单纯疱疹病毒1型通过toll样受体9激活小鼠天然干扰素诱导细胞

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种嗜神经性α疱疹病毒，可引起口腔粘膜、结膜、角膜和皮肤的鳞状上皮分层感染。¹ 在原发性感染期间，HSV-1感染邻近的感觉神经元末梢，并到达感觉神经节，在那里它一直处于潜伏状态。偶尔，HSV-1被重新激活，并从感觉神经元传回上皮组织。再激活可导致上皮细胞的细胞病变感染和炎症导致组织损伤。在免疫活性宿主中，HSV-1感染触发了干扰素-α（IFN-α）的分泌，在宿主抗HSV-1反应中起关键作用。^2,三 IFN-α抑制即刻早期的转录HSV-1型基因。⁴ 在小鼠中，IFN-α是角膜中HSV-1复制的有效抑制剂，⁵ 它激活宿主防御系统，如参与控制HSV-1感染和疾病的自然杀伤细胞。⁶ IFN-α也被证明可以限制从外周组织到神经系统的感染进展。⁷ 有人提出，干扰素-α对HSV-1的应答是通过识别HSV-1包膜糖蛋白D（gD）触发的。⁸ 树突状细胞（DC）可通过甘露糖受体和其他凝集素结合HSV-1糖蛋白。⁹ CC趋化因子受体3（CCR3）或CXC趋化因子受体4（CXCR4）可以作为辅助受体发挥作用。⁸ 将HSV-1糖蛋白识别与IFN-α分泌联系起来的细胞内事件尚不清楚。

与细菌DNA一样，HSV-1 DNA包含丰富的脱氧胞苷酸-磷酸-脱氧鸟苷酸（CpG）基序。¹⁰ 这些基序通过最近表征的toll样受体9（TLR9）刺激免疫系统的多个细胞成分。^11-14 TLR9通过髓样分化因子88（MyD88）传递细胞内信号，MyD88启动信号级联，导致NF-κB活化和细胞因子分泌。^15,16 因此，TLR9可能提供了另一种将HSV-1识别与IFN-α反应联系起来的途径。为了验证这一假设，我们将重点放在了天然干扰素产生细胞（IPC）上。IPC，也称为浆细胞样树突状细胞（pDCs），通过分泌高水平的IFN-α、-β和-ω，对HSV-1和其他DNA和RNA病毒作出反应，^17-23 释放IL-12^22,24,25 和上调共刺激分子。^22,24-26 人类和小鼠IPC表达TLR9，并被含有CpG基序的单链寡核苷酸（ODN）激活。^14,27-31 因此，它们代表了一个有价值的生物系统来测试TLR9在HSV-1免疫细胞反应中的作用。在这里，我们证明体外IPC对HSV-1的反应确实由TLR9/MyD88途径介导。然而，缺乏MyD88或TLR9的小鼠可以在局部感染后控制HSV-1复制，这表明TLR9和MyD88的依赖机制可以有效补偿体内受损的抗HSV-1 IPC反应。

MyD88–/–小鼠³² 将其回交给C57BL/6和TLR9–/–小鼠¹³ 将其回交给BALB/c。小鼠年龄在6至12周之间。用CD11c分离脾脏DC⁺微珠（Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，德国）。IPC（CD11c⁺/赖氨酸-6C⁺/CD11b细胞^–细胞），CD11b⁺DC（CD11c⁺/赖氨酸-6C^–/CD11b细胞⁺细胞（包括髓系DC）和CD11b^–DC（CD11c⁺/赖氨酸-6C^–/CD11b细胞^–细胞，包括CD8α⁺DC）从CD11c中分类⁺如前所述，使用MoFlo细胞仪检测脾细胞（Cytomation，Fort Collins，CO；纯度超过95%）。³³ 通过使用人类重组fms相关酪氨酸激酶3配体（Flt3L）（10 ng/mL；明尼阿波利斯R&D Systems，明尼苏达州）培养7天，从骨髓细胞中生成骨髓衍生IPC，并通过对CD11c进行分类纯化⁺/CD11b细胞^低的人口如所述。³³ 细胞与纯化的KOS HSV-1（0.01-10感染多重性[MOI]）、CpG ODN 2216（3μg/mL；加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）或流感病毒PR8（1 MOI）在指示的细胞密度下培养36小时。³³ 紫外线（UV）-灭活稀释HSV-1库存（5×10⁶和5×10⁵使用UV交联剂（最佳交联设置为1.2×10）进行斑块形成单位（PFU）/mL⁵μ焦耳/厘米²).³⁴ 使用酶联免疫吸附试验（ELISA；新泽西州新不伦瑞克市PBL生物医学实验室和新泽西州富兰克林湖BD生物科学实验室）测量培养上清液中的IFN-α和IL-12。IFN-αELISA检测IFN-αA、α1、α4、α5、α6和α9亚种。流式细胞术检测CD86的表达³³ 显示为荧光强度中值。同型控制的中值在图中以虚线表示。

为了检测HSV-1在活小鼠中的复制，我们使用表达萤火虫荧光素酶（FL）报告蛋白的KOS HSV-1重组菌株KOS/Dlux/oriL。³⁵ KOS/Dlux/oriL是通过同源重组到UL49和UL50之间的一个位点构建的，带有一个编码UL30启动子的盒来调节FL，如前所述。³⁶ 将HSV-1注射到6-12周龄（近似年龄）小鼠（2×10）的脚垫中⁶或10⁷PFU/脚垫（如图所示）。使用冷却的电荷耦合器件相机（IVIS；新泽西州克兰伯里Xenogen）通过FL生物发光成像检测小鼠脚垫中的病毒感染。生物发光成像每24小时重复一次，持续1周。感兴趣区域的信号强度表示为总光子通量（每秒光子数）。

如前所述进行角膜感染、眼拭子检查和三叉神经节切除术。³⁷ 简单地说，小鼠感染了2×10⁶角膜划伤后的每只眼PFU。在指定的时间点取眼拭子，并在1mL培养基中稀释。三叉神经节在1mL培养基中均质化。病毒滴度通过Vero细胞的标准菌斑试验测定，以每毫升菌斑形成单位的对数平均值±SD表示。检测限为10 PFU/mL。

CD11c公司⁺从MyD88缺陷小鼠和对照小鼠分离脾细胞，并与HSV-1进行体外培养。36小时后，用ELISA对培养上清中的IFN-α和IL-12进行定量。如所示图1A、MyD88缺陷CD11c⁺脾细胞分泌的IFN-α和IL-12远远低于野生型DC对HSV-1的反应。CD11c公司⁺脾细胞包括IPC，IPC是IFN-α和IL-12的主要来源。²² 此外，它们还包括CD11b⁺树突状细胞和CD11b^–DC，当暴露于适当的细菌和病毒刺激时，也能够分泌细胞因子。^38,39 因此，我们询问这些细胞亚群是否以MyD88依赖的方式对HSV-1产生反应。IPC、CD11b⁺DC和CD11b^–从MyD88–/–和对照小鼠中分离DC，并在体外用HSV-1刺激以诱导IFN-α和IL-12的分泌。如所示图1B，野生型IPCs分泌大量IFN-α和IL-12，而MyD88–/–IPCs的细胞因子分泌严重受损。野生型CD11b⁺和CD11b^–树突状细胞对HSV-1反应时分泌大量IL-12，但IFN-α水平很低。MyD88–/–DC的这些反应减少。最后，我们研究了MyD88缺陷对来自骨髓前体细胞的IPC对HSV-1反应的影响。如所示图1C与正常IPCs相比，MyD88–/骨髓衍生IPCs中IFN-α和IL-12的分泌以及CD86的上调微不足道(图1C). 我们得出结论，MyD88对于体外原发性IPCs和DC以及骨髓衍生IPCs对HSV-1的IFN-α和IL-12应答至关重要。

所有小鼠IPC和DC均表达TLR9，^30,31 它只通过MyD88发出信号。^15,16 因此，IPC和DC对HSV-1的MyD88依赖性反应可能由TLR9启动。为了验证这个假设，我们制备了总CD11c⁺脾细胞、IPC、CD11b⁺DC、CD11b^–DC和来自TLR9缺陷小鼠的骨髓衍生IPC，并测试其对HSV-1的反应。如所示图2，TLR9-缺陷CD11c⁺脾细胞、原代IPC和骨髓衍生IPC分泌的IFN-α和IL-12明显低于野生型IPC。与野生型IPCs相比，TLR9缺陷IPCs对HSV-1的CD86上调也减少，尽管这种激活标记物的破坏程度低于细胞因子分泌(图2C). 值得注意的是，IPC对流感病毒（PR8株）的反应在TLR9–/–小鼠中完好无损，表明IPC对流行性感冒病毒的识别是TLR9独立的。野生型DC分泌一些IL-12，但不分泌IFN-α，而TLR9–/–DC对HSV-1完全没有反应。为了进一步证实TLR9介导IPC对HSV-1的应答，我们在有或无TLR9竞争性抑制剂ODN 2088的情况下，用HSV-1体外培养野生型骨髓衍生IPC。⁴⁰ 如所示图3，ODN 2088以剂量依赖的方式抑制野生型IPC分泌IFN-α和IL-12以及CD86的上调。ODN 2088对IPC对流感病毒的反应几乎没有影响，这表明ODN 2089选择性地抑制TLR9介导的反应，进一步证实识别流感病毒是TLR9独立的。我们得出结论，IPC对HSV-1的反应严重依赖于TLR9。最后，我们测试了IPC通过TLR9/MyD88对HSV-1的应答是否需要主动病毒复制。用紫外线照射HSV-1以防止病毒复制，而不会使包膜糖蛋白变性。紫外线激活的HSV-1在诱导骨髓衍生IPC产生IFN-α和IL-12方面与未经治疗的病毒一样有效(图4)和从CD11c中分类的IPC⁺脾细胞（未显示）。因此，体外IPC对HSV-1的反应发生在没有病毒复制的情况下。

最后，我们研究了MyD88和TLR9介导的应答对HSV-1体内复制的影响。为了监测活体动物中HSV-1的复制，我们用表达萤火虫荧光素酶报告蛋白的KOS/Dlux/oriL HSV-1菌株感染小鼠，从而通过生物发光成像可视化HSV-1复制。³⁵ 脚垫注射后，在6至7天内，每隔24小时用电荷耦合设备摄像头监测MyD88–/–小鼠、TLR9–/–鼠和对照小鼠HSV-1复制。在所有小鼠中，仅在感染部位检测到HSV-1复制(图5A-D). 复制持续到感染后第4天或第5天左右，然后逐渐下降(图5E-F). 测量感染部位的光子通量显示，与野生型小鼠相比，MyD88–/–小鼠中HSV-1的复制略多(图5A-B、E). 然而，TLR9–/–和野生型小鼠之间没有发现显著差异(图5C-D、F). 在MyD88–/或TLR9–/小鼠中未检测到HSV-1的全身传播、瘫痪迹象或死亡。可以认为，生物发光成像不够敏感，无法检测野生型和TLR9/MyD88缺陷小鼠之间HSV-1复制的微小差异，或者与未改变的KOS HSV-1相比，KOS/Dlux/oriL HSV-1可能略有减弱。为了解决这一可能性，通过角膜划痕法将野生型和MyD88–/–小鼠感染KOS HSV-1，并通过标准斑块试验测定眼球拭子和均质三叉神经节中的病毒滴度。如所示图5与野生型小鼠相比，MyD88–/–小鼠的G和H组HSV-1复制没有增加。我们得出结论，TLR9/MyD88诱导的依赖性机制可以有效地补偿针对局部HSV-1感染的体内免疫反应中TLR9或MyD88的缺失。

在本研究中，我们研究了HSV-1激活IPC的机制。我们的研究结果表明，HSV-1在体外主要通过TLR9/MyD88途径激活IPC。与此结论一致，TLR9-和MyD88缺陷IPC严重损害了对HSV-1的反应，包括显著减少IFN-α和IL-12的分泌，并显著降低细胞活化。此外，用抑制性CpG-ODN阻断野生型IPC中的TLR9具有类似的结果。TLR9如何识别HSV-1？与未经处理的HSV-1一样，紫外线激活的HSV-1刺激IPC反应，这表明HSV-1复制不是有效刺激TLR9/MyD88所必需的。因为TLR9位于细胞内的内胚小室中，⁴¹ HSV-1最初可能与包膜糖蛋白特异的细胞表面受体相互作用。包裹的HSV-1内化后，病毒DNA可能在内胚体室中释放，以与TLR9相互作用。因此，IPC成为了一种独特的哨兵细胞，能够感应和应对HSV-1，而不会产生有效感染。这一结论与最近IPC通过TLR9识别HSV-2的证明一致⁴² 紫外线激活的HSV-2和HSV-2 DNA足以激活IPC，而内体溶酶体处理的药物抑制剂阻止激活。⁴² 这些研究共同表明，其他DNA病毒可能通过相同的途径激活IPC。值得注意的是，我们的研究还表明，IPC是针对HSV-1的IL-12的主要产生者。IPC和经典DC亚群的IL-12分泌也依赖于TLR9/MyD88信号，这与之前的报告一致，即TLR9在所有小鼠DC亚群中表达。^30,31 目前尚不清楚为什么HSV-1在刺激IPC的IFN-α应答方面比DC更有效。HSV-1可抑制DC成熟，正如在感染HSV-1的人类DC中观察到的那样，⁴³ 或者它可能选择性地阻断DC中的TLR9/MyD88通路，正如之前报道的由RNA（PKR）通路调节的RNaseL和蛋白激酶，后者也介导宿主对HSV-1的耐药性。^37,44 

尽管MyD88和TLR9缺陷对体外IPC分泌IFN-α和IL-12有显著影响，但与使用生物发光KOS/Dlux/oriL HSV-1菌株的野生型小鼠相比，我们在MyD88-/-和TLR9-/-小鼠中未检测到HSV-1复制的显著增加。同样，根据标准斑块分析评估，角膜感染后KOS HSV-1在MyD88–/–小鼠中的复制并不比野生型小鼠大。此外，在MyD88-或TLR9-缺陷小鼠中，即使脚垫注射5×10，也未观察到HSV-1的神经症状或全身传播⁷KOS HSV-1的PFU（数据未显示）。因此，在我们的局部感染模型中，MyD88和TLR9缺陷对宿主控制HSV-1复制的能力影响有限或没有影响。

总之，我们的研究表明，除IPCs外，其他细胞的TLR9/MyD88依赖性反应可以在很大程度上弥补局部HSV-1感染中IPCs缺乏TLR9/MyD88的依赖性反应。浸润HSV-1感染皮肤和粘膜的上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞或其他免疫细胞可通过TLR9/MyD88诱导的依赖性途径有效识别和应对HSV-1。这些途径可能由甘露糖受体启动，⁹ 趋化因子受体，⁸ 或疱疹病毒进入介质，激活核因子κB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1）转录因子。^45,46 HSV-1的细胞内复制也可能产生双链RNA产物，激活dsRNA依赖的PKR，⁴⁷ 导致IRF3的激活和IFN 1型的表达。⁴⁸ 最后，HSV-1可以激活最近发现的TLR3或TLR4下游的TRIF通路，诱导IFN-β分泌足以控制病毒复制。^49,50 IPC和TLR9/MyD88通路可能与IFN-α对病毒的反应有关，这些病毒会进入血液并在体内引起全身感染。

我们感谢Akiko Iwasaki（耶鲁大学）分享了未发表的结果，Arthur M.Krieg（马萨诸塞州韦尔斯利的Coley Pharmaceutical Group）提供了TLR9–/–小鼠，Kathy Frederick和Emil R.Unanue（华盛顿大学）提供了MyD88–/–小鼠，William Eades（Siteman癌症中心流式细胞术设施）提供了专家细胞分选，Marina Cella和Susan Gilfillan（华盛顿大学）提供建议和有益的讨论。