镜（配备Axiopot 2相机的蔡司Axioplan或配备AxioImager的蔡司阿xioImage和配备AxioSCam MRM相机的ApoTome），或奥林巴斯BX-51外荧光复合镜（日本东京奥林巴斯）。对于激光扫描共焦显微镜，我们使用奥林巴斯Fluoview 500，配备405 nm蓝色二极管、458 nm、488 nm和514 nm多线氩、543 nm氦氖绿和633 nm氦霓虹红激光器。使用Fluoview 4.3版和Tiempo软件处理图像。我们使用Adobe PhotoShop来调整数字图像的亮度、对比度和清晰度。使用通道混合器工具调整RGB颜色空间中的色调。通过为“混合模式”选择“屏幕”或“加亮”选项，使用“图层样式”工具在PhotoShop中生成来自同一视野的多个荧光和差分干涉对比度图像的叠加。