本文在以下内容中提到：

引言

肝细胞癌（HCC）排名第三全球癌症相关死亡的共同原因男性比女性更普遍(1). 据估计，745500782500例新发肝癌死亡病例分析2012年全球(2). 目前，手术切除是最佳治疗策略肝癌患者的长期生存结果。然而HCC的临床表现可能各不相同。在某些患者中，这种疾病进行了一个激进的过程，存活了几个月，而其他患者的临床表现可能相对较慢诊断后进化并存活5至10年以上。安提高对发病机制的理解和对肝癌的新生物标记物可能为医生治疗这一疾病提供帮助有额外治疗选择的疾病。尽管它已经提出了几个分子标记，包括甲胎蛋白（AFP），可能与HCC的预后、临床应用程序有限(三——5). 因此，以往的研究重点是寻找新的预后和治疗生物标志物肝癌的靶向性(6——8).

肿瘤细胞的增殖状态是反映生物特性的重要参数并影响患者的预后和治疗效率直接切除肿瘤。DNA拓扑异构酶是DNA复制、转录和重组，以及染色体紧密性和分离(9). 多个家族和亚家族已经描述了两种类型的DNA拓扑异构酶（I和II）(9). 有两种亚型人类拓扑异构酶II，α和β，编码在染色体17q21-22上和3p24(10,11). TopoIIα对生存至关重要积极生长的细胞。酶浓度上调在细胞增殖期和TopoIIα水平显著升高在细胞周期中增加，并且在G2/M中有一个增加的峰值相位(9). 考虑到之前TopoIIα在细胞分裂中的作用及其增加细胞周期G2/M期的表达，免疫组织化学TopoIIα染色可能有助于测定细胞增殖，最终恶性转化(9——11).以前的研究认为TopoIIα是患有食管鳞状细胞癌、乳腺癌、食道癌和食道癌的患者，肾透明细胞癌与鼻咽癌(12——15).

已确定的增殖标记之一是Ki67蛋白质，可能在细胞核内检测到。同Ki67蛋白质存在于细胞周期的所有活跃期（G1，S、 G2和有丝分裂），但在静止细胞（G0）中不存在确定给定生长分数的有效标记细胞群(16). 在Ki67是多民族乳腺癌患者的样本是一个重要的独立预后标志物(17).

已对TopoIIα或Ki67单独研究其作为预后标志物的作用肝癌患者的生存率。然而，到目前为止，是否TopoIIα或Ki67影响肝癌患者的长期生存有争议。本研究调查了TopoIIα和Ki67表达并评估其在预测结果中的效用肝细胞癌患者。

材料和方法

患者和肿瘤样本

HCC肿瘤样本（共353个）来自接受肝脏手术切除的患者在福州总医院（福建，中国）。使用国际抗癌肿瘤结节转移联盟（TNM）分类系统(18)至对切除标本进行分类，Ⅰ/Ⅱ期251例，102例在第三阶段确定了a。对组织学分级进行分类以及高分化/中分化（n=329）和低分化（n=24）。参与本研究的所有患者均符合以下标准：门静脉无肿瘤血栓形成；只有肿瘤病变1例；0–1东部合作肿瘤组得分手术前（肝功能等级Child-Pugh A级；无远处转移、腹水或肝性脑病）；没有癌症手术前治疗，病理证实为原发性肝癌手术后；完整的临床记录和随访可用信息；无其他肿瘤病史；激进派切除术。根治性切除定义如下：所有病变手术切除并经术中超声证实；病理检查阴性；两种情况下的肿瘤血栓分支能够被切除。排除标准为：活检样本上的肝组织不足，无法进行额外分析或有关患者结局的临床数据不足；和无乙型肝炎病毒感染史。

临床数据分析人员不考虑肝脏中TopoIIα和Ki67的表达水平癌症样本，实验室和分析人员做了不查看临床数据。本研究方案获得批准福州总医院伦理委员会，中国），并获得所有患者的知情同意。

后续手术

2月间接受肝切除术的患者2003年和2012年10月进行了密切的临床观察，包括腹部CT成像、AFP水平和每隔2-4个月进行一次肝功能测试。随访结束日期2014年10月1日，中位随访时间为34（范围，2–122）个月。通过电话或问卷调查作为补充方法。

免疫组织化学（IHC）分析

之前描述的IHC方法施密洛维茨-韦斯等(19),对于Ki67分析，使用抗Ki67抗体（中国福建麦新生物科技有限公司；克隆号，MID-1；稀释，1:130）以替换抗体。这个用同样的方法分析DNA TopoIIα的表达，使用抗DNA TopoIIα抗体（麦新生物科技有限公司；克隆号3F6；稀释，1:150）以替换抗体。

IHC染色的评估

353个染色组织切片（4µm厚）由两名病理学家分别在不同场合进行评估以前对任何患者信息的了解。半定量IHC检测用于测定TopoIIα蛋白水平四分制，如下：无阳性细胞，0<25%阳性细胞，1；25–50%阳性细胞，2个；≥50%阳性细胞，3。肝癌分级为0或1的组织样本被判定为TopoIIα低表达，而2级或3级的人被视为TopoIIα较高表达式。

由于Ki67的表达大多是同质的根据阳性细胞的百分比进行评分以下标准：（−），未染色或染色的癌细胞<10%（染色≥10%的癌细胞为阳性）；(+),癌细胞染色率为10-25%；（++），癌细胞染色26–50%；（+++），癌细胞染色51–75%；（++++）癌细胞染色>75%。Ki67表达水平为（−）或（+）的肝癌组织样本判断为Ki67低表达；带有（++）、（+++）或（++++）Ki67表达被认为具有高Ki67表达式。

统计分析

使用SPSS统计进行分析软件（版本20.0；IBM SPSS，Armonk，NY，USA）。数据如下以中间值和范围表示。对分类数据进行了分析使用χ2测试或Fisher精确测试。相关性使用Spearman’s分析TopoIIα和Ki67之间的表达秩相关检验。总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）采用Kaplan-Meier方法进行评估用log-rank检验检验差异。单变量计算95%置信区间（CI）的风险比使用Cox比例风险回归模型按enter-stepwise选择。评估TopoIIα和Ki67表达，Cox多变量比例对所有变量进行风险回归分析通过单变量分析确定其预后意义带有逐段输入选择。P<0.05被认为表明具有统计学意义的差异。

结果

人口特征和临床病理资料

本研究队列包括309名男性和44名中位年龄为53岁（13-81岁）的女性肿瘤中等大小为4cm（范围为1-26cm）。血清AFP水平为66.0%的患者≤400µg/l，34.0%的患者>400µg/ml（正常范围，<20.0 ng/ml）肿瘤为93.2%的患者分化良好/中等低分化6.8%；26.1%的肿瘤位于左侧右侧占73.9%；肿瘤TNM分期为I/II71.1%的患者和28.9%的IIIa患者。

Ki67表达与临床病理参数HCC的表一和图1检测到Ki67表达肝癌组织中肿瘤细胞核内(图1A和B). 在353例肝癌组织中，131（37.1%）高表达，222（62.9%）低表达表达水平。结果显示Ki67的表达是与TNM分期（P=0.014）、肿瘤大小（P=0.0114）和高AFP水平（P=0.004）。然而，未观察到两者之间的关联Ki67和年龄、性别、肿瘤位置或组织学分级。

图1。 核Ki67染色观察一例肝癌。（A） Ki67在肝癌中的高表达（放大倍数，×200）。（B） Ki67在肝癌中的高表达（放大倍数，×400）。核TopoIIα染色观察肝癌1例。（C） TopoIIα在肝癌中的高表达（放大，×200）。（D） TopoIIα在肝癌中的高表达（放大倍数，×400）。HCC，肝细胞癌；拓扑异构酶IIα。

表一。 TopoIIα/Ki67之间的关联患者的表达和特征（n=353）。

表一。

TopoIIα/Ki67之间的关联患者的表达和特征（n=353）。

	Ki67表达			地形IIα表达
特性	低，n（%）	高，n（%）	P值	低，n（%）	高，n（%）	P值一
年龄			0.427			0.218
≤55年	126 (56.8)	80 (61.1)		127 (55.9)	79 (62.7)
>55年	96 (43.2)	51 (38.9)		100 (44.1)	47 (37.3)
性别			0.373			0.921
男	197 (88.7)	112（85.5）		199 (87.7)	110 (87.3)
女性	25（11.3）	19 (14.5)		28 (12.3)	16 (12.7)
组织学等级			0.176			0.489
差异化程度高/中等	210 (94.6)	119 (90.8)		210 (92.5)	119 (94.4)
差异化	12 (5.4)	12 (9.2)		17 (7.5)	7 (5.6)
血清AFP水平（微克/升）			0.004			0.017
≤400	159 (71.6)	74 (56.5)		160 (70.5)	73 (57.9)
>400	63 (28.4)	57 (43.5)		67 (29.5)	53 (42.1)
肿瘤位置			0.641			0.641
左侧	56 (25.2)	36 (27.5)		56 (25.2)	36 (27.5)
对	166 (74.8)	95 (72.5)		166 (74.8)	95（72.5）
TNM阶段			0.014			0.009
一/二	168 (75.7)	83 (63.4)		172 (75.8)	79 (62.7)
IIIa公司	54 (24.3)	48 (36.6)		55（24.2）	47 (37.3)
生存			<0.001			<0.001
已故	72 (32.4)	81 (61.8)		71 (31.3)	82 (65.1)
活着	150 (67.6)	50 (38.2)		156 (68.7)	44 (34.9)
肿瘤大小			0.014			0.001
≤5厘米	143 (64.4)	67 (51.1)		150 (66.1)	60 (47.6)
>5厘米	79 (35.6)	64 (48.9)		77 (33.9)	66 (52.4)

｛需要标签（或@符号）对于fn[@id='tfn1-ol-0-0-5999']}甲胎蛋白；TNM、，肿瘤淋巴结转移；拓扑异构酶IIα。

a用于生成这些数据的统计测试P值为χ²测试。

在细胞核中也检测到TopoIIα的表达肝癌组织中的肿瘤细胞(表一;图1C和D). 在353例HCC组织中，126例组织（35.7%）显示高表达和227例（64.3%）低表达。类似Ki67，TopoIIα的表达模式与TNM相关分期（P=0.009）、肿瘤大小（P=0.001）和AFP水平（P=0.017），而TopoIIα与年龄、性别、，肿瘤位置或组织学分级。

TopoIIα与Ki67相关HCC中的表达

IHC结果显示TopoIIα表达比率与Ki67呈正相关（Spearman相关系数，r=0.444；P<0.001）。

RFS公司

给出了生存分析的结果在里面表二和三和图。2在本研究中研究队列为47.2%。观察期间，17148.4%的患者发生肿瘤复发。正如预测的那样肿瘤大小之间存在显著相关性（HR，1.933；95%置信区间1.429–2.613；P<0.001），TNM分期（HR，2.843；95%CI，2.088–3.871; P<0.001），TopoIIα（心率，2.320；95%置信区间，1.708–3.151；P<0.001），Ki67（心率，1.760；95%置信区间，1.297–2.389；P<0.001）和肿瘤复发发展的单因素分析方法。通过对以下所有因素的多元分析在单变量分析中显著，独立预后指标为TNM分期（HR，3.757；95%CI，2.033–6.945；P<0.001）和TopoIIα（HR，2.002；95%CI，1.429–2.806；P<0.001）。TopoIIα-低组的RFS率与TopoIIα高组相比（55.6%vs.31.7%；P<0.001）。

图2。 Kaplan-Meier生存曲线证明（A）总生存率降低和（B）TopoIIα-高组无复发生存率，（C）Ki67高组总生存率降低。地形IIα，拓扑异构酶IIα。

表二：。 单变量和多变量分析与总生存率相关的因素。

表二：。

单变量和多变量分析与总生存率相关的因素。

特性	单变量分析，HR（95%CI）	P值	多变量分析，HR（95%CI）	P值
年龄		0.322
≤55年	1
>55年	0.848(0.612–1.175)
性别		0.183
男	1
女性	0.688(0.397–1.193)
组织学等级		0.157
分化良好/中等	1
差异化	1.730(0.810–3.693)
肿瘤位置		0.822
左侧	1
右侧	0.959(0.664–1.384)
血清AFP水平（微克/升）		0.284
≤400	1
>400	1.198(0.861–1.558)
TNM阶段		<0.001		0.599
一/二	1		1
IIIa公司	2.265(1.638–3.131)		1.137(0.704–1.836)
肿瘤大小		<0.001		0.014
≤5厘米	1		1
>5厘米	2.472(1.794–3.406)		1.821(1.129–2.937)
Ki67号机组表达		<0.001
低	1
高	2.892(2.093–3.995)
地形IIα表达		<0.001
低	1
高	3.804(2.741–5.278)
TopoIIα-Ki67的表达		<0.001		<0.001
地形IIα（低）或Ki67（低）	1		1
地形IIα（高）和Ki67（高）	4.264(3.030–6.000)		3.569(2.518–5.059)

[一]单变量Cox比例风险回归模型。多变量Cox比例风险回归模型。变量为通过单变量分析确定其预后意义肠段选择（P<0.05）。甲胎蛋白；TNM、，肿瘤结节转移；拓扑异构酶IIα；HR，危险比率；CI，置信区间。

表三。 5年总生存率根据临床病理变量。

表三。

5年总生存率根据临床病理变量。

特性	案例，n（n=353）	5年操作系统，%	P值
年龄			0.319
≤55年	206	51
>55年	147	54.1
性别			0.178
男	309	51.4
女性	44	59.1
TNM阶段			<0.001
一/二	251	61.7
IIIa公司	102	29.3
肿瘤位置			0.821
左侧	92	59
右侧	261	50.9
组织学等级			0.150
良好/中等差异化的	329	51.5
糟糕的差异化的	24	63.1
血清AFP水平（微克/升）			0.281
≤400	233	53.7
>400	120	49.8
肿瘤大小			<0.001
≤5厘米	210	65.7
>5厘米	143	33.5
地形IIα表达			<0.001
低	227	66.5
高	126	23.8
Ki67表达			<0.001
低	222	67
高	131	26.5
TopoIIα-Ki67表达			<0.001
地形IIα（低）或Ki67（低）	270	61.9
地形IIα（高）和Ki67（高）	83	18.2

[一]获得的P值使用对数秩测试。甲胎蛋白；TNM、，肿瘤结节转移；OS，总体生存率；拓扑异构酶IIα。

操作系统

在本研究中研究队列中的患者占52.3%。单变量分析显示肿瘤大小（HR，2.472；95%CI，1.794–3.406）、TNM阶段（HR，2.625；95%CI，1.638–3.131），TopoIIα，2.741–5.278）和Ki67（HR，2.829；95%CI，2.093–3.995）较差OS的预测因素，而年龄、性别、组织学分级、肿瘤位置和血清AFP水平对OS无预后意义。多因素分析表明TNM阶段（HR，3.757；95%可信区间，2.033–6.945）、TopoIIα（HR，2.749；95%可信区间，1.919–3.939）、肿瘤大小（HR，1.938；95%CI，1.203–3.124）和Ki67（HR，1.816；95%CI，1.273–2.589）是独立的预后指标。TopoIIα-低组的OS显著增加与TopoIIα高组相比（66.5%对23.8%；P<0.001）。在Ki67低组与Ki67高组相比（67.0 vs。26.5%; P<0.001）。

讨论

肝癌是一种常见的恶性肿瘤人类死亡率(20,21). 到期肝癌患者的巨大异质性，预后手术可能不同，当前的临床病理因素，包括AFP、TNM分期和肿瘤大小，无法准确预测所有肝癌患者的预后(22). 因此，迫切需要寻找新的肝癌预后和治疗靶点的生物标记物。

肿瘤细胞的增殖状态是反映生物特性的重要参数肿瘤，影响预后和治疗效率直接肿瘤(16). TopoIIα和Ki67是正常和肿瘤细胞增殖的标志物组织；它们的表达水平可以作为预测参数(9,16).

已确定Ki67蛋白是一种传统的增殖标志物，并且各种研究已经探索了Ki67-labeling指数的预测值(17,23——27). 这个Ki-67与临床病理特征的相关性及其在多种癌症类型中的预后意义，包括乳腺癌、垂体腺瘤、喉癌、，肾上腺皮质癌、卵巢癌和淋巴瘤调查，结果相似(17,23——27). 这些以前的研究表明Ki67的表达蛋白质与更晚期的肿瘤有关，强调Ki-67作为预测参数的重要性。

54项研究的荟萃分析，共4996项患者检查了高Ki67对HCC的影响临床病理特征和患者DFS、RFS和OS(28). 结果表明，高Ki67该水平与晚期HCC分期显著相关包括分化不良、肿瘤大和数量增加肿瘤淋巴结转移、肝硬化和静脉侵犯根据以往的研究，本研究证明Ki67的表达与TNM分期、肿瘤大小和AFP水平。通过多元分析，Ki-67是一个独立的OS因子，但与RFS无关。此外，操作系统Ki67-low组的发病率比Ki67高表达组，这可能表明Ki67与肝癌患者预后不良相关。

与Ki67类似，TopoIIα是另一种增殖被认为在生长依赖性中起作用的标记包括DNA复制和染色体分离，因为它能打破DNA双螺旋。TopoIIα为参与DNA复制过程和染色体分离，对细胞生长和发育至关重要(11,9)和可能促进肿瘤细胞生长(29,30).酶浓度在周期内显著上调细胞增殖，并且它们与细胞增殖(31,32). 这个TopoIIα的预后价值已经被不同的不同类型癌症的研究人员(33).

在研究肝癌患者时，Wong等(34)确定TopoIIα表达与高级组织学分级相关，微血管浸润和恶性肿瘤的早期发病，以及TopoIIα蛋白评分高（3级）与化疗无反应性与早期疾病相关死亡。与他们的研究类似，本研究揭示TopoIIα可能在HCC肿瘤细胞核中检测到组织。在本研究的353例HCC组织中，126例（35.7%）表现出高度的表情。此外，TopoIIα与TNM分期、肿瘤大小和高AFP水平。通过多元分析，TopoIIα仍然是OS和RFS的独立因素。此外，与对照组相比，低TopoIIα组的OS和RFS率增加高TopoIIα组。

2001年，Watanuki等(35)报告了70例肝癌切除标本的TopoIIα指数和Ki-67指数，以及TopoIIα较低的患者DFS和OS时间延长。大多数最近，TopoIIα在肝癌中的预后意义进一步得到了证实由Panvichian阐明等(36)研究TopoIIα基因畸变TopoIIα和Ki-67在肿瘤和相应的非肿瘤组织。TopoIIα的过度表达是仅在肿瘤组织中识别；TopoIIα基因扩增在肿瘤或非肿瘤组织中未检测到，并且TopoIIα与Ki-67相关。根据先前的研究本研究探讨了TopoIIα在肝癌中的表达是否为与其他更成熟标记的表达相关增殖（如Ki67）。值得注意的是，本研究TopoIIα表达率与Ki67和TopoIIα的存在预示着RFS降低，这是根据Watanuki早期的工作等(35).

本研究受到其回顾性研究的限制而目前队列中的所有患者都受到以下因素的限制纳入标准。作为低分化的数量本研究中的肿瘤较小，额外的研究来自不同中心的HCC病例样本越多越好值。

总之，TopoIIα和Ki67可能是肝癌患者预后不良因素分析治疗性肿瘤切除。TopoIIα和Ki67的检查可能有帮助将患者分组并建立靶向治疗。因此，在Ki67早期进行辅助治疗（高）或手术后TopoIIα（高）患者可能延长生存期。然而，潜在的机制需要进一步研究。

致谢

作者感谢于英浩教授感谢他在实验中的技术支持。本研究是自然科学重点项目资助福建省基金会（批准号：2014Y0034）和福州总医院创新团队基金（批准号：。2015Y0026）。

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