EphA2再表达促进黑色素瘤细胞从间充质向变形体样运动方式的侵袭

了解癌细胞转移扩散的分子机制对于设计旨在防止远处器官生长的新策略及其对患者的影响至关重要。导致转移的早期步骤取决于肿瘤细胞的侵袭性（例如，肿瘤细胞侵袭周围组织、跨越解剖屏障以及通过血流或淋巴系统扩散的能力；参考文献。1). 几个在体外和体内研究侵袭机制的系统表明，肿瘤细胞通过多种机制通过细胞外基质（ECM）和基底膜成分迁移。在这些机制中，特别考虑了蛋白酶（如金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶（纤溶酶原激活物/纤溶酶系统））对基质的降解(2). 蛋白水解酶聚焦于肿瘤细胞表面附近的一系列降解分子事件，为肿瘤细胞的入侵扫清道路(2). 此外，肿瘤细胞的侵袭性可能包括细胞极性的丧失、细胞-细胞和细胞-基质粘附的改变、对失巢凋亡程序的独立性，以及对生长、粘附和运动因子信号的放松调控(三). 总之，这些变化激发了胚胎发育期间上皮细胞和间充质细胞之间的个体发生通讯，可能支持分离、迁移和器官定植。因此，胚胎关键细胞间通讯或运动因子的重新出现可能会强烈影响癌细胞的行为(1, 4).

最近，一些关键进展挑战了癌细胞运动性的观点，这基本上表明了两个里程碑：(一)基于基因表达的运动表型在癌症发展和(b条)癌细胞可能表现出不同类型的细胞运动，包括间充质、集合和变形虫类型。侵袭性的一个主要特征是转移性癌症能够在运动模式之间转换，避免简单的抗癌治疗，这对于制定旨在阻止癌细胞扩散的策略来说是一个重大挑战(1, 3, 5). 间充质运动的特点是细胞形态呈拉长和极化；它依赖于运动细胞的ECM蛋白水解，通过基质金属蛋白酶（MMP）的产生产生一条“路径”。这导致细胞前沿Rac1的激活，并抑制RhoA GTPase(5). 变形虫运动是细胞迁移的一种原始形式，它使细胞能够通过减弱的细胞-ECM附着物滑过ECM屏障，而不是降解ECM屏障。与间充质运动相反，通过变形虫模式运动的细胞显示出Rac1抑制和RhoA强烈激活(5). 在纤维肉瘤细胞中，整合素或MMP功能的抑制导致从间充质转移到变形虫样迁移程序，从而通过替代机制挽救运动能力(6, 7). 尽管蛋白酶抑制剂或整合素拮抗剂引起的间充质-动力体转化（MAT）被认为是侵袭性细胞传播中的一个关键事件，但调控这种转化的因素的确定仍处于初级阶段。

Eph激酶在胚胎发育中的作用已被广泛研究，它们在血管生成过程中为神经元生长锥、神经元嵴细胞以及内皮细胞传递关键的方向信号(8, 9). 新的证据也表明Eph家族蛋白与癌症进展有关(8–11). 特别是，除了乳腺癌和前列腺癌，EphA2激酶在一些高度侵袭性黑色素瘤中被发现过表达，而在正常黑色素细胞中没有检测到(10–12). 此外，转移细胞中EphA2的表达水平显著高于原发性黑色素瘤细胞(11, 13). 然而，EphA2与肿瘤进展的密切关系，即EphA2在侵袭性肿瘤中的真正功能，尚不清楚。一个悬而未决的问题是，这种分子在致癌过程中的意义是否真的与其运动因子的性质有关。

本研究旨在探讨EphA2在肿瘤细胞侵袭性中的作用，尤其是其作为运动因子的参与。我们实验室先前的研究结果表明，在低转移性F10-M3黑色素瘤细胞中，促炎细胞因子IFN-γ通过上调MMPs和尿激酶纤溶酶原激活剂系统来增加其间充质型侵袭性(14, 15). F10-M3黑色素瘤细胞是一种合适的肿瘤细胞模型，用于研究EphA2在癌细胞侵袭中的作用，因为发现即使在炎症细胞因子刺激后，它们也不表达EphA2激酶。本文提供的数据表明，EphA2在黑色素瘤细胞中的再表达增加了它们通过Matrigel迁移以及通过MMP-independent/RhoA-dependent阿米巴样策略定植宿主器官的能力。

材料。除非另有规定，否则所有试剂均来自Sigma。抗磷酪氨酸（克隆4G10）和抗EphA2抗体来自Upstate Biotechnology，Inc。；抗RhoA、抗焦黏附激酶（FAK）、Rac1抗体和I型胶原来自Becton Dickinson；抗磷-Y576/Y577-FAK来自Santa Cruz Biotechnology。肿瘤坏死因子α（TNFα）来自PeproTech。Ilomastat和Y27632来自Calbiochem。细胞可渗透C3来自细胞骨架。DQ胶原蛋白I荧光素结合物和钙黄绿素AM来自分子探针。

质粒和蛋白质过度表达。EphA2编码序列，亚克隆到pTargetT载体（Promega）中，如参考。16使用4μg质粒DNA，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬时转染。进行增强型绿色荧光蛋白（EGFP）共转染（比例为1:10）。EphA2阳性细胞或EGFP阳性细胞的细胞荧光分析显示，85%以上的细胞转染阳性。转染后48小时，回收细胞进行分析。对于使用可溶性肾上腺素A1的研究，对数生长期的细胞总是用1μg mL刺激⁻¹Fc或ephrinA1-Fc用于指定时间。显性-阴性RhoA（dnRhoA-N19）是K.Defea（加州大学河滨分校生物医学科学部）的一份礼物。

细胞系和培养条件。在本研究中，我们使用B16（F10-M3）小鼠黑色素瘤细胞的低转移克隆F10-M3(17). 细胞在37°C、10%CO、添加10%FCS的DMEM中培养₂增湿的大气。通过在添加不同剂量TNFα（25–100 ng/mL）的培养基中培养肿瘤细胞24小时，获得经促炎细胞因子处理的小鼠黑色素瘤细胞。对于使用可溶性ephrinA1的研究，用1μg mL刺激细胞⁻¹Fc或肾上腺素A1-Fc。

免疫沉淀和蛋白质印迹分析。电池（1×10⁶)在500μL完整放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、150 mmol/L-NaCl、1%NP40、2 mmol/L-EGTA、1 mmol/L-原钒酸钠、1 mmol/L苯甲基磺酰基氟化物、10μg/mL抑肽酶、10μg/mL亮氨酸蛋白酶]中在冰上裂解20分钟。通过离心澄清裂解液，并用1至2μg特异性抗体在4℃下免疫沉淀4 h。将免疫复合物收集在蛋白A-Sepharose上，通过SDS-PAGE分离，并转移到硝化纤维素上。免疫印迹在3%牛血清白蛋白、10mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、1mmol/L EDTA和0.1%吐温20中在室温下孵育1h，首先用特异性抗体检测，然后用二级抗体检测。对于化学发光检测，我们使用了Gel Logic 2002 Kodak成像系统，该系统配备了一个电荷耦合设备摄像头，确保了高线性，并使用Quantity One软件（Bio-Read）进行定量分析。

腹膜内定植。用胰酶消化法获取F10-M3黑色素瘤细胞，在PBS中洗涤两次，然后悬浮在1×10无血清培养基中⁶/毫升。将悬浮液（0.2mL）注射到同基因C57Bl/6小鼠（Charles River）的腹膜腔内。对动物进行监测，14天后处死动物。借助解剖显微镜检查注射动物的腹膜腔，并称重与淋巴系统相关的肿瘤恢复量。

肺部定植。用胰蛋白酶-EDTA溶液从培养皿中采集F10-M3黑色素瘤细胞。细胞在PBS中清洗两次，然后悬浮在1×10无血清培养基中⁶/毫升。将悬浮液（0.2 mL）注入同系C57Bl/6小鼠的尾静脉。对动物进行监测，21天后处死动物。借助解剖显微镜检查肺部并计数肺结节。

伤口愈合试验。细胞在6厘米的培养板中培养，直至汇合。使用精细的无菌移液管尖端刮除F10-M3细胞的单层。使用配备尼康数码相机的倒置徕卡显微镜，在添加2%血清之前和24小时后拍摄照片。用光学显微镜观察伤口闭合24小时后，使用数码相机（Nikon Coolpix 900）对伤口区域进行成像，以使用ImageJ软件计算伤口闭合百分比，每个时间点的伤口闭合百分比通过以下公式得出：[1−（当前伤口大小/初始伤口大小）] × 100.

博伊登在体外入侵检测。使用Costar的Transwell系统，配备8μm孔径的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯过滤器。将细胞装入上部隔间（5×10⁵500μL）在无血清培养基中。多孔聚碳酸酯过滤器的上侧涂有50μg/cm的涂层²将重组Matrigel基底膜置于含有1 mL完整生长培养基的六孔培养皿中。在37°C下培养24小时后，用棉签机械去除非侵入细胞，并用Diff-Quick溶液对微孔膜进行染色。通过计数迁移到聚碳酸酯过滤器下表面的细胞来评估趋化性（六个随机选择的区域，平均值±SD）。对于EphA2转染的细胞，总是以85%以上的效率与EGFP共转染，迁移的细胞已归一化为EGFP表达细胞。

三维胶原基质中的细胞迁移。通过延时视频显微镜和共聚焦显微镜对黑色素瘤F10-M3细胞进行重建。根据Friedl及其同事的研究，用EDTA（2 mmol/L）分离转染EphA2突变体的亚流入细胞，清洗，并入三维胶原晶格（1.67 mg/mL；天然真皮牛I型胶原；RD系统），并用延时视频显微镜进行监测(18). 我们使用HT1080细胞作为模型，以清楚地显示蛋白质水解迁移过程中的纤维分解。对于抑制研究，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(7)在聚合之前添加到晶格以及上清液中。蛋白酶抑制剂混合物由伊洛马斯塔特、亮普汀、胃蛋白酶抑制素A、E-64和抑肽酶组成。通过胶原酶消化、碘化丙啶染色和流式细胞术或72小时后的液体培养，在胶原蛋白晶格中释放细胞后，蛋白酶抑制剂混合物不会影响48小时后胶原蛋白中的细胞活力。对于三维延时共焦显微术（Leica-SP5系统），用钙黄绿素AM（1μmol/L）标记晶格内的细胞，以3分钟的时间间隔扫描同步荧光和背散射信号（反射），然后重建。xyzt分析（时间内的三维分析）的时间推移显示了细胞的三维运动。电影是一个时间进程中所有堆栈的二维投影（xy）。通过分析同一时间段内的zx轴运动，排除了细胞的xy二维迁移（补充图S1）。

胶原蛋白降解测定。F10-M3细胞悬浮液与含有2%FITC-标记胶原单体（分子探针）的无标记鼠尾胶原（Becton Dickinson）共聚。迁移时间为40小时，将含有细胞的固相胶原蛋白制成颗粒，而释放到上清液中的FITC则通过荧光光谱法进行分析。通过对无细胞胶原蛋白晶格的胶原酶完全消化，获得100%的值。背景荧光是通过造粒非消化无细胞晶格获得的。

RhoA或Rac1活性测定。黑色素瘤F10-M3细胞在RIPA缓冲液中直接裂解，裂解产物通过离心澄清，RhoA-GTP或Rac-GTP定量。简单地说，将裂解物与10μg罗特金-谷氨酸硫孵育S公司-转移酶（GST）融合蛋白（Upstate）或p21活化激酶-GST融合蛋白，均在4°C下被谷胱甘肽-脑葡萄糖珠吸收1小时。免疫反应性RhoA或Rac1随后通过Western blot分析定量。通过免疫印迹对裂解液进行RhoA或Rac1含量归一化。

基质金属蛋白酶的酶谱分析。F10-M3黑色素瘤细胞用于测定MMP活性。用8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶与0.1%（w/v）A型明胶共聚，对来自肿瘤细胞条件培养基的等分样品进行电泳。电泳后，将凝胶在2.5%（v/v）Triton X-100中清洗30分钟，以去除SDS。然后将明胶基质凝胶培养在50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、200 mmol/L-NaCl和5 mmol/L-CaCl中₂在37°C下持续24小时。培养后，在室温下用0.1%考马斯亮蓝在醋酸、甲醇和蒸馏水中分别以1:2:3的体积比染色60分钟。去沉淀后，将凝胶浸入蒸馏水中，并立即用Quantity One图像分析软件（Bio-Rad）进行扫描。以HT1080人纤维肉瘤细胞的胶溶活性作为分子量的标记物。

转移性F10-M3黑色素瘤细胞：间充质型侵袭。细胞迁移可分为几种运动方式，包括变形虫、间充质或集体迁移。这些分子程序与肌动蛋白细胞骨架的特征结构、整合素和/或基质金属蛋白酶的使用以及Rho和Rac GTPases向细胞骨架发出的信号有关(1, 5, 6, 19, 20). 暴露于I型胶原晶格三维基质中的F10-M3黑色素瘤细胞似乎通过纺锤形间充质和蛋白水解运动对2%的血清作出反应（参见图1A和电影1，共焦反射显微镜入侵检测）。将F10-M3运动细胞暴露于蛋白酶鸡尾酒抑制剂下，可有效阻止其蛋白质降解三维基质的能力，尽管其有效运动性并未被消除。与之前报告的数据保持一致(7)，我们观察到胶原酶分解的抑制导致侵袭性细胞迁移转变为穿过胶原纤维的圆形挤压运动，而没有基质降解(图1B; 电影2）。广谱MMP抑制剂ilomastat也产生类似的作用(图1C; 电影3），表明基质金属蛋白酶对F10-M3运动细胞降解胶原蛋白的主要贡献。这种MMP诱导的依赖性运动方式被称为变形虫迁移，并与几种侵袭性癌症的细胞运动可塑性密切相关(1, 3, 6). 定量三维荧光定量FITC释放试验证实了其对细胞依赖性胶原酶溶解的强烈抑制作用，鉴定了FITC标记的胶原纤维的降解(图1D). 在FITC-胶原蛋白内迁移时，黑色素瘤细胞释放80%的总FITC含量，证实了肉眼观察到的胶原蛋白溶解，而蛋白酶鸡尾酒抑制剂治疗可显著抑制黑色素瘤介导的FITC释放。

MMP依赖性运动的上调导致黑色素瘤细胞的侵袭性增加。促炎性肿瘤微环境已经与MMP依赖性增加的黑色素瘤侵袭性有关(21–23). 为了证实MMPs在黑色素瘤侵袭中的关键作用，我们用TNFα治疗MMPs，并研究MMP的表达和Matrigel侵袭(图2A和B). 结果表明，TNFα强烈增加了原-MMP-9的表达，从而导致黑色素瘤细胞Matrigel侵袭性增加3倍。用ilomastat处理细胞可强烈抑制TNFα诱导的侵袭性增加，证实TNFα诱发的MMPs对黑色素瘤侵袭性的主要贡献(图2B). 因此，基质金属蛋白酶是恶性黑色素瘤的有用工具，TNFα能够增加两者体内肿瘤细胞的淋巴结和肺部定植(图2C和D).

EphA2表达增加黑色素瘤细胞的运动性和侵袭性。肿瘤微环境变化引起的细胞迁移的可塑性是癌细胞的一个特殊特征。已知的驱动癌细胞MAT的机制是整合素ECM相互作用的减弱，使用蛋白酶抑制剂抑制细胞外蛋白水解，或小GTPase-Rho信号的增强(7, 19, 24, 25). EphA2激酶在包括黑色素瘤在内的多种人类癌症中的重新表达与更具侵袭性和转移性的肿瘤表型相关，主要是在侵袭过程中指导细胞运动和定位(10, 11, 16). 此外，EphA2激酶激活导致RhoA的强烈上调，从而导致细胞体收缩，并抑制细胞ECM和细胞-细胞约束(26, 27). 为了研究EphA2表达上调导致黑色素瘤细胞通过将其运动能力从间充质转化为变形虫获得不同侵袭策略的可能性，我们在黑色素瘤中过度表达EphA2。我们首先观察到F10-M3细胞不表达可检测到的内源性EphA2，并且用TNFα治疗不能诱导其表达(图3A). 然而，F10-M3细胞不表达ephrinA1（即EphA2的天然配体；数据未显示），EphA2异位表达导致其配体依赖性激活(图3B)以及通过激活FAK激活EphA2下游信号(图3C). 正如伤口愈合试验所示，EphA2的表达增加了黑色素瘤细胞的二维迁移(图4A). Boyden Matrigel分析显示，EphA2的表达增加了黑色素瘤细胞的三维基质侵袭，这与其对二维运动的影响一致(图4B). 伊洛马斯特治疗在减少EphA2介导的侵袭上调方面几乎无效。明胶酶谱显示，EphA2-表达细胞不会改变其MMP-9的表达。此外，我们排除了EphA2的表达影响膜型MMP-1，这是明胶酶谱无法检测到的（补充图S2）。此外，EphA2的表达并不改变TNFα促进的MMP-9的上调(图4C). 最后，分别通过腹腔或尾静脉注射EphA2-过表达的F10-M3细胞诱导的实验性腹膜或肺转移分析证实了EphA2在黑色素瘤细胞中表达的促转移作用(图4D ，左侧和正确的). 与这些数据一致，EphA2的表达水平与A375和HS29-4T人类黑色素瘤细胞系中MMP的表达呈负相关（补充图S3A类和B类).

EphA2诱导金属蛋白酶依赖性运动向变形虫类型转变。为了描述黑色素瘤细胞中EphA2表达诱导的运动刺激，我们分析了两种公认的细胞骨架调节因子的激活，即小GTPases RhoA和Rac1，以及蛋白水解酶的调节。事实上，间充质运动与Rac的激活和Rho GTPases的抑制有关，而变形虫运动与相反的表型有关(1, 3, 5). 黑色素瘤细胞中EphA2的表达诱导RhoA活化和Rac1抑制(图5A和B)与这些细胞向变形虫运动方式的诱导转变保持一致。因此，我们研究了使用合成抑制剂或显性阴性突变体（dnRhoA）及其下游调节物RhoA-活化激酶（ROCK）和基质金属蛋白酶阻断RhoA对三维胶原晶格中EphA2-表达细胞的细胞形态的影响(图5C). 虽然EphA2-表达细胞在三维晶格内获得圆形形态，但分别使用细胞渗透性Tat C3或dnRhoA和Y27632阻断RhoA或其下游调节物ROCK，可将主要细胞形态恢复为更细长的形状，更典型的间充质黑色素瘤细胞。根据我们关于EphA2的MMP依赖性功能的假设，伊洛马斯特治疗不会影响EphA2表达细胞的圆形形态(图5C). 对RhoA、ROCK或MMPs抑制期间这些细胞的Matrigel侵袭的分析证实，EphA2表达赋予黑色素瘤细胞的运动刺激是Rho依赖性和MMP非依赖性的(图5D). 因此，由于EphA2的表达，RhoA/ROCK信号可能有助于F10-M3细胞的变形虫转变。

为了进一步证实EphA2诱导的侵袭是非变性的并且独立于MMP活性，已经对胶原释放的FITC进行了定量分析。我们的观察再次证实，EphA2表达诱导的运动刺激与细胞周蛋白水解无关(图6A). 暴露在三维I型胶原晶格中的黑色素瘤EphA2表达细胞似乎对2%的血清作出反应，基本上通过圆形/椭圆形变形体运动（参见图6B电影4，共焦反射显微镜入侵检测）。再次，在共聚焦反射显微镜侵袭试验中，我们通过伊洛马斯塔特或鸡尾酒蛋白酶抑制剂治疗证实EphA2表达细胞与基质金属蛋白酶的独立性(图6D; 电影5）。与这些观察结果一致，人类黑色素瘤细胞系的蛋白水解活性及其侵袭性对MMP抑制的敏感性与EphA2的表达呈负相关（补充图S3C类和D类).

因此，这些结果表明，EphA2的表达导致侵袭性黑色素瘤细胞迁移到穿过胶原蛋白的圆形挤压运动，促使黑色素瘤EphA2细胞使用不同的运动策略，避免使用MMPs，并利用EphA2激活所赋予的细胞骨架结构的可塑性向前发展。

胚胎生长因子或运动线索的重新出现是癌症基因改变的共同特征之一，强烈影响肿瘤细胞的行为(28–30). EphA2激酶在胚胎发育过程中起着关键作用，在神经发生和血管生成过程中传递方向运动信号，在晚期癌症中经常过度表达，并且经常在功能上被解除调控，从而导致恶性特征的多个方面(8, 10, 11, 31). 此外，转移病灶中通过磷酸化观察到EphA2的最高表达和激活程度(10, 12, 30, 32, 33). 本文提供的数据表明，EphA2激酶在侵袭性F10-M3黑色素瘤细胞中的再表达将其运动方式从间充质转化为变形虫样，使其具有强大的侵袭优势在体外和体内.

变形虫运动，最初描述为变形虫盘状网柄菌据报道，一些真核细胞需要通过柔性和弱粘附位点快速运动，导致细胞运动更多地依赖细胞质收缩和突起的速度(3, 34). 除了白细胞(35, 36)，在癌细胞中也发现了蛋白质水解依赖性和圆形运动，并已被纳入肿瘤细胞逃避生长原发部位的不同策略中(37). 腺癌细胞似乎以MMP依赖的方式响应EGF梯度而移动。在这些细胞中，粘附复合物扩散而非聚焦，肌动蛋白在皮质环中聚合，细胞挤压ECM间隙而不降解它(1, 37, 38). 其他通过变形虫运动移动癌细胞的例子包括V2肾癌细胞、Ras转化乳腺癌细胞以及肺和前列腺小细胞癌(39, 40).

为了响应特定的环境提示，癌细胞可以从头开始获得变形虫样运动，从而发生所谓的MAT。MAT可以通过肿瘤微环境线索、MMPs的局部抑制和调节因子的表观遗传表达来诱导。事实上，HT1080细胞在含有广谱蛋白酶抑制剂的混合物存在下，利用分泌型和膜型MMPs通过清晰的间充质运动，将其运动方式从基于蛋白酶转变为不依赖蛋白酶，从而经历MAT(7). 据报道，HT1080细胞在stathmin（一种已知的微管细胞骨架调节因子）的强制激活过程中也会发生MAT(41). 乳腺癌细胞在抑制RhoA-Smurf1的E3-泛素连接酶期间发生MAT，因此强调RhoA-小GTPase在这一现象中的关键作用(19). 最后，p53缺失促进RhoA/ROCK依赖性细胞在人类黑色素瘤细胞三维基质中的迁移和侵袭(42).

本文提供的数据允许包括黑色素瘤细胞中EphA2的激活，这是驱动癌细胞将其间充质运动方式转化为变形虫样的自然发生之一。事实上，侵袭性F10-M3黑色素瘤细胞使用基于蛋白水解酶的MMP运动策略来侵袭和转移。为了响应EphA2的再表达和激活，这些细胞激活了一个非蛋白溶解性侵袭程序，该程序通过激活细胞骨架运动、细胞质收缩和细胞突起收缩、Rho介导的细胞体圆形化和三维基质之间的挤压来进行，最终导致成功的肺和淋巴结腹膜转移。与这些发现一致，我们观察到，在人类黑色素瘤细胞系HS29-4T和A375中，EphA2的表达水平与利用三维基质的蛋白水解降解进行侵袭呈负相关。此外，MAT与整合素依赖性粘连减弱和蛋白水解局部粘连转换的消除有关(24). 与本报告一致，据报道EphA2表达可降低整合素功能和下游信号传导(26, 43). FAK被描述为这些对整合素介导的粘附作用的关键参与者(43). 此外，我们最近报道EphA2在前列腺癌细胞细胞运动调节中的作用强烈依赖于FAK的激活，可能是RhoA-GTPase交换因子激活的原因(26, 27). 我们目前的数据与之前的报告一致。事实上，我们在EphA2-表达细胞中观察到FAK的激活，伴随着RhoA的强烈激活。这一发现表明，FAK/RhoA信号通路主要负责驱动EphA2介导的变形虫运动方式的实现。与此一致，Rho激活已经与变形虫运动相关(7, 19, 25, 42)而FAK与促进侵袭性表型和黑色素瘤细胞的血管模拟有关(44, 45)虽然还没有研究变形虫运动性的联系。

除了依赖于蛋白水解途径的生成外，间充质运动还与Rac介导的细胞突起的激活有关(5, 6). 相反，据报道，变形虫的运动与细胞外基质中孔洞的形成无关，但强烈依赖于Rho介导的细胞体收缩和ROCK（Rho-associated compiled coil containing kinase）驱动的肌球蛋白收缩力的产生(5, 6). ROCK通过调节肌球蛋白轻链，导致细胞皮层收缩，使细胞在胶原纤维之间挤压，产生静水压力，可能有助于细胞突起(三). 根据我们提出的EphA2功能激活作为间充质细胞向变形虫转化的驱动力的建议，在EphA2表达的黑色素瘤细胞中，我们观察到Rac1的下调和RhoA小GTPases的上调。此外，三维矩阵中圆形的实现强烈依赖于RhoA和ROCK激活，从而证实了Rho信号在EphA2诱导的运动方式转换中的关键作用。

一些证据表明，黑色素瘤细胞利用间充质类型进行侵袭。事实上，一些蛋白酶被描述为通过体液炎症介质在侵袭性F10-M3黑色素瘤细胞中上调。为了与骨髓间充质蛋白水解酶侵袭黑色素瘤是一种成功的策略相一致，我们在此报告TNFα导致黑色素瘤进一步增加体内和在体外侵略性。然而，F10-M3黑色素瘤细胞通过基于MMP的运动和TNFα的上调，在侵袭潜能方面获得了巨大的益处，并且它们对EphA2的表达进行了MAT。这一事件导致了对在体外和体内侵袭性，赋予细胞骨架可塑性并允许MAT。令人惊讶的是，这种MAT可能是一种可逆现象，因为用TNFα治疗可以恢复细胞上调MMPs的能力，从而通过向间充质运动的新转变对促炎性肿瘤微环境作出反应。几种黑色素瘤的可塑性是一种被广泛记录的现象，也是治疗方法的关键障碍，可能涉及上皮-间充质转化(46)以及黑色素瘤细胞模拟血管系统的能力(13, 47). 我们的数据现在包括MAT作为一个进一步的程序，黑色素瘤细胞可以进行MAT，这有助于提高其可塑性以更好地适应环境变化。与我们在MAT中参与EphA2相一致，激酶已经与黑色素瘤可塑性相关，强烈参与黑色素瘤细胞的血管生成模拟(48, 49). 因此，表达EphA2的黑色素瘤细胞一方面可以促进辅助血管结构的形成，另一方面有助于诱导MMP诱导的依赖性侵袭性。此外，我们可以推测EphA2诱导的肿瘤细胞可塑性可能有助于开发不同的侵袭途径。考虑到变形虫的运动与淋巴细胞的运动相似(36)我们的数据表明EphA2的表达与淋巴结转移增加有关，我们推测EphA2介导的MAT与黑色素瘤细胞的优先淋巴传播有关。与此假设一致，MMP抑制剂MMI270在实验和自发转移模型中均抑制B16黑色素瘤细胞的造血而非淋巴转移(50).

然而，导致细胞向变形虫或间充质转化的表观遗传程序之间的关系需要进一步和深入的研究；我们可以推测，侵袭性黑色素瘤可以根据周围微环境及其基因改变采用双重侵袭策略。通过这种方式，它们既可以利用促炎环境来增加间充质运动，也可以进行变形虫转化，这在局部抑制蛋白水解活性期间非常有益。因此，通过使用抗体介导或小干扰RNA介导的EphA2表达下调来测试EphA2在肿瘤治疗中的靶向性是很有刺激性的(51, 52)在癌症侵袭和转移的临床前模型中，通过体内肿瘤细胞成像。

没有披露潜在的利益冲突。

拨款支持：意大利癌症研究协会、大学间生物技术联盟、Ente Cassa di Risparmio di Firenze和Fondazione Cassa di-Risparmio di Lucca以及托斯卡纳地区项目TRESOR。M.L.Taddei由一个意大利基金会（Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro fellow）资助。

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