细胞外基质的机械刚性调节胶质瘤细胞的结构、运动和增殖

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度恶性的星形细胞瘤，即使在手术、化疗和放射治疗的情况下，其中位生存期也为15个月(1). 这种罕见的侵袭性部分来自于诊断前单个肿瘤细胞向周围脑实质的弥漫性浸润，使得完全清除肿瘤几乎不可能。中心治疗目标是制定限制侵袭的策略，从而使肿瘤能够通过局部治疗进行治疗。这导致了一项广泛的工作，以确定GBM肿瘤细胞运动的关键分子调节因子在体外和体内(1–4).

细胞运动的关键调节因子包括细胞外基质（ECM）和识别和处理ECM衍生线索所需的细胞成分，包括粘附蛋白和分子马达。几个在体外研究表明纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和其他ECM蛋白在刺激GBM细胞系和活检组织中的迁移表型中的重要性(5). 基质金属蛋白酶（MMP）激活、GBM侵袭和不良预后之间的密切关系表明，肿瘤细胞在侵袭过程中可以广泛重塑周围基质(1). 这种重塑通常伴随着ECM蛋白的分泌，如tenascin-C，它与血管生成和细胞运动增强有关(6). 由于这些行为是肿瘤进展的核心，越来越多的工作已经开始解决细胞与ECM相互作用的关键介质的功能贡献，包括整合素(7)，焦点粘附蛋白，如维酮和焦点粘附激酶（FAK；参考文献。8, 9)和分子马达，如非肌肉肌球蛋白II（NMMII；参考。2). 最近的癌症基因组图谱（TCGA）测序工作显示，表皮生长因子受体（EGFR）/Ras/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路在GBM肿瘤的基因组损伤中占优势，这些相互作用具有新的意义(10)之前，在胶质瘤侵袭的背景下，它在多个层面上与基于ECM的信号联系在一起(11).

然而，虽然很明显ECM的生化信号是GBM入侵的重要调节器，但对这种串扰的生物物理成分的了解相对较少，特别是考虑到最近爆发的研究表明生物物理输入的强大影响，例如密度、刚度、，ECM的几何形状对细胞命运、迁移和形态发生的影响(12, 13). 例如，最近的研究表明，在二维细胞培养系统中操纵基质弹性可以强烈影响原始人类间充质干细胞的谱系规格(14)平滑肌细胞的迁移、粘附和细胞构筑(15)以及混合皮层培养中神经元相对于胶质细胞的生长(16). 越来越多的文献表明，细胞和周围ECM的生物力学特性直接影响并受肿瘤疾病进展的影响(17, 18). 例如，在在体外乳腺上皮细胞的培养足以使其他正常细胞形成生长肿瘤的早期特征(19). 在侵袭方面，ECM刚性可以在三维ECM中控制人前列腺癌细胞的运动(20)以及肿瘤细胞侵入足的密度和活性，它们在空间上集中于蛋白水解分泌(21). 有希望的新的化疗药物已经开始以收缩和粘附机制的成分为靶点，包括整合素拮抗剂西棱尼特(7)FAK的小分子抑制剂(8).

一些证据间接表明，ECM衍生的生物力学线索可能在GBM中发挥重要作用，尽管这些线索的病理生理意义尚不清楚。神经外科医生轶事般地报告说，GBM肿瘤比周围的软组织更坚硬，这与超声弹性成像在指导手术切除方面的功效是一致的(22). 此外，大脑僵硬的巨大解剖变异(23)可能在侵袭中表现突出；例如，GBM细胞的浸润路径倾向于有利于不同机械结构之间的界面，例如血管基底膜和白质束(24). 最近的研究表明，细胞微环境的机械特性可能从根本上改变胶质母细胞瘤细胞的迁移在体外和体内(2, 25, 26). 例如，在弹性薄膜上培养的SNB19细胞的迁移率与基底的机械性能有关（通过改变加热时间和与本生灯的距离来控制；参考文献。25)，一些三维研究表明基质密度与肿瘤球体的侵袭性之间有很强的相关性(26, 27). 胶质瘤细胞的迁移依赖于肌动蛋白产生的收缩力，并涉及细胞骨架和细胞基质黏附复合体的动态、空间调节变化。许多这些运动介导的相互作用是由ECM机制形成的，并且包括RhoA和RhoB在内的几种收缩介导信号分子的表达水平被认为与肿瘤恶性程度相关(28, 29). 事实上，Rosenfeld及其同事最近表明，NMMII需要使胶质瘤细胞的细胞核变形，从而使变形虫通过ECM孔运动并侵入肿瘤细胞体内相对于内源性脑细胞，NMMII表达显著上调(2).

由于越来越多的证据表明人脑胶质瘤中存在机械生物学线索，关于ECM弹性的潜在病理生理作用的现有信息有限，以及这一知识对创建机械生物学激励疗法的重大影响，我们试图验证ECM的微机械信号影响GBM肿瘤细胞与生长和侵袭相关的基本特性的假设。我们制造了ECM基板，其具有独立定义的机械和生化特性，刚性跨越正常组织和肿瘤组织之间的范围。我们的研究首次揭示，ECM弹性强烈影响GBM细胞结构、运动和增殖，并且这种机械感觉需要一个活性肌动蛋白细胞骨架、基于Rho-GTPase的信号和NMMII。

ECM底物的合成和表征。我们遵循了先前建立的制造规定硬度聚丙烯酰胺ECM的方法(15, 30)稍作修改（见补充材料和方法）。用人血浆纤维连接蛋白（Millipore Corp.）对所有底物进行功能化，以达到2.6μg/cm的标称表面密度²。使用Anton Paar Physica MCR 301流变仪和25 mm平行板几何形状，在37°C下测量每个凝胶配方的宏观弹性剪切模量。振幅扫描范围γ=0.1-10%用于确定线性状态；然后使用5%应变下超过0.1到10 Hz的频率扫描来提取每个样品的存储、损耗和复模量。对每个样品进行三次测量，每个条件下至少测量三个独立样品。含有最终丙烯酰胺的凝胶的弹性模量分别为0.08、0.25、0.8、19和119kPa/第二类-丙烯酰胺（A/B）百分比分别为3%A/0.05%B、4%A/0.075%B、5%A/0.1%B、8%A/0.6%B和15%A/1.2%B，如其他地方所述。^三

细胞培养。U373-MG人脑胶质瘤细胞来自加州大学伯克利分校组织培养设施，U87-MG和U251-MG人胶质瘤细胞由C.David James博士（加州大学旧金山分校）提供，人SNB19和大鼠C6胶质瘤细胞则由。Andrew Wurmser（加州大学伯克利分校）。U373-MG和U87-MG细胞在补充了10%小牛血清优势（J.R.Scientific）和1%青霉素/链霉素、MEM非必需氨基酸和丙酮酸钠（Life Technologies）的DMEM（生命技术）中培养。在添加10%小牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养SNB19、U251-MG和C6细胞。

显微镜、荧光染色和形态分析。使用倒置的尼康TE2000-E2显微镜进行全活细胞和荧光成像，该显微镜配备有一个电动可编程平台（Prior Scientific，Inc.），一个恒温箱，用于保持恒温、恒湿和一氧化碳₂水平(体内Scientific）、数码相机（Photometrics Coolsnap HQ II、Roper Scientistic）和SimplePCI软件（滨松公司）。如补充材料和方法中所述，固定细胞并对其进行丝状肌动蛋白（F-actin）和管状蛋白染色。通过使用Image J软件（NIH）量化指骨样蛋白染色细胞的面积，获得细胞扩散测量值。通过聚丙烯酰胺凝胶获得的高放大外荧光图像图1和5通过对整个图像应用均匀的背景减法来增强；随后根据需要调整亮度和对比度。

细胞迁移的测量和分析。细胞以1000个细胞/cm的亚融合密度进行培养²至少在开始成像前10小时进行三次独立实验。在每个实验中，在12小时内每15分钟采集一次10×相位对比度时间差图像，每个衬底至少有10个代表性视野，每个条件至少有两个衬底。使用SimplePCI软件分析时间推移视频的代表子集，其中每个帧中每个单元的外围用于定义对象，SimplePC1的运动跟踪和分析模块用于跟踪整个时间序列中每个对象的质心。

细胞增殖的测量。如补充材料和方法中所述，使用溴脱氧尿苷（BrdUrd）测定法测量细胞增殖。

抑制细胞收缩。允许细胞粘附至少10小时后，在相关的时间间隔和免疫荧光实验中，将Rho-相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632（钙生物化学）、NMMII抑制剂blebbistatin（Sigma-Aldrich）和肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D（Sigma-Aldrich）添加到细胞培养基中。

统计分析。除非另有说明，否则数据报告为平均值±SE。三组或三组以上数据之间的统计比较采用单因素方差分析，然后采用Tukey-Kramer-HSD（诚实的显著差异）检验进行配对比较。一个学生的未婚t吨如果在两组数据之间进行统计比较，则进行测试。P（P）<0.01表示有统计学意义。

为了验证ECM硬度影响培养的胶质瘤细胞行为的假设，我们制备了一系列具有可变硬度的纤维连接蛋白涂层聚丙烯酰胺ECM，正如我们和其他人之前所做的那样(15, 30, 31). 这里，ECM刚度由单体（丙烯酰胺）与交联剂的比率决定(第二类-丙烯酰胺），纤维连接蛋白以固定密度共价接枝到凝胶表面。由于聚丙烯酰胺不支持明显的被动蛋白质吸附，该系统能够独立控制ECM硬度和配体密度。我们的ECM硬度从低于正常脑组织一个数量级（0.08 kPa）到高于正常脑组织（119 kPa）三个数量级不等。

ECM硬度改变胶质瘤细胞形态和细胞骨架组织。我们首先询问ECM硬度的变化是否足以彻底和系统地改变胶质瘤细胞形态和细胞骨架组织。为了回答这个问题，我们在具有不同硬度的ECM上培养细胞，并捕获细胞-ECM粘附区域和细胞骨架F-actin组织。随着基底刚度的降低，U373-MG电池的粘附接触面积急剧下降(图1)，这一发现对U87-MG、U251-MG、SNB19和C6细胞具有定性重复性（补充图S1）。U87-MG型(图1B和C)在刚性基质上培养的U373-MG（补充图S2）细胞通常分布良好，有可见的肌动蛋白应力纤维和离散的细长管状蛋白阳性的局灶性粘连。重要的是，在玻璃和最硬的聚丙烯酰胺基质上培养的细胞在这方面是相似的，这表明结合化学不会显著干扰基于粘附的细胞骨架组装。在逐渐变软的基底上培养的细胞显示扩张面积减少，同时应力纤维和局部粘连的刚性依赖性消散。最柔软基底上的细胞均匀圆形，具有F-actin皮质环和小的点状vinculin阳性局灶复合物。有趣的是，核抗原Ki67阳性染色证明，最软底物上的细胞圆形并没有反映凋亡(图1A).

ECM刚性调节胶质瘤细胞的随机运动。鉴于生产性细胞运动对入侵至关重要，我们接下来询问ECM刚性的改变是否会改变培养物中的迁移速度(图2). 为了解决这个问题，我们使用延时成像来记录稀疏培养的细胞在12小时内的随机运动。U373-MG和U87-MG细胞的平均迁移速度随着基底硬度的降低而急剧下降，在最坚硬的基底和玻璃上观察到的速度在统计学上无法区分(图2A和B; 补充电影S1–S4）。与聚丙烯酰胺基质相邻的玻璃表面上的细胞表现出与纤维连接蛋白涂层玻璃基质（未显示）上的细胞相似的形态和性质，有效地排除了运动中刚性依赖性变化与旁分泌信号改变相关的可能性。

在细胞速度降低的同时，我们观察到细胞运动模式的逐渐转变(图2C; 补充电影S5–S8）。玻璃上的细胞以平滑、滑翔的方式移动，前缘有宽阔的足爪和持续的肌动蛋白周转。随着ECM刚度的降低，这种运动开始转变为“粘滑”模式，在这种模式下，细胞会随着前缘的推进而变薄并延伸，后缘突然分离并向前猛拉以赶上细胞体。玻璃和119 kPa ECM上的细胞迁移时有广泛的跛足，而0.8 kPa ECM的细胞跛足较小且不太稳定。最符合要求的ECM（0.08 kPa）上的细胞在6到12小时内积极延长小而薄的丝足过程，但未能建立能够支持迁移的跛足。

尽管所有细胞系的迁移对ECM硬度高度敏感，但我们观察到细胞类型之间的差异。具体地说，在刚性基底上，U373-MG、SNB19和U251-MG细胞通常表现出显著的宽阔、皱褶状跛足和多边形形态，而U87-MG和C6细胞表现出相对较长的纺锤形形态（补充图S1），如其他人所报告的那样(32, 33). 然而，当在最顺应的底物（0.08 kPa）上培养时，所有细胞株都退化为彼此无法区分的圆形形态，大部分为非生产性丝状突起。

ECM刚性调节胶质瘤细胞增殖。上述结果表明，细胞外基质刚性能显著调节培养的胶质瘤细胞的结构和运动。考虑到形状和运动的改变以前与肿瘤生长的改变有关(34)，我们推断ECM刚性可能同时改变细胞增殖。我们首先观察到，在长期培养中，硬底物上的细胞比软底物上细胞更快地汇合，汇合程度不能完全归因于细胞扩散面积的差异（未显示）。为了更严格地测试这种联系，我们使用BrdUrd合并来测量分裂细胞的百分比作为ECM硬度的函数(图3). 这些研究揭示了U373-MG和U87-MG细胞的增殖率与ECM硬度之间的显著相关性，与最软基质（0.08 kPa）上的细胞相比，最硬基质（119 kPa）上BrdUrd-阳性细胞的百分比增加了约5倍。与我们之前对细胞结构和运动的测量结果一致，在最坚硬的基底上掺入BrdUrd与玻璃相当。

细胞内张力的药理学破坏缓和了胶质瘤细胞形态、细胞骨架结构和迁移的机械调节。ECM硬度增加与细胞扩散增加和肌动球蛋白应力纤维束形成有关(图1)表明ECM刚性控制NMMII介导的细胞内收缩性。这种关系已在其他系统中直接观察到(14, 35)并导致了一种假设，即NMMII及其上游调节器对处理刚性编码线索至关重要。为了在我们的系统中验证这一假设，我们询问当肌动蛋白细胞骨架组装和收缩性受到破坏时，胶质瘤细胞是否对ECM刚性保持敏感。NMMII或ROCK的直接药物抑制减弱了U87-MG的敏感性(图4A)和U373-MG（补充图S3；补充电影S9–S12）细胞形态至ECM硬度，所有情况下细胞均呈星状形态。值得注意的是，抑制NMMII或ROCK对最软的ECM的作用不仅可以增强粘附，还可以挽救细胞运动，使细胞在药物添加后几分钟内扩散并恢复迁移(图4B). 对于所有ECM，ROCK抑制和NMMII抑制细胞缺乏显著的应力纤维和管状蛋白阳性的局灶性粘附(图5). 为了证实这种对细胞运动的拯救需要肌动蛋白聚合，我们用细胞松弛素D处理细胞，它能破坏F-肌动蛋白并抑制新的聚合。事实上，用细胞松弛素D治疗会导致细胞骨架崩溃和在硬基质上失去运动能力，但未能在最软基质上诱导扩散或挽救迁移(图4和5).

尽管神经胶质瘤生长和侵袭的机制研究历来集中在生物化学和遗传因素上，但对其他细胞类型的研究表明，生物力学线索也可以有力地调节细胞行为。在这里，我们已经开始探索基于ECM的机械线索在控制GBM病理生理学中心的细胞行为中的作用。我们的研究首次揭示了胶质瘤细胞结构、迁移和增殖中与硬度相关的显著差异。鉴于与正常和肿瘤脑组织相关的机械微环境的对比，这种机械调节尤其重要。重要的是，我们能够通过抑制NMMII依赖性收缩力来缓和细胞结构和迁移中与硬度相关的差异，这表明肿瘤微环境的机械特征以及感知和处理这些特征的分子系统可以作为理解和操纵神经胶质瘤细胞生理学的手柄。

在观察到成纤维细胞的定向迁移后，Wang及其同事首次定义了杜罗塔（或机械性）现象在体外从ECM的软区域到硬区域(36); 其他研究人员观察到，细胞外基质硬度的变化可以增加或减少细胞迁移速度，这种关系在很大程度上取决于细胞类型、粘附程度和其他因素(15, 25). 高ECM硬度增强收缩性介导蛋白的表达和活性，如Rho和ROCK(19)，这与许多实体肿瘤中收缩蛋白的增强表达直接相关(37). 对于GBM，Rho GTPases在介导肿瘤生长和扩散中的作用体内复杂且仍不完全理解(28, 29). 然而，溶血磷脂酸介导的NMMII激活能强烈刺激星形细胞瘤的运动在体外(三)Rho/ROCK抑制使胶质瘤细胞对辐射诱导的凋亡敏感(38)和化疗(39). 我们观察到刚度依赖性增强细胞骨架和局部粘附结构、细胞扩散和迁移的稳定性(图1和2)与动态机械相互作用的主要模型一致，在这种模型中，细胞通过“内-外”信号对刚性编码的线索作出反应，包括增强收缩和粘附结构(13). 收缩性介导蛋白在胶质瘤细胞中的表达如何随着底物硬度的变化而变化是一个尚未解决的有趣问题。

NMMII或其上游调节物ROCK的药理抑制减弱了胶质瘤细胞对ECM刚性的敏感性，细胞采用星状形态，即使在顺从的ECM上也变得高度能动(图4和5; 补充电影S9–S12）。总之，这些结果表明NMMII及其激活物构成了胶质瘤细胞ECM刚性敏感通路的关键组成部分，这与以往在其他细胞类型中的观察结果一致(14, 15, 19, 36). 这些结果也与最近发现的NMMII亚型（NMMIIA、NMMIIB和NMMIIC）对细胞运动、牵引力生成和刚度传感的贡献一致。具体而言，NMMIIB-全成纤维细胞通过伸展和收缩突起迅速改变细胞形状；与我们在NMMII抑制下观察到的胶质瘤细胞类似，这些成纤维细胞迁移速度更快，并且比野生型成纤维细胞对ECM刚性的形态学敏感性更低(40). 此外，小鼠胚胎成纤维细胞中NMMIIA的急性耗竭加快了细胞扩散并减缓了肌动蛋白的逆行流动，这表明NMMIIA通过全面延缓肌动蛋白细胞骨架重塑而起到了阻止细胞扩散的作用(41). 最近的观察表明，神经胶质瘤细胞的运动可以通过抑制NMMII来刺激(42)或ROCK(4); 后者的作用可能被Rac GTPase的伴随抑制所阻断，这意味着运动增强是由于Rac途径去抑制所致。重要的是，Rho和Rac激活之间的平衡也可能通过药物抑制Ras间接干扰胶质瘤细胞(43)这在基于Rho-GTPase的机械感觉和EGFR/Ras/PI3K通路之间提供了一种意想不到但潜在重要的机械联系。因此，在我们的研究中，ROCK抑制可能具有双重作用，即释放基于NMMII的细胞扩散限制和增强Rac介导的细胞运动，这解释了为什么ROCK抑制剂比直接抑制NMMII更有效地拯救顺应性底物上的运动。

最后，我们观察到ECM刚性强烈调节胶质瘤细胞的增殖，最硬的ECM支持的增殖是最软的ECM的5倍(图3). 虽然这种效应的大小有些令人惊讶，但已经观察到ECM刚性可以调节其他系统中的细胞生长，包括成纤维细胞(44)，肝细胞(45)和神经干细胞(46). 一种可能的解释是，ECM刚性的变化可能通过改变有丝分裂过程中的机械化学反馈来改变细胞周期的进展速度。事实上，直接应用机械力可以减缓胞质分裂并诱导形状不对称，细胞可以通过动员NMMII产生恢复力来积极纠正这种不对称(47). 其次，ECM刚性可能通过协同触发机械传导和有丝分裂信号通路来调节有丝分裂。如前所述，ECM刚性可以将培养的乳腺上皮细胞从良性、高分化表型转化为发育不良和增殖表型(19). 这种基质驱动的转化伴随着细胞外信号调节激酶（ERK）、Rho GTPase和NMMII-based收缩性的激活，通过过表达组成活性Rho或自发聚集整合素来重建，并通过抑制ROCK或ERK来逆转。重要的是，其中许多途径也与上皮-间质转化有关(48). 所有这些都符合一种范式，即肿瘤细胞及其癌前祖细胞通过增强的整合素聚集感测到基质僵化，进而激活ERK和机械感觉信号，从而使细胞变硬并诱导增殖。顺从基质上有丝分裂通路的抑制也可以解释为什么我们在低运动性的情况下不能观察到高增殖，正如“去或生长”假说所预测的那样(34). 在GBM和其他非上皮性肿瘤中，ECM刚性、细胞力学和EGFR/Ras/ERK信号之间的关系在很大程度上尚不清楚，并且考虑到TCGA组88%的临床GBM肿瘤在EGFR/Rass/PI3K通路中发生突变(10)，这将是一个有趣的问题，如果刚性依赖性增殖伴随着基于EGFR的信号的改变，或者可能被EGFR通路操纵间接调节。

总之，我们已经表明，增加ECM硬度可以在人脑胶质瘤细胞中诱导一系列表型变化，包括细胞扩散增加、运动加快和增殖增强。如前所述，大块脑组织的弹性顺应性为0.5至1 kPa，与本研究中考虑的最顺应性基质类似。尽管我们尚不清楚GBM肿瘤组织机械硬度的系统性和确定性测量，但术中超声清楚地显示肿瘤及其周围基质比正常脑实质更坚硬。将其置于侵袭性胶质瘤细胞积极重塑其微环境，从脑样变为肿瘤样的概念背景下(1)这提出了一个有趣的假设，即GBM肿瘤细胞在侵袭时会使周围环境变硬。我们设想这种重塑可能通过现有基质成分的蛋白水解降解和基质成分的分泌而发生从头开始最近在侵袭乳腺癌细胞中观察到的应变增强和收缩依赖性捆绑的诱导，以及ECM纤维的排列(49, 50). 由此产生的微环境硬化可能会向肿瘤细胞传递相互作用的机械生物学信号，这些信号通过整合素、局部粘附蛋白、Rho-GTPases和细胞骨架发挥作用，以促进形状可塑性、运动性和增殖。如果是这种情况，那么干预机械传导信号或机械重塑的治疗干预措施在减缓或阻止GBM侵袭方面可能具有价值，类似于使用整合素和FAK抑制剂(7, 8). 尽管具有挑战性，但在三维ECM或体内能够精确追踪侵袭期间细胞介导的机械重塑的平台应该能够更直接地评估这一假设。

没有披露潜在的利益冲突。

拨款支持：加州大学伯克利分校研究生部、国家科学基金会、国防科学与工程研究生奖学金（T.A.Ulrich）、加州大学伯克莱分校癌症研究协调委员会、阿诺德和梅贝尔·贝克曼青年研究员奖，和NIH董事新创新者奖1DP2OD004213，这是NIH医学研究路线图（s.Kumar）的一部分。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，必须在此标记此物品广告根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。

我们感谢A.Wurmser博士和C.D.James博士对细胞系的有益讨论和提供，感谢D.D'Sa博士对流变学的技术帮助，感谢J.Dabritz（Anton Paar）和D.Leong博士（技术仪器）对设备和软件的帮助。