雷帕霉素对人外周血白细胞-SCID重组小鼠HIV-1感染的抑制作用

总结

免疫调节药物雷帕霉素（RAPA）抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）CCR5株复制的能力在体外促使我们在HIV感染的小鼠临床前模型中测试其效果。从用R5热带SF162株HIV-1（1000 50%组织培养感染剂量/ml）腹腔激发前2天开始，每天向用人外周血白细胞（hu-PBL）重建的SCID小鼠口服RAPA（0.6或6mg/kg体重）或其载体。与未接受治疗的hu-PBL-SCID小鼠相比，接受载体对照治疗3周的HIV感染hu-PBL-SCID小鼠表现出严重的CD4耗竭⁺细胞（90%），CD8增加⁺细胞和CD4转化⁺/CD8（CD8）⁺细胞比例。相反，用RAPA治疗HIV感染的小鼠可以防止CD4的减少⁺细胞和CD8的增加⁺细胞，从而保留原始CD4⁺：CD8⁺细胞比率。病毒感染还导致在病毒攻击后的3周内，在车辆处理小鼠的腹膜细胞、脾脏和淋巴结组织中检测到HIV-DNA。相反，RAPA治疗降低了细胞前病毒的整合，降低了血液中的HIV-RNA水平。此外，在共培养试验中，RAPA处理小鼠的脾脏感染异基因T细胞的能力降低，这与剂量有关。这些数据表明，RAPA对R5株HIV具有强大的抗病毒活性体内并支持使用其他研究来评估该药物在HIV患者管理中的潜在应用。

介绍

人体免疫缺陷病毒（HIV）感染发展为获得性免疫缺陷综合征取决于多种因素[1]. HIV进入宿主细胞需要病毒包膜蛋白与初级（CD4）和次级（CCR5和CXCR4）细胞受体复合物之间的多重相互作用。相应地，缺乏CCR5（CCR5-Delta32纯合基因型）的个体对HIV R5株感染具有抵抗力，而CD4上表达高水平CCR5共受体的个体⁺T细胞增加了HIV感染和疾病的进展[2]. CD4上CCR5的表达⁺T淋巴细胞与HIV病毒载量密切相关[三]. 因此，新的抗HIV策略包括针对CCR5共受体的小分子、单克隆抗体或修饰配体[4–6]. CCR5、CCR2、CX（3）CR1、CXCL12（SDF1）或CCL5（受表达和分泌的正常T细胞激活调节）的突变也被证明会影响患者对抗逆转录病毒治疗的反应[1].

由于绝大多数HIV感染者都具有生物变体，将CCR5用作HIV感染的共受体，因此已努力开发非功能性CCR5拮抗剂[4]. 尽管小分子CCR5抑制剂，马拉维酸（UK-427857）和vicriviroc（SCH-D）已被证明可有效降低HIV感染者的病毒载量，二次事件与其长期临床应用有关，包括恶性肿瘤的发展和使用HIV-1变体的CXCR4的发展。然而，CCR5抑制剂在临床环境中的已证明疗效提供了有价值的概念证明，证明有必要进一步努力，以确定除CCR5抑制外可能具有其他抗HIV特性的其他CCR5抑制物。

雷帕霉素[西罗莫司（RAPA）]是一种大环内酯类抗生素，已在临床上用于预防性治疗肾移植排斥反应。该药物通过干扰白细胞介素（IL）-2与其受体结合产生的分子事件选择性抑制T细胞功能。当RAPA与其细胞内受体FKBP12结合后，该复合物与光漂白后的荧光恢复相关，从而对T细胞产生细胞抑制作用[7，8]. 最近，RAPA为HIV-相关卡波西肉瘤提供靶向治疗的能力被强调[9].

RAPA首次被证实具有抗HIV作用，因为它可以在存在次优的5′-多嘧啶道（病毒所需的位点）的情况下选择性地抑制带有5′-聚嘧啶基序的mRNA亚群的翻译塔特mRNA生成[10–13]. 罗伊等。证明RAPA在人类淋巴T细胞和人类外周血白细胞（hu-PBLs）中强烈抑制HIV-1复制。RAPA对HIV-1复制的抑制作用与独立于病毒特异性反式激活Tat蛋白的基础HIV-1长末端重复序列基因表达减少有关[14].体外RAPA对活化的人类T细胞中HIV复制的抑制作用也得到了证实[15].

Heredia的研究进一步激发了人们对RAPA抗HIV特性的兴趣等人。这表明RAPA在转录水平降低了T细胞和巨噬细胞上CCR5的表达，同时上调了巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α和MIP1β的合成[16]. Gilliam最近的一项研究等。也表明，RAPA降低了猕猴外周血单个核细胞（PBMC）或颈阴道组织中CCR5信使RNA的表达[17].

这些观察结果使我们执行体内我们常规使用的小鼠SCID–hu-PBL HIV感染模型中RAPA的研究[18–21]和其他[22，23]作为体内这是一个工具，用于深入了解致病机制并评估值得考虑用于临床的新型抗病毒方法。我们的数据表明，长期给予6毫克/千克体重（bd-wt）的RAPA治疗，通过阻止CD4的减少，对HIV-1感染过程产生了深刻而有利的影响⁺细胞，增加CD8的数量⁺细胞，抑制前病毒整合并减少与HIV-1感染典型相关的外周病毒载量增加。

材料和方法

Hu-PBL-SCID鼠标模型

CB17 SCID/SCID雌性小鼠（Charles River Laboratories，Stone Ridge，NY，USA）在4周龄时使用，并在其他地方描述的特定无病条件下保持[18–21]. 动物处理和研究方案符合国际准则，并得到了当地机构动物护理和使用委员会的批准。

Hu-PBLs来自健康献血者的外周血。所有献血者在献血前均进行了HIV-1、乙型和丙型肝炎病毒筛查。每组4只小鼠腹腔注射40×10⁶细胞在0.5 ml RPMI-1640培养基中再次悬浮。

实验设计

CB.17 SCID/SCID小鼠最初通过腹腔注射40×10⁶按说明获得的PBL[18–21]然后用0·6或6 mg/kg bd wt的RAPA或其载体作为对照。这些剂量的RAPA是根据在人类1型糖尿病非肥胖糖尿病小鼠模型中显示的免疫调节作用来选择的[24]. 从静脉注射R5热带SF162病毒（1000 50%组织培养感染剂量/ml）前2天开始，每天进行治疗，持续23天。另外三组性别和年龄匹配的CB.17 SCID/SCID小鼠用40×10⁶hu-PBLs未被病毒攻击，未经治疗，或在与HIV感染hu-PBL-SCID小鼠相同的实验条件下单独使用RAPA（6 mg/kg）或其载体。

SCID小鼠腹腔和其他器官的细胞回收

在病毒攻击3周后，杀死感染HIV的hu-PBL-SCID小鼠。重组23天后处死未感染hu-PBL-SCID小鼠。仅对未感染小鼠的样本进行流式细胞仪分析。从腹腔和脾脏收集细胞。在RPMI-1640培养基中清洗单细胞悬浮液两次之前，脾组织被破坏，结缔组织和碎片被沉淀。

HIV-1感染检测及流式细胞术分析

病毒感染3周后测量血浆HIV-1 RNA拷贝数（Amplicor HIV-1 Monitor Assay；Roche Molecular Systems，Milano，Italy）。为了聚合酶链反应检测HIV-1前病毒序列，从hu-PBL-SCID小鼠的腹腔灌洗液以及脾脏和淋巴结组织中提取DNA。使用人类白细胞抗原-DQα基因的特异性引物确定人类序列的存在（数据未显示）。如前所述，通过特异性扩增HIV-1 gag序列检测HIV-1前病毒DNA[21]. 在每个实验中，通过扩增从8E5细胞制备的DNA（每个细胞含有一个前病毒拷贝）来测试测定的灵敏度，该细胞被连续稀释到SCID小鼠细胞DNA中（数据未显示）。研究结束时，还使用荧光素异硫氰酸标记的抗CD45抗体和藻红蛋白抗CD4、CD8抗体（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）通过流式细胞术分析了小鼠腹腔的人类细胞[18–21].

共培养分析

用RAPA或其载体作为对照，从hu-PBL重组和HIV感染小鼠的脾脏中回收细胞。脾细胞（10⁵)与10个⁵用5µg/ml植物血凝素预防性激活并在50 U/ml IL-2存在下培养的人类异基因T细胞。培养10天后，通过使用商业酶联免疫吸附测定试剂盒（Dupont，Wilmington，DE，USA）检测培养上清液中的p24-gag抗原来测定病毒复制。

统计分析

数据显示为平均值±标准偏差，来源于两项独立研究。由于两项研究的数据是可重复的，因此将数据合并并显示为单个研究的结果。每个实验组由八只小鼠组成。采用单向方差分析进行统计分析。A类P（P）-值<0.05被认为是显著的。p24和HIV RNA的不可检测值被指定为分析下限的理论值，以便进行统计分析。

结果

体内RAPA治疗可防止CD4降低⁺水平并增加CD8⁺水平

图1a显示CD4的比例⁺和CD8⁺未经治疗或接受RAPA（6 mg/kg）或其载体的非HIV-1感染hu-PBL-SCID小鼠的细胞，在重组23天后被杀死。CD4的比例没有显著差异⁺和CD8⁺三组小鼠的T细胞及其比率(图1a). 相反，在hu-PBL-SCID小鼠感染R5热带SF162株HIV-1并以RAPA载体作为对照治疗后3周内，CD4严重耗竭⁺细胞和CD8增加⁺观察到CD4倒置的细胞⁺：CD8⁺细胞比率。相反，当对接受RAPA治疗的小鼠进行病毒攻击时，CD4的减少⁺CD8水平和增加⁺水平被阻止，CD4⁺ : CD8（CD8）⁺细胞比例保持不变。RAPA的作用呈剂量依赖性，最高剂量的药物可降低CD4⁺与CD4减少90%相比，CD4减少59%⁺在对照组中观察到的水平。

用RAPA治疗会减少细胞前病毒的整合，降低hu-PBL-SCID小鼠血液中的HIV-RNA水平，并降低脾细胞感染异基因T细胞的能力

hu-PBL-SCID小鼠的HIV-1感染与腹膜细胞、脾脏和淋巴结组织中HIV-DNA的存在有关(图2). 与这些结果一致，在接种后21天杀死的所有感染小鼠的血液中检测到艾滋病毒(图3)此外，将从脾脏中回收的细胞与同种异体人淋巴细胞共同培养，检测出HIV-p24阳性(图4). 这些读数与hu-PBL-SCID小鼠中的HIV-1感染有关，均受到RAPA治疗的影响。图2显示RAPA治疗对腹膜细胞、脾脏和淋巴结组织中前病毒整合的抑制，而图3表明RAPA处理的小鼠血液样本中HIV检测降低。采用共培养试验，测试RAPA处理小鼠的脾脏感染异基因T细胞的能力。如8只小鼠中只有2只没有检测到HIV-p24所示，RAPA处理小鼠的脾脏感染异基因T细胞的能力低于车辆处理小鼠的脾(图4). 与我们对CD4的研究结果一致⁺和CD8⁺在hu-PBL-SCID小鼠感染HIV-1的过程中，RAPA的作用具有剂量依赖性。特别是，八只接受最高剂量RAPA治疗的小鼠中有七只血液中检测不到HIV-RNA水平。

RAPA治疗小鼠的临床观察

从HIV-1感染和未感染hu-PBL-SCID小鼠的一般外观和行为来看，动物对RAPA治疗的耐受性良好。此外，用RAPA或其载体治疗的HIV-1感染和未感染的HIV-1小鼠的bd-wt没有差异与未经治疗的小鼠（数据未显示）。与从这些临床数据中得出的RAPA缺乏毒性相一致，通过台盼蓝细胞染料排除法评估，对用RAPA治疗的未感染hu-PBL-SCID小鼠的人腹膜PBMC的分析显示，从未经治疗或车用治疗的小鼠组获得的细胞具有类似的活性（数据未显示）。

讨论

尽管高效抗逆转录病毒治疗（HAART）通常能有效降低病毒载量并重建CD4⁺T细胞计数、潜伏病毒库持续存在，患者在终身治疗期间可能经历药物相关毒性和药物相关病毒耐药性。最近，一种抗病毒细胞抑制药物被提议纳入HAART的范围。这些药物，如羟基脲、霉酚酸和RAPA，通常是用于其他治疗适应症的免疫抑制物质。已有报道称，免疫抑制药物有可能成为稳定HIV患者HAART治疗中安全有效的佐剂[25，26]. 这些药物的一个优点是它们能够靶向宿主细胞蛋白质，这些蛋白质不易受到突变的影响，从而挑战艾滋病毒感染。因此，它们的抗性状况似乎很有希望。

本文的结果首次显示了众所周知的免疫抑制药物RAPA能够显著预防在hu-PBL-SCID小鼠中接种R5热带SF162 HIV毒株引起的病毒学和免疫学事件。尤其是CD4的急性丢失⁺与CD8增加相关的细胞⁺细胞和CD4的继发性改变⁺：CD8⁺将病毒攻击应用于经RAPA治疗的小鼠时，T细胞比率被阻止。虽然我们不能排除，观察到的带有RAPA的CD4百分比的增加可能是CD8细胞百分比下降或药物对该细胞群的毒性作用的继发因素，但这两种可能性似乎都不太可能。事实上，RAPA并没有改变CD4的比例⁺和CD8⁺未感染hu-PBL-SCID小鼠的细胞与CD4保持一致⁺ : CD8（CD8）⁺两个重组和未感染对照组的细胞水平。此外，另一项研究证明RAPA不会改变CD8的比例⁺Lewis或棕色挪威大鼠的T细胞[27]. 综上所述，这些数据表明，预防CD8的增加⁺在用RAPA治疗的HIV-1感染hu-PBL-SCID小鼠中观察到的T细胞选择性地次要于CD4的HIV感染预防⁺来自药物的T细胞和随后由病毒诱导的CD4:CD8比率的改变。

已知与hu-PBL-SCID小鼠中HIV-1感染相关的其他读数，如腹膜细胞、脾脏和淋巴结组织中HIV前病毒的整合以及接种小鼠中循环HIV的出现，也受到RAPA预处理的显著影响。在共培养试验中，这些预处理小鼠的脾细胞也表现出感染同种异体T细胞的能力降低。所有这些效应都显示出剂量依赖性，RAPA的最高剂量为6 mg/kg，其效率显著高于10倍的低剂量。

通过使用众所周知的人类HIV感染临床前模型，我们的研究结果扩展并验证了独立的在体外研究[14–16]这表明RAPA有能力抑制白血病T细胞系、人PBMC和巨噬细胞中R5株HIV的复制。在这些在体外研究表明，RAPA的抗病毒作用与CCR5在PBMC和单核细胞中的下调有关，浓度分别为1 nM和0.01 nM[16]. 此外，感染性试验表明，RAPA抑制了R5株HIV在PBMC和巨噬细胞培养物中的复制，其浓度（0.01 nM）显著低于预防肾移植排斥反应所需的治疗水平[16]. 使用低剂量RAPA抑制HIV复制的效果与我们目前的研究结果一致，即即使在低至0.6 mg/kg的剂量下，RAPA的抗HIV活性也明显减弱。

尽管目前的实验没有直接探讨RAPA在hu-PBL重组的HIV感染小鼠模型中介导抗病毒作用的机制，但先前发表的在体外证据和SF162的R5菌株用于我们的病毒挑战有力地支持了CCR5表达下调在RAPA表现出的抗病毒作用中起关键作用的假设。我们实验室正在进行研究，以确定在hu-PBL-SCID小鼠HIV-1感染过程中，RAPA治疗是否下调脾、淋巴或腹腔组织细胞中CCR5的表达。通过确定这些结果是否体内研究结果将与之前报道的一致在体外数据。然而，尽管现有文献数据强烈表明抑制CCR5表达可能是本研究中观察到的调节RAPA抗HIV活性的主要机制之一，我们不能排除该药物的其他免疫调节作用有助于预防该临床前模型中HIV-1感染的可能性。特别是，由于肿瘤坏死因子α的上调和核因子κB活性的过度激活促进了HIV-1感染[28，29]，不仅介导宿主炎症反应，还激活HIV-1长末端重复序列，以及RAPA抑制这两种事件的事实[30–32]RAPA的这些以及可能的其他免疫药理学特性似乎有可能降低HIV-1的感染性。

RAPA是一种已经在临床上用于预防同种异体移植排斥反应的药物。因此，证明其对R5 HIV株感染具有抗病毒作用的能力体内对于将RAPA治疗转化为HIV患者的管理具有直接相关性。然而，我们以预防性的方式（在接种SF162时开始治疗）而不是以治疗性的方式测试了RAPA的效果。还有必要进行更多的研究，以确定RAPA是否也能像已确诊的HIV感染一样，积极减少正在进行的病毒复制。已经提出RAPA在HAART中断期间作为病毒抑制剂的可能治疗作用[25]. RAPA在HIV感染治疗中发挥作用的可能性也需要在HAART方案中与其他抗逆转录病毒药物可能相互作用的背景下进行评估。赫雷迪亚等。最近证明RAPA降低CD4上CCR5的密度⁺T细胞，从而协同影响HIV融合抑制剂安氟威的作用，并使后者的剂量减少33倍[33]. RAPA与CCR5拮抗剂TAK-799的协同作用[16]，也有来自的报告在体外研究。相应地，我们正在研究RAPA与小分子马拉维酸（maraviroc）的可能协同作用，马拉维酸是CCR5的一种小分子抑制剂，最接近获得进入临床环境的监管批准。

综上所述，这些数据表明，RAPA对R5株HIV病毒具有重要的抗病毒特性，值得进一步研究，以确定其在HIV感染患者管理中的可能用途。

致谢

作者感谢Björn Hoffstedt博士、Christine Kreisl博士和John Ryan博士在研究设计、数据讨论和批判性阅读手稿方面提供的宝贵帮助。阿尔贝托·塞索里尼（Alberto Cesolini）和菲利波·巴勒莫（Filippo Palermo）教授的技术和实验室技能也得到了感谢。

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