非肥胖糖尿病小鼠模型中胰岛β细胞内质网应激先于1型糖尿病的发生

女性NOD/ShiLTJ（NOD）和年龄匹配的女性NOD。CB17-Prkdcscid/J（NOD-SCID）小鼠取自Jackson Laboratories（ME Bar Harbor）。CD1小鼠取自Charles River（马萨诸塞州威明顿）。所有小鼠均按照印第安纳大学动物护理和使用委员会批准的方案进行饲养。糖尿病被归类为连续两次血糖水平高于300 mg/dL。使用纯化胶原酶（CIzyme MA；VitaCyte，Indianapolis，IN）和中性蛋白酶（CIzeme BP protease；VitaCyte）的组合从胶原酶灌注胰腺中分离出小鼠胰岛。如前所述，使用分离的胰岛进行葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）研究(15). 用腹腔注射2 g/kg葡萄糖对小鼠进行葡萄糖耐量试验(16). 使用超敏感小鼠胰岛素ELISA试剂盒（伊利诺伊州唐纳斯·格罗夫Crystal Chem）测量血清胰岛素。使用胰岛素原大鼠/小鼠ELISA试剂盒（Mercodia，Winston Salem，NC）测量血清胰岛素原。

采用SYBR Green或Taqman技术通过实时PCR分析逆转录胰岛RNA。上述底漆包括Ins公司-1/2和预Ins2(17);Bip公司,Xbp1、Xbp1s、，和印章(18);塞尔卡2b(19);附件4和Wfs1型(20); 和Pdx1页(16). 用于放大Cd3g公司，引物为：5′-TCAGTCAAGCAAGCAGCCACAGTCAGA-3′（正向）和5′-ATGGAGAGAGAAGGCTCT-3′（反向）。对于2个，使用以下引物：5′-CCTACAAAGTGACCTGAAGG-3′（正向）和5′-ATTCTGTGCTGCCAGTGAGAGG-3’（反向）。Taqman底漆Myd88、Tlr4、Il1b、Ifng、Nfkb1和Irf1来自Applied Biosystems（加利福尼亚州福斯特市）。所有样本均通过标准化至Actb公司消息。所有数据均表示来自至少三个单独隔离的混合胰岛独立测定的平均值。

如前所述进行免疫印迹(21). 为了进行免疫荧光实验，将胰腺固定并切片(16)，并使用兔抗小鼠C/EBP同源蛋白（CHOP）（sc-575，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）和小鼠抗小鼠胰岛素（sc-8033，Santa Cruz Biotechnology）对切片进行染色。Alexa Fluor 568驴抗兔和Alexa Fuor 488驴抗鼠用于二级抗体（Invitrogen，Carlsbad，CA）。使用LSM 700共焦显微镜（纽约州桑伍德蔡司）采集图像。为了进行电子显微镜检查，如前所述，将三只NOD和NOD-SCID小鼠的胰腺分别与多聚甲醛和戊二醛进行心脏灌注后分离出来(20). 透射电子显微照片是在普渡大学生命科学显微镜设施获得的。

用于多核糖体分析研究(22)，MIN6β-细胞未经处理或用1μmol/L thapsigargin或细胞因子混合物（10 ng/mL TNF-α、100 ng/mL IFN-γ、5 ng/mL IL-1β）±1 mmol/L氨基胍或100μmol/LN个^G公司-一甲基-我-精氨酸（l）-NMMA）24、48或72小时。培养结束时，对细胞进行裂解和离心，将所得上清液分层在10–50%蔗糖梯度上，并在40000 rpm的超速离心机中离心2小时。活塞梯度分馏器（BioComp Instruments，Fredericton，New Brunswick，Canada）用于分离梯度，并使用在线紫外线监测仪记录254nm处RNA的吸光度。对于³⁵S摄取分析，MIN6细胞在有或无细胞因子的6孔板中培养24或72小时，然后用100μCi的³⁵S-Met和³⁵添加S-Cys 1 h。然后在SDS加载缓冲液中溶解细胞。在闪烁计数器上计算一部分裂解液，以校正³⁵将S氨基酸摄取量和校正的裂解物体积加载到4–20%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并进行电泳。将凝胶干燥并暴露在X射线胶片上过夜。

所有数据均以平均值±SEM表示。单因素方差分析（带Bonferroni后验）用于两种以上情况的比较，双尾学生t吨该测试用于涉及两种条件的比较。Prism 5软件用于所有统计分析。统计显著性假设为P（P）< 0.05.

饲养在我们动物饲养中心的雌性NOD小鼠在10周龄后表现出自发性转化为糖尿病，到20周龄时糖尿病的累积发病率为78%(图1A). 先前的研究表明，NOD小鼠表现出早期葡萄糖不耐受，这可能归因于第一阶段胰岛素缺乏(10). 为了评估本研究中糖尿病前期阶段的葡萄糖稳态和β细胞功能，雌性NOD小鼠在6周、8周和10周龄时接受葡萄糖耐量测试和血清胰岛素水平。在NOD背景下，将NOD小鼠与年龄匹配的免疫功能低下雌性小鼠（NOD-SCID）进行比较，并与免疫功能低下的雌性小鼠（CD1）进行比较。如所示图1BNOD小鼠在8周和10周时的空腹血糖水平高于糖尿病抵抗株，尽管这些血糖值并没有接近糖尿病水平。尽管葡萄糖耐量试验显示NOD-SCID和CD1小鼠在任何年龄段（基于曲线分析下的相应面积）均无差异，但NOD小鼠在所有年龄段均表现出相对显著的葡萄糖耐量异常，这表明糖尿病前期NOD小鼠的糖稳态发生了细微变化(图1C、E和G). 为了验证葡萄糖稳态的这种改变是由胰岛素分泌缺陷引起的，我们测量了血清胰岛素水平对腹腔内葡萄糖负荷的反应。如所示图1D、F和H，与CD1小鼠相比，NOD小鼠在所有年龄段腹腔内葡萄糖负荷后2分钟和10分钟的血清胰岛素水平均显著降低，这与先前的研究表明第一期胰岛素分泌缺陷一致(10). 重要的是，与CD1小鼠相比，NOD-SCID小鼠在6周龄和8周龄时的胰岛素分泌没有显著差异，但在10周龄时，2分钟胰岛素反应降低。

为了阐明糖尿病前期NOD小鼠葡萄糖稳态的明显缺陷是否归因于β细胞功能障碍，我们对分离胰岛的胰岛素分泌进行了分析。图2A-C结果表明，从各年龄段CD1小鼠分离的胰岛在静态分泌试验中显示出强大的GSIS，在高糖（25 mmol/L）下胰岛素分泌量至少是低糖（2.5 mmol/L.）下的20倍。值得注意的是，与CD1胰岛相比，8周龄和10周龄动物的NOD-SCID和NOD胰岛的GSIS显著降低，而NOD胰岛在10周龄时表现出逐渐恶化的反应。综合起来图1和2表明NOD小鼠在糖尿病前期表现出胰岛素分泌和胰岛GSIS随着时间的推移而减少，而NOD-SCID小鼠表现出轻微的损失，但葡萄糖稳态无明显缺陷。

早期葡萄糖不耐受和β细胞功能障碍的发现促使我们考虑可能导致胰岛素分泌缺陷的途径。与6周龄小鼠胰岛相比，10周龄NOD小鼠胰岛细胞浸润的频率和严重程度更高，如组织学和评分数据所示补充图1A和B随着年龄的增长，胰岛炎的增加表明，入侵免疫细胞局部分泌的促炎细胞因子可能导致NOD小鼠的β细胞功能障碍。从体外研究来看，胰岛和β细胞系与促炎细胞因子的慢性孵育导致未折叠蛋白反应的激活和最终的内质网应激(11,13)但这种情况是否发生在NOD胰岛尚不清楚。为了测试NOD小鼠胰岛中发生的ER应激，我们首先测量了随机喂养的NOD、NOD-SCID和CD1小鼠血清中的胰岛素和胰岛素原水平。如所示图3A与CD1和NOD-SCID小鼠相比，NOD小鼠的血清胰岛素水平随年龄增长而降低。然而，NOD小鼠的胰岛素原水平呈现相反的趋势，10周时胰岛素原水平是NOD-SCID和CD1小鼠的3倍(图3B). 胰岛素原与胰岛素的比值(图3C)在10周龄时，与CD1和NOD-SCID小鼠相比，分别升高了显著的9倍和16倍，这表明ER折叠/处理缺陷。在这方面，先前的电子显微镜研究表明，NODβ细胞在内质网中表现出形态学改变(6). 为了评估NOD小鼠与NOD-SCID小鼠的ER形态，我们进行了透射电子显微镜检查。如中的典型图像所示图3D与NOD-SCID小鼠相比，NOD小鼠的β-细胞分泌颗粒较少，内质网肿胀和碎片较多，核膜附近排列整齐的内质网消失。

为了阐明导致内质网功能障碍的分子机制，我们分离胰岛并进行实时RT-PCR和免疫印迹。为了排除T细胞过度浸润替代NOD小鼠β细胞信号的可能性，我们对T细胞基因进行了RT-PCRCd3g公司（CD3-γ链），发现其信息水平代表<5%的1/2英寸NOD小鼠胰岛中的信息(补充图2A和B). 如所示图4A和B，来自6周龄、8周龄和10周龄NOD小鼠的胰岛显示编码Pdx1的mRNA逐渐减少至10倍以上(Pdx1页)和预胰岛素(1/2英寸). 有趣的是，编码前胰岛素原的前信使核糖核酸(预Ins2，这一物种更能反映编码前胰岛素的基因转录的剧烈变化[17,23])比CD1小鼠6周龄时的水平高出3倍，但到10周时，显著降低了10倍以上(图4C). 这些发现表明，在6周龄（也许8周龄）时，NOD小鼠的胰岛可能处于部分代偿状态，10周龄时似乎无法维持这种状态。接下来，我们检查了同一时期孤立胰岛内质网应激标记物的进展。NOD小鼠的胰岛显示编码蛋白折叠伴侣BIP的mRNA升高(两足动物)与NOD-SCID和CD1小鼠相比(图4D). 鉴于总计新业务流程1NOD小鼠的mRNA只有轻微升高，剪接新业务流程1信使核糖核酸(Xbp1，通过IRE-1α直接反映内质网应激激活的mRNA物种[24,25]). 在所有年龄段都显著升高，与10周龄时的抗糖尿病菌株相比增加了20倍以上(图4E和F). 伴随着两足动物和Xbp1型mRNA增加了10倍印章10周龄时的mRNA(图4G). 10周龄时胰岛提取物的免疫印迹分析显示，NOD动物胰岛中存在CHOP，但糖尿病耐药菌株中没有CHOP(图5A).图5B显示CHOP蛋白在典型的10周龄NOD小鼠胰岛中的胰岛素+细胞细胞核内的定位，而在典型的NOD-SCID胰岛中未发现CHOP染色。

Stoffers及其同事先前的研究(20)，有人认为Pdx1页^+/−适当补偿内质网应激的小鼠部分来自应激反应基因的激活不足（Pdx1）附件4和Wfs1型.附件4编码一种转录因子，该转录因子是激活与氧化应激保护有关的应激相关基因所必需的(26)、和Wfs1型编码一种可能参与调节细胞内钙稳态和颗粒酸化的蛋白质(27–29). 如所示图4H,附件4在NOD小鼠中，mRNA水平不仅不能随着年龄的增长（以及内质网应激的增加）而激活，而且仍然显著低于CD1和NOD-SCID小鼠。有趣的是，尽管Wfs1型6周龄NOD小鼠的mRNA水平升高了近6倍，8周后迅速下降，10周时仍显著低于非糖尿病小鼠(图4I). 编码另一个ER相关Ca的mRNA水平²⁺运输车，塞尔卡2b在10周龄的NOD胰岛中也观察到其急剧下降10倍(图4J).

NF-κB通路在多种细胞应激源下被激活，包括促炎细胞因子和ER应激，以促进宿主细胞的炎症反应。为了确定糖尿病前期NOD胰岛中NF-κB信号是否被激活，我们对NF-κ）B靶基因的子集进行了实时RT-PCR。如所示图6，NF-κB靶点的显著和均匀激活（6–400倍）2号、Myd88、Il1b、Nfkb1、Irf1、Tlr4、，和Ifng公司与年龄匹配的NOD-SCID胰岛相比，在糖尿病前期10周龄的NOD胰岛中观察到。这些数据表明，细胞因子信号、内质网应激和炎症之间存在细胞内串扰，可能有助于促进NOD小鼠β细胞的功能障碍或死亡。

内质网应激触发由RNA/ER样激酶（PERK）介导的真核启动因子2-α（eIF2-α）磷酸化调节的蛋白激酶；磷酸化eIF2-α阻断大多数细胞mRNA的翻译起始，以减少内质网蛋白负荷(30,31). 我们询问细胞暴露于细胞因子是否会导致翻译起始阻滞，这与内质网应激反应一致。为了直接评估翻译效果，我们对MIN6β-细胞的总RNA进行蔗糖梯度沉淀，然后通过254 nm的梯度监测紫外线吸收率，这是一种称为多核糖体分析的技术(32).图7A显示了80S核糖体物种以及来自控制MIN6细胞RNA的多核糖体（包含多个与单个转录物结合的核糖体）的位置。在这些对照细胞中，多核糖体与80S单体的比率（P/M比率）为1.59。用1μmol/L thapsigargin（一种肌内质网钙ATP酶[SERCA]泵抑制剂和内质网应激诱导剂）对MIN6细胞进行6小时的处理，导致多糖体部分的消散，P/M比降低到0.85，这与多核糖体的起始受阻和由此产生的径流一致(图7A). 核糖体的流失和P/M比率的下降被认为是翻译起始阶段阻滞的标志(22). 在25 mmol/L葡萄糖下用细胞因子（IL-1β、TNF-α和IFN-γ）治疗MIN6细胞的一个时间过程中，多核糖体部分逐渐丢失，24小时后出现P/M比率下降(图7B)（即使在5 mmol/L葡萄糖中，P/M比率也会下降，数据未显示）。为了验证这种多核糖体的损失导致总蛋白质合成的减少，我们将MIN6细胞与细胞因子孵育不同的时间，然后与³⁵S-Met和³⁵S-Cys持续1h，如所示图7C，对细胞总摄取量进行加载校正后³⁵S、 细胞因子治疗导致全球总量下降³⁵S在72小时掺入蛋白质。由于细胞因子快速激活iNOS，我们接下来询问iNOS的抑制是否可以防止细胞因子孵育延长后的起始阻断。图7D显示MIN6细胞与非特异性一氧化氮合酶抑制剂同时孵育我-NMMA在暴露于细胞因子72小时后对起始阻断无影响（使用第二种更选择性的iNOS抑制剂氨基胍获得相同数据；数据未显示）。

胰岛β细胞功能障碍早于1型糖尿病的发生。在NOD小鼠和人类中，在糖尿病前期观察到葡萄糖负荷导致第一阶段胰岛素分泌减少(7–9). 重要的是，糖尿病控制和并发症试验的结果表明，进入研究的具有残余β细胞功能的个体低血糖和糖尿病微血管并发症的发生率较低(33). 阐明导致1型糖尿病患者β细胞功能障碍的潜在分子途径可能是一种保护胰岛素分泌从而减少糖尿病并发症的治疗方法。迄今为止，尚未明确确定免疫细胞浸润与胰岛功能障碍之间的联系机制。在本研究中，我们使用一个已建立的1型糖尿病小鼠模型来证明糖尿病前期NOD小鼠β细胞中NF-κB和ER应激通路的激活。这些途径的激活可能会加速疾病前期的β细胞死亡，从而促进进一步的抗原暴露和T细胞活化。

在自身免疫性1型糖尿病中，β细胞内质网应激的发生在很大程度上仍是推测性的。鉴于NOD小鼠中出现显著的胰岛炎，我们很容易推测，巨噬细胞和辅助T细胞局部释放的促炎细胞因子在启动β细胞炎症（通过NF-κB）中的作用，最终导致胰岛素分泌的早期缺陷。炎症和内质网应激之间的相互作用一直是一些涉及β细胞系和胰岛的研究的重点，但从未在NOD小鼠的胰岛中得到证实。我们在这里显示，NOD胰岛显示出NF-κB信号和ER应激途径的显著激活。然而，很难确切地知道NF-κB信号是否导致内质网应激或副病毒(34). 然而，内质网应激的一个特征是翻译起始因子eIF2-α的磷酸化(35)β细胞系与IL-1β或促炎细胞因子混合物孵育时也会出现这种情况(36,37). eIF2-α的磷酸化阻断了整体翻译起始，以减轻内质网蛋白负荷(31,35). 在这项研究中，我们首次通过多核糖体分析和³⁵MIN6β-细胞对S-Met/Cys的摄取在慢性（天）暴露于促炎性细胞因子的反应中表现出整体翻译起始下降，这一效应与暴露于thapsigargin后观察到的类似。

细胞因子可能导致内质网应激的确切原因尚不清楚，但一些研究表明，通过iNOS产生的一氧化氮下调SERCA2B(11–13). SERCA2B是一种ATP依赖性钙²⁺部分负责钙运输的泵²⁺进入内质网腔，从而维持陡峭的内质网：胞浆钙²⁺梯度(19,38,39). 虽然我们使用iNOS抑制剂的研究没有逆转体外长期细胞因子暴露的翻译起始阻断，但它们并不完全排除一氧化氮的作用，因为其他关键ER蛋白（例如Wfs1和ATF4）的表达缺陷以及其他应激诱导蛋白（例如NAPDH氧化酶）的汇合[40])从长远来看，可能有助于翻译封锁。内质网应激也能激活NF-κB(34); 因此，糖尿病前期NODβ细胞可能会发生自我维持级联反应，促进胰岛素分泌缺陷。

先前的研究表明，与NOD-SCID小鼠相比，糖尿病前期NOD小鼠的β细胞质量减少（～30%），这表明β细胞质量的减少（与我们在这里显示的葡萄糖刺激胰岛素释放缺陷无关）也可能导致糖尿病前期NOT小鼠的相对葡萄糖不耐受(9). 我们的研究没有说明糖尿病前期NOD小鼠β细胞质量的减少是否是ER应激的直接后果。有趣的是，Satoh等人最近的一项研究(14)表明全球印章NOD背景中的缺失不能防止β细胞丢失或糖尿病的发展。此外，使用分离的啮齿动物和人类胰岛进行的研究表明，内质网应激可能不会直接导致β细胞死亡，而是导致胰岛素分泌缺陷(11). 在这方面，我们的研究结果将糖尿病前期NOD小鼠的ER应激程度与β细胞分泌缺乏的严重程度联系起来。

最后，我们研究中的一个显著发现是10周龄NOD小鼠的Pdx1 mRNA和蛋白质水平降低。Stoffers和同事(20)最近显示附件4和Wfs1型被β-细胞中的Pdx1直接激活；在我们8周龄和10周龄的NOD动物中，这两个基因都减少了。因此，与2型糖尿病一样，Pdx1水平可以作为1型糖尿病β细胞应激敏感性的晴雨表。有趣的是，Pdx1页NOD-SCID小鼠的mRNA水平也降低，这与体外胰岛葡萄糖反应性轻度不足和高水平两足动物mRNA，Xbp1型mRNA和血清胰岛素原与CD1小鼠的比较。这些发现可能与NODβ细胞的固有遗传特征有关，其增强了对促炎细胞因子的敏感性；事实上，尽管NOD-SCID小鼠的T细胞和B细胞功能失调，但它们的巨噬细胞活性和持续分泌TNF-α(41)可能导致这些动物的轻度β细胞功能障碍。

我们的数据支持这样的结论：在NOD小鼠中，胰岛β细胞功能障碍先于坦率的高血糖发作，而与β细胞质量的大量减少无关。虽然进一步的研究显然有必要阐明内质网应激级联对1型糖尿病中β细胞丢失的确切贡献，但我们的研究表明，减少内质网压力来源或增强β细胞内在应对内质网紧张的能力的方法可以在自身免疫的情况下保护β细胞的功能。

本研究得到了青少年糖尿病研究基金会（JDRF）（授予R.G.M.）、美国国立卫生研究院（NIH）（R01 DK083583授予R.G.M）和印第安纳州临床和转化科学研究所（NIH授予UL1 RR025761授予J.L.R.）的资助。S.M.C.由NIH培训拨款（T32 DK065549）支持。Y.N.得到了武田-美国糖尿病协会基于导师的博士后奖的支持。A.T.T.得到了美国心脏协会十年前奖项的支持。S.C.C.获得JDRF博士后奖。

未报告与本文相关的潜在利益冲突。

S.A.T.研究了数据并撰写了手稿。Y.N.、A.T.T.和S.M.C.研究了数据并审阅了手稿。N.D.S.和S.C.C.研究了数据。C.E.-M.和J.L.R.参与了讨论并审阅了手稿。B.M.研究了数据，审查并编辑了手稿。R.G.M.构思了实验，研究了数据，并撰写了手稿。S.A.T.和R.G.M.是这项工作的担保人，因此，他们可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。

作者感谢L.Narayanan（印第安那大学）和B.Tersey（印第安纳大学）提供的技术援助。作者还想感谢R.Wek（印第安纳大学）的有益讨论；M.McDuffie（弗吉尼亚大学）对手稿的批判性阅读；D.Sherman（普渡大学生命科学显微镜设施）提供电子显微镜图像；和VitaCyte，LLC慷慨提供胶原酶和中性蛋白酶用于胰岛分离。