试管旅行：蛋白酶在个体和集体癌细胞侵袭中的作用

细胞外基质（ECM）蛋白质的蛋白水解分解长期以来一直被认为是侵袭原发性癌症病变的标志(1). 几种蛋白酶有助于ECM分解和重塑，其中大多数在不同类型癌症的转移癌进展过程中上调（参考文献综述）。1–三). 在侵袭性迁移过程中，癌细胞使用分泌的、表面定位的和细胞内的基质金属蛋白酶（MMP）、丝氨酸蛋白酶和组织蛋白酶，以蛋白水解的方式裂解并去除界面上不同类型的ECM底物，包括胶原蛋白、层粘连蛋白、玻璃体凝集素和纤维连接蛋白(三–5). 在二维底物上，含有丰富肌动蛋白的聚焦接触结构，包括脚足、足小体或突起的侵入足，在细胞下方切割ECM(5, 6). 与二维迁移相比，通过三维间质ECM迁移期间的蛋白水解接触结构仍不明确。对于细胞侵入三维组织，如富含胶原蛋白的间质组织、（腹膜）基底膜和绒毛尿囊膜，MT1-MMP/MMP-14被确定为速率限制胶原酶，而MMP-14的干扰阻止了细胞的有效运动(7, 8). 因此，蛋白水解酶ECM重构被认为是侵袭性细胞迁移的先决条件和后果，但其时空步骤及其与不同运动程序的相关性尚不清楚(9).

实验研究主要集中于单个癌细胞的行为，如单个细胞的极性和运动。相比之下，癌症病变中的组织浸润体内通常由多种机制引起，包括单个细胞的侵袭，其次是细胞链、细胞片和细胞簇的集体侵袭(图1A; 参考文献。10, 11). 集体细胞迁移在形态发生中得到了很好的确立，使细胞在保持细胞间连接的同时一起移动，并且在肿瘤组织侵袭期间明显地发生了重演(12). 因为侵袭性固体多细胞链和肿块与ECM形成一个联合型界面，而细胞间接触的瘤内区域缺乏间质组织成分、蛋白酶位置以及对邻近组织的功能，很可能与单个移动细胞的功能不同(9).

传统上，蛋白酶的基本功能，如底物特异性、周转率和活性调节，是通过测试溶液中酶-底物相互作用的生化分析进行分类的。然而，将其整合到复杂的细胞功能中需要在组织环境中进行额外的基于细胞的酶活性检测。多模式亚微米共聚焦显微镜的最新进展现在可以确定活细胞中蛋白酶活性的位置以及对分裂组织结构的影响。使用绿色荧光蛋白标记的低水平表达蛋白酶以及荧光标记ECM聚合物（如I型和IV型胶原）去淬后的荧光发射来检测蛋白酶的动力学和功能(图1B; 参考文献。3, 4, 13, 14). ECM纤维的位置、聚集状态和结构完整性的丧失通过背散射显微镜和裂解位点特异性新表位染色进一步可视化(4, 13). 总之，这些方法提供了侵袭性癌细胞迁移过程中基质消化的时间和结构变化的高分辨率地图。

侵袭性单个细胞的细胞周蛋白水解和组织微模式化。在作为模型ECM的三维胶原基质中，大多数癌细胞自发极化，产生整合素依赖的细胞-基质相互作用，采用不同的纺锤形形态，并经历蛋白水解迁移模式，导致沿着迁移轨迹形成小的结构缺陷(13). 这种运动程序被称为“间充质”迁移，使人想起活化的成纤维细胞(2). 狭窄的前缘突出，附着在ECM上，产生前牵引力，而单个胶原纤维在前缘后几微米（5–20μm）处被劈开，细胞体宽度逐渐扩大(图1C; 裁判。14). 因此，前向力的产生和蛋白水解ECM降解在空间上是分离的，这防止了细胞拉动ECM纤维时基质的过早损失。部分断裂的松散纤维端部并非完全溶解，而是与细胞表面结合，并随着细胞向前移动而重新对齐，这导致平行的纤维取向与小的基体缺陷接壤(图1C). 因此，通过组织不良的基质侵入单细胞会导致ECM微模式化和阻力最小的微裂纹(14).

在提供足够间距（在几微米范围内）的组织中，抑制细胞周蛋白水解导致细胞和分子适应程序，该程序通过改变形状和挤压基质间隙来确保细胞运动，尽管结构组织重塑已被废除(2, 15). 这种细胞迁移的可塑性对应于间质-变形体转变，这让人想起组成性蛋白酶诱导的变形体白细胞通过纤维细胞外基质转运(16). 然而，在低密度ECM中，非蛋白水解迁移是完全补偿的，通过高密度组织的迁移被延迟甚至消融，这取决于机械阻力和孔径(7, 8, 14). 因此，通过迫使细胞挤压组织间隙和间隙，细胞迁移和细胞周蛋白水解可以彼此分离。

组织宏观模式和向集体入侵的转变。迄今为止，三维组织培养中实体肿瘤行为的最佳近似值在体外是植入三维ECM的多细胞球体，如胶原蛋白、纤维蛋白或基质。在纤维肉瘤和乳腺癌球形培养物中，沿着所谓的“先导细胞”（可能是癌细胞本身）产生的小微裂纹，发生从最初单个间充质细胞侵袭到多细胞链的自发转变(图1B,，空箭头)或来自非肿瘤性肿瘤基质的活化成纤维细胞(17). 微轨迹由以下细胞以细胞间接触依赖的方式依次填充，并进一步加宽，导致沿着横向退化ECM层的股状集体侵入(图1D). 最终，细胞内细胞区域被清除ECM，类似于集体体内入侵(图1A)而细胞-组织界面显示出组织结构可变的皮质肌动蛋白细胞骨架，以及聚焦的MT1-MMP、β1整合素和胶原降解表位(图1D; 裁判。14). 因此，与单独迁移的细胞面对结构复杂的三维基质界面不同，细胞团形成了一个类似蛋白水解酶片的光滑的二维细胞外基质层，细胞外基质呈圆形排列，细胞团沿着该层集体滑动(图1B和D). 通过逐渐消化大的组织界面，富含细胞的腔室扩大，从而形成组织宏观模式(14).

MT1-MMP在癌细胞侵袭中的作用。虽然包括MMP-1、MMP-2、MMP-13、MMP-14和组织蛋白酶B、K和L在内的几种蛋白水解酶对I型和III型胶原具有活性，但提供组织完整性、抑制性、，基因断裂研究强烈表明，MMP-14是控制胶原蛋白周转的速率限制酶(7, 8). 在不同的侵袭模型中，MMP-14的功能丧失很难被其他酶补偿(7, 8)表明MMP-14是抗侵袭治疗的潜在靶点。因此，广谱MMP抑制剂或MMP-14的RNA敲除在同等程度上消除了胶原蛋白的微观模式和宏观模式(14, 17). 因此，集体入侵需要通过ECM微模式和宏模式获得空间，而单细胞运动可以独立于蛋白酶功能发生(14). 这些发现表明，蛋白酶抑制可能会阻止集体入侵过程，但作为潜在的不必要的“副作用”，集体向变形虫的转变可能会增强单细胞向周围的传播。

虽然MMPs已经接受了大量的临床前和临床癌症靶向研究，尽管许多研究暗示了几种蛋白酶类在癌症进展中的作用，但还没有明确的研究结果(18, 19). 尤其是，尚不完全理解为什么在某些病变中，MMP抑制可能会干扰而在其他病变中促进进展(18). 这种差异的部分原因可能在于迄今为止忽视了依赖或不依赖蛋白酶功能的不同传播程序(9). 单个癌细胞通过结缔组织扩散到淋巴管或基底膜有缺陷的肿瘤相关血管中可能是非蛋白溶性变形虫挤压所致；因此，转移性单细胞播散似乎不太可能成为MMP抑制治疗方案的靶向功能。相反，肿瘤肿块侵袭和组织宏观模式可能代表MMP抑制的有趣靶向过程，以防止或延迟破坏性组织侵袭敏感结构和器官。根据组织切片中的集体浸润模式，MMP干扰的临床相关候选病变可能包括浸润颈部和富含胶原蛋白的气管结构的耐药口腔鳞癌，侵蚀眼眶或颅骨的基底细胞癌，或在不同部位复发纤维肉瘤(12). 蛋白酶抑制治疗的这种精细适应症清楚地证明，在临床前和临床环境中，重新审视细胞周ECM分解的作用以及单个蛋白酶对不同类型组织侵袭的贡献。

没有披露潜在的利益冲突。

拨款支持：Deutsche Forschungsgemeinschaft（《联邦公报》第1155/7-2页）和Deutsche-Krebshilfe（《阿塞拜疆公报》第106950页）。

我们感谢Margit Ott和Monika Kuhn提供的技术支持。