游离脂肪酸通过诱导细胞周期抑制剂p16和p18阻断葡萄糖诱导的小鼠β细胞增殖

匹兹堡大学动物护理和使用委员会批准了小鼠研究。小鼠被安置在温度、湿度可控、光暗循环12小时的环境中，可以自由进食和饮水。阿隆索等人（Alonso et al(28). 用吸入的2%异氟烷对10至12岁雄性C57BL/6J小鼠进行麻醉，并将微雷诺导管（MRE-025；Braintree Scientific）插入左侧股动脉和静脉，经皮下隧道从上背部皮肤流出，用胶带绑在连接颈后肌的电线上（792500；a-M Systems），并连接至360°双通道旋转接头（375/D/22QM；Instech）。通过使用注射泵（R99-EM；Razel Scientific Instruments）连续7μL/h输注含有20单位/mL普通肝素（APP Pharmaceuticals）的无菌盐水来维持导管通畅。

导管插入术后3天开始静脉输液(图1A). 所有血样均取自未经处理的清醒小鼠的动脉导管；通过静脉导管进行输液。在整个实验过程中提供了Chow。在时间0、8、24、48、72和96小时采集非妊娠早晨动脉血样本。测量全血葡萄糖，冷冻血浆以备将来测量胰岛素，将红细胞重悬于含有100单位/mL肝素的20μL盐水中并再次使用。在0次血样采集后，开始输注：SAL（0.9%生理盐水，200μL/h）、LIP（Liposyn II 20%，100μL/h+0.9%生理盐，100μL/h）、GLU（50%葡萄糖，100μL/h+0.9%盐水，100μL.h）或L+G（Liposym II，100μL/h+50%葡萄糖，100L/h）。所有输液均含有肝素（2单位/h）和溴脱氧尿苷（BrdU，100μg/h）。输注后立即处死小鼠，解剖器官进行组织学分析，或分离胰岛进行分子分析。

使用Ascencia XL血糖仪测量血糖。采用放射免疫法（Linco敏感性大鼠胰岛素放射免疫分析试剂盒；Millipore）测定血浆胰岛素。采用比色法（Roche）对心脏穿刺到冰上预冷试管中获得的终末血样进行FFA测定。

胰腺用Bouin固定剂固定4h，石蜡包埋。TUNEL、BrdU和细胞周期蛋白D2染色如所述进行(28). 对于油红O，肝脏在最佳切割温度下冷冻；10μm冰冻切片用福尔马林固定，用60%异丙醇冲洗，用0.3%油红O在60%异丙酚中染色15分钟，苏木精复染。对于增殖细胞核抗原（PCNA）和Ki67染色，石蜡切片被封闭在1%BSA/5%山羊血清/0.1%triton X-100中，与抗PCNA（1:500；Santa Cruz Biotechnology）或抗Ki67（1:200；Neo标记物）和抗胰岛素（1:500，Dako）在4°C孵育过夜，与二级抗体孵育30分钟，并安装了Hoechst。定量的β细胞数量如下：2147±116（BrdU）、1814±144（TUNEL）、1675±147（PCNA）和1970±204（Ki67）。使用Olympus Fluoview共焦显微镜或Olympus Provis显微镜进行显微镜检查。

通过导管胶原酶注射和Ficoll分离分离胰岛(28). 对于免疫印迹，胰岛在分离后立即在含有100 nmol/L原钒酸钠的PBS中清洗，并冷冻以备将来分析。在胰岛细胞培养实验中，将胰岛细胞接种在含有10%FBS的RPMI和含有5.5 mmol/L葡萄糖的青霉素/链霉素（胰岛培养基）的玻璃盖玻片上。分散的胰岛细胞在含有2 mmol/L或15 mmol/L-葡萄糖的胰岛培养基中培养72 h，其中0.5%BSA或0.4 mmol/L-FFA与0.5%BSA结合(19)；最后24小时添加BrdU。

大鼠胰岛素瘤（INS-1）细胞（由宾夕法尼亚大学多丽丝·斯托弗斯（Doris Stoffers）善意提供）在INS-1培养基中培养：含有10%FBS、11 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L-HEPES、2 mmol/L我-谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠、青霉素/链霉素和50μmol/Lβ-巯基乙醇。为了进行增殖分析，将INS-1细胞贴在盖玻片上，然后在INS-1培养基中培养24小时，该培养基含有2或11 mmol/L葡萄糖和0.5%BSA或0.4 mmol/L-亚油酸、油酸或棕榈酸，或含有7:2:1亚油酸：油酸：棕榈酸的混合物，所有这些都与0.5%BSA结合。在最后一小时的培养中添加BrdU；用4%多聚甲醛固定的细胞进行BrdU和Hoechst免疫染色，但用DNA酶进行抗原回收。对于免疫印迹，INS-1细胞在含有0.5%BSA或BSA-结合FFA的INS-1培养基中培养24小时。对于小干扰RNA（siRNA）实验，在增殖试验或免疫印迹之前，以100 nmol/L的速度应用靶向大鼠p16或p18的siRNA池（Dharmacon）24小时。

将整个胰岛或INS-1细胞置于含有125 mmol/L Tris pH 6.8、2%十二烷基硫酸钠、1 mmol/L-二硫苏糖醇、20μg/mL 4-氨基苯基甲烷磺酰氟盐酸盐（APMSF）和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中进行超声处理；SDS-PAGE分离；转移到硝化纤维素；并在5%牛奶/PBS吐温中封闭。抗体包括cyclin D2（新标记物）、p16、p18、p21（圣克鲁斯生物技术）、p27（BD Pharmingen）、tubulin（钙生物化学）、抗鼠和抗兔（Jackson ImmunoResearch）。ECL或ECL+（Amersham Pharmacia Biotech）在胶片上收集数据。

数据表示为平均值±SE。所有统计分析均使用Prism（GraphPad软件）进行。P（P）值由双尾学生计算t吨当Bartlett检验显示，当两个以上的组进行比较时，使用对数转换数据进行单因素方差分析和Newman-Keuls事后分析P（P）组间方差不相等，或当两个连续变量相互作用时通过线性回归检验，均<0.01。P（P）<0.05被认为是显著的。

为了测试FFA是否改变葡萄糖刺激的β细胞增殖，小鼠连续静脉输注4天(图1A)含生理盐水（SAL）、脂溶蛋白II（LIP）、葡萄糖（GLU）或脂溶蛋白Ⅱ和葡萄糖（L+G）。葡萄糖输注导致血糖中度持续升高(图1B)在一定程度上刺激β细胞增殖(28). 虽然单独输注脂质（LIP）可降低血糖，但与单独葡萄糖（GLU）相比，脂质与葡萄糖的混合（L+G）并不会改变血糖。4天输注平均血糖的比较(图1C)结果表明，GLU和L+G小鼠的平均循环葡萄糖水平相似，显著高于SAL和LIP小鼠。

GLU和L+G小鼠相对于SAL和LIP小鼠的血浆胰岛素水平暂时升高(图1D). GLU和L+G小鼠在4天输注期间的平均胰岛素水平显著高于SAL对照组(图1E). GLU和L+G小鼠的平均血浆胰岛素水平没有差异。

脂质输注使LIP和L+G小鼠的血浆FFA水平增加到高于SAL和GLU小鼠的水平(图1F). 肝脏脂肪变性在LIP和L+G小鼠中很明显，证实了脂质输送到组织中(图1G). 因此，在控制和葡萄糖刺激的条件下，持续静脉输注脂质成功地提高了FFA水平。

数十年来，多名研究人员的工作已经产生了无可争议的证据，证明当葡萄糖水平也升高时，FFA会导致体外β细胞死亡(11). 为了确定4天输注脂类和葡萄糖是否会增加体内β细胞死亡，输注后获得的胰腺切片通过TUNEL染色分析细胞死亡(图2A). 虽然在阳性对照组切片中很容易检测到细胞死亡，但细胞死亡在L+G切片中很少见，并且与其他组相比没有增加(图2B).

灌注后胰腺切片用组织化学方法检测β细胞增殖(图3A和B). 为了了解在基础条件下升高FFA是否改变β细胞增殖，对LIP和SAL小鼠进行了比较。在LIP和SAL小鼠的切片中，胰岛素和BrdU共染细胞的出现频率相似，表明在基础条件下，FFA升高既不增加也不减少累积β细胞增殖(图3C).

如预期(28)中度持续4天高血糖增加GLU小鼠β细胞增殖(图3C). 为了确定FFA是否在葡萄糖刺激条件下改变增殖，将L+G小鼠与GLU小鼠进行比较。通过BrdU掺入测定，L+G小鼠的β细胞增殖低于GLU小鼠(图3C)与SAL和LIP对照组相当，尽管血糖和血浆胰岛素水平与GLU小鼠相似(图1B-E). 这些数据表明，在体内葡萄糖刺激条件下，循环FFA对β细胞具有抗增殖作用。

为了证实体内脂质输注的抗增殖作用，通过细胞周期指标PCNA和Ki67的免疫染色测定β细胞复制。这些标记物在死亡时测量增殖，而不是在4天输注过程中的累积。对于PCNA和Ki67，增殖和胰岛素的β细胞免疫反应百分比在SAL和LIP小鼠之间没有差异，但在GLU小鼠中显著高于L+G小鼠，这证实了脂质输注不会改变基础条件下的β细胞增殖，而是阻止了葡萄糖诱导的增殖(图3D和E). 在4天的输注过程中，任何一组的β细胞质量都没有显著改变(图3F–H)；有趣的是，单个β细胞的横截面积在LIP小鼠中较小，而在L+G小鼠中较大(图3I).

脂质输注对β-细胞的抗增殖作用可能间接来自于对其他组织的影响，也可能来自于除FFA以外的介质。为了了解FFA是否有直接阻断葡萄糖刺激的β细胞增殖的能力，将小鼠胰岛细胞在低（2 mmol/L）或高（15 mmol/L.）葡萄糖中与BSA对照组或高糖中培养，并加入BSA偶联FFA。FFA混合物旨在模拟Liposyn II的脂肪酸含量，其中亚油酸、油酸和棕榈酸的比例为7:2:1。β细胞增殖易于检测，在高糖状态下更为频繁(图4A). 量化证实葡萄糖增加了原代β细胞增殖(图4B). 重要的是，FFA混合物在体外阻断了葡萄糖刺激的β细胞增殖，证实了FFA直接对原代胰岛细胞培养物产生抗增殖作用。

FFA可能作用于原代胰岛细胞培养物中的其他细胞类型，如其他内分泌细胞或成纤维细胞，这些细胞可以向β细胞发送次级抗增殖信号。为了确定FFA是否直接作用于β细胞，将β细胞衍生转化细胞系（INS-1）与BSA对照或FFA混合物在低或高糖中培养，并测量增殖(图4C). 该细胞系基底细胞增殖频繁。然而，葡萄糖显著增加了基线以上的增殖，并且FFA混合物再次阻止了葡萄糖依赖性增殖增加(图4D).

为了了解FFA混合物的哪个成分对β细胞具有抗增殖作用，将INS-1细胞与每个单独成分的FFA在高糖中培养。定量分析表明，亚油酸和棕榈酸均能阻止高糖环境下的细胞增殖；油酸处理的减少不显著(图4D). 因此，FFA，特别是亚油酸和棕榈酸，直接作用于β细胞以阻止葡萄糖诱导的增殖。

细胞周期蛋白D2是啮齿动物β细胞增殖的重要调节因子(31–35)，在高血糖反应中上调并重新定位到细胞核(28). 我们假设FFA可能干扰葡萄糖介导的细胞周期蛋白D2蛋白诱导或核定位。为了确定FFA是否阻止体内高血糖引起的胰岛细胞周期蛋白D2表达增加，输注4天后分离胰岛并进行免疫印迹。出乎意料的是，尽管LIP小鼠的胰岛细胞周期蛋白D2水平低于SAL对照组，但GLU小鼠的细胞周期蛋白D1蛋白上调不受脂质共融的影响(图5A和B). 当通过免疫印迹分析无脂质暴露（SAL或GLU）小鼠输注期间的平均血糖水平时，胰岛细胞周期蛋白D2蛋白的表达，观察到显著的正相关(图5C). 支持FFA不会改变胰岛细胞周期蛋白D2蛋白的葡萄糖诱导的概念，在脂质暴露（LIP或L+G；图5C). 如前所述(28)高血糖引起的细胞周期蛋白D2的增加似乎是翻译后介导的，因为与SAL小鼠相比，GLU小鼠的细胞周期素D2 mRNA没有显著增加(图5D). 虽然在低血糖条件下，脂质输注降低了细胞周期蛋白D2 mRNA的水平，但在葡萄糖刺激条件下，脂类并没有显著降低细胞周期蛋白D2mRNA的表达。总之，提高体内FFA水平并不能阻止葡萄糖介导的细胞周期蛋白D2蛋白的诱导。

为了研究FFA暴露是否可以通过阻止细胞周期蛋白D2在高血糖状态下重新定位到细胞核来阻止增殖，对注射后小鼠的胰腺切片进行了细胞周期蛋白D_2的免疫染色(图5E). 事实上，在L+G小鼠的胰岛细胞核中很容易检测到细胞周期蛋白D2蛋白，这表明FFA并没有阻止细胞核定位，反而可能作用于细胞周期蛋白D_2下游以减少增殖。

D-细胞周期蛋白结合并激活细胞周期依赖性激酶（Cdk）-4和-6，调节进入细胞周期的G1-S转换(36,37). 细胞周期抑制剂作用于D-cyclins下游，阻止细胞周期进展；已知细胞周期蛋白抑制蛋白/激酶抑制蛋白（Cip/Kip）抑制剂p21/p27和INK4家族成员p16/p18都能调节β细胞的增殖(31,38–43). 我们假设FFA可能通过诱导细胞周期抑制剂的表达来阻止增殖。输注后分离的胰岛的免疫印迹显示，在L+G胰岛中，p21和p27均未被显著诱导（数据未显示）。然而，这两个p16(图6A和B)和第18页(图6C和D)与所有其他组相比，从L+G小鼠分离的胰岛中的蛋白质水平显著诱导。为了证实FFAs直接增加β细胞中细胞周期抑制剂的表达，用脂肪酸处理INS-1细胞并进行免疫印迹。虽然亚油酸：油酸：棕榈酸混合物没有增加p16或p18的表达，可能是因为油酸对INS-1细胞的保护作用，但单独用棕榈酸处理可以诱导p16和p18蛋白的表达(图6E-G). 因此，体内外FFA的抗增殖作用可能通过诱导细胞周期抑制剂p16和p18介导，后者可阻断D-细胞周期蛋白下游的细胞周期。

为了确定FFA阻断增殖是否需要p16或p18，采用了敲除方法。用针对任一p16的siRNA处理INS-1细胞(图7A和B)或p18(图7C和D)与干扰对照siRNA相比，每种抑制剂都表现出适度但显著的抑制作用。当在干扰siRNA存在的情况下测量INS-1细胞增殖时，棕榈酸阻止了葡萄糖诱导的增殖(图7E)如之前的实验所示(图4D). 有趣的是，p16或p18的敲除完全消除了棕榈酸在INS-1细胞中的抗增殖作用，这表明FFA阻断β细胞增殖可能需要p16和p18。

这些研究描述了体内脂肪毒性的一种新形式：抑制葡萄糖刺激的β细胞增殖。如果FFA限制β细胞增殖以应对其他刺激，如肥胖和胰岛素抵抗，这一过程可能会影响β细胞质量的增加和2型糖尿病的风险。这一发现也可能与1型糖尿病有关；当免疫保护工具发展到足以进行β细胞再生治疗时，急性胰岛素不足时出现的FFA升高可能会损害β细胞对治疗的增殖反应。

本研究的优势包括使用一个精心控制的静脉输液系统，直接评估体内基础和增殖刺激条件下升高FFA的影响，体外研究验证FFA直接作用于β细胞，以及抗增殖作用所需的两种细胞周期抑制剂的新鉴定。我们的输液系统允许在体内环境中操作单个变量；基因改变或饮食诱导肥胖等干预措施引入了多个变量。尽管目前尚不清楚高血糖导致适应性β细胞增殖的机制是否与肥胖或胰岛素抵抗相似，但各种类似情况，如β细胞分泌胰岛素负荷增加，下游信号如胰岛素受体底物2和细胞周期蛋白D2，以及细胞内葡萄糖代谢在肥胖相关增殖中的作用，表明存在潜在重叠区域(4,7,10,28,35).

尽管近十年来人们一直假设FFA对β细胞具有抗增殖作用(17)并在体外观察到(18,21)，到目前为止，体内证据还不支持这一假设(22–25). 我们的数据集提出了一个有趣的区别，即基底刺激和增殖刺激设置之间的差异。我们的研究结果表明，FFA不会改变基底细胞增殖，但会阻止葡萄糖刺激的增殖。一些实验已经观察到FFA在基本营养条件下对β细胞的体外增殖作用(19,20)和体内(24). 在我们的实验中，LIP小鼠的葡萄糖和胰岛素水平低于SAL小鼠，这可能是由于该组食物摄入量减少，总热量和碳水化合物负荷降低，从而增加了低血糖、低胰岛素、，或营养不良。

一些研究已经检测了高脂对大鼠β细胞增殖的影响；然而，没有一种方法可以直接比较无FFA和有FFA升高时的刺激增殖。一项重要研究发现，Zucker肥胖大鼠胰脏切除术后，其血脂升高，β细胞质量恢复良好(22). 然而，胰岛切除术并没有增加β细胞增殖，胰岛新生被认为是β细胞质量扩张的原因，限制了关于FFA对β细胞增殖影响的结论。三项研究测量了大鼠静脉输注脂质后的β细胞增殖。在其中一项研究中，脂质对增殖的影响仅在未刺激的状态下进行了检测(24). 在第二种情况下，周期性葡萄糖暴露不会诱导增殖，从而阻止了有关周期性FFA暴露对受刺激增殖影响的结论(25). 在第三项研究中，在2个月或6个月大鼠体内连续72小时将脂质与葡萄糖混合(23). 有趣的是，L+G大鼠的β细胞增殖与2个月龄的盐水对照组相当，与我们目前的小鼠数据相似，但在6个月龄时与盐水对照组相比有所增加。由于没有提出单独的葡萄糖控制，因此无法推断脂质共融对葡萄糖刺激的增殖的影响。因此，我们的研究首次将脂质作为一个变量进行分离，并比较低FFA和高FFA状态下体内刺激的β细胞增殖。

FFAs的急性升高导致胰岛素抵抗（rev.in15)；胰岛素抵抗是β细胞增殖的有力刺激因素(35). 虽然我们在本研究中没有测量胰岛素敏感性，但FFAs的抗增殖作用与外周胰岛素抵抗的变化无关，因为当β细胞在培养中暴露于FFAs时会产生这种作用，并且胰岛素抵抗预计会增加而不是减少β细胞增殖。关于FFA可能在β细胞水平诱导胰岛素抵抗，从而阻断胰岛素增殖作用的有趣假设尚待验证。因为葡萄糖的增殖作用需要葡萄糖代谢(8)，观察到的脂质对葡萄糖诱导的增殖的负面影响可能与FFA的代谢影响有关，包括抑制葡萄糖氧化(16,44).

乍一看，FFA的抗增殖作用似乎与高脂肪饮食暴露的显著促增殖作用不一致。然而，营养过剩与其他潜在的扩散驱动因素有关(4). 循环FFA水平升高并不是早期补偿性高脂肪饮食暴露的一贯特征，因为胰岛素能有效抑制脂肪分解(45). 从理论上讲，人们可能预测在高FFA的情况下，没有扩大β细胞质量的进化压力，这将发生在狩猎采集饮食中营养缺乏的情况下。

在我们的模型中，联合高血糖和FFA不会增加体内β细胞死亡。这可能是由于高血糖的程度，高血糖低于体外诱导糖脂毒性的葡萄糖浓度(11)，或与时间有关。FFA对β细胞的有害影响随暴露时间而变化(11)；4天代表中间持续时间，可能产生不同于急性或慢性接触的影响。

FFA如何增加INK4家族细胞周期抑制剂的表达尚不清楚；然而，p16位点附近的基因组多态性可以预测2型糖尿病的风险，这一观察结果对我们的发现更加重要(46). 过氧化物酶体增殖物激活受体，脂质激活的核受体，增加间充质细胞中p16的表达(47). 有趣的是，p16是衰老的主要介质，在长期高脂肪饮食暴露后，在β细胞中观察到衰老(48). 另一方面，在高脂饮食8周后，当肥胖或胰岛素抵抗介导的β细胞增殖显著增加时，胰岛p16水平降低(49). 需要进一步研究来剖析FFA的抗增殖作用机制。

令人惊讶的是，p16或p18的敲除足以缓解FFA对增殖的抑制，这表明两者都是抗增殖作用所必需的。我们推测，p16和p18下游的信号以这样一种方式相互作用，即一个信号的减少不允许另一个的作用，从而导致两者的明显需求。有趣的是，p16敲低后，葡萄糖刺激的INS-1细胞增殖失去了统计意义，这表明p16可能在低血糖状态下抑制增殖。基于棕榈酸对INK4表达的适度增加和siRNA的适度减少，似乎细胞INK4含量的相对较小变化能够显著影响增殖速度。在小鼠中，p16或p18的缺失被另一个的存在所补偿，这是在基础条件下通过胰岛细胞增殖来测量的(50). 未来的实验将确定FFA在体内β细胞中的抗增殖作用是否需要p16和p18。

总之，FFA和葡萄糖的适度升高会导致适应性β细胞增殖相关的体内糖脂毒性。如果FFA也能抑制肥胖和胰岛素抵抗引起的细胞增殖，这可能是糖尿病前期患者β细胞质量膨胀失败的重要机制。我们研究结果的一个合理延伸是推测FFA的抗增殖作用可能代表p16和2型糖尿病遗传风险之间难以捉摸的联系。我们希望这项工作能够导致治疗干预，扩大β细胞质量以预防糖尿病。

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款HL063767（C.P.O.）、DK067351和DK077096（A.G.-O.），DK076562和DK046204（L.C.A.）以及美国糖尿病协会拨款7-11-BS-04（L.C.A）的支持。

没有报告与本文相关的潜在利益冲突。

J.P.、D.H.、R.S.和M.A.进行了实验。L.C.R.高效地组织了小鼠输液室。B.Z.给小鼠插管。C.P.O.和A.G.-O.参与了讨论并修改了手稿。L.C.A.构思并指导了实验，为数据收集做出了贡献，并编写和修改了手稿。

作者感谢匹兹堡大学的安德鲁·斯图尔特（Andrew Stewart）、鲁潘吉·瓦萨瓦达（Rupangi Vasavada）、唐·斯科特（Don Scott）和罗伯特·奥多尔蒂（Robert O'Doherty）的深思熟虑。