坎地沙坦通过恢复乙醛酶-I功能减轻糖尿病视网膜血管病变

如前所述培养BREC和BRP(26)。BREC的通道数在3到6之间，BRP的通道数为3到7。请参阅在线附录，网址为http://diabetes.diabetesjournals.org/cgi/content/full/db10-0552/DC1有关Ang II和坎地沙坦治疗细胞的详细信息。

如前所述，BRP凋亡通过流式细胞术通过使用膜联蛋白-荧光素异硫氰酸盐（FITC）和碘化丙啶（TACS AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒，美国明尼阿波利斯研发系统公司）双重染色进行定量(12)。流式细胞术没有评估BREC凋亡，因为有报道称，用这种方法定量BREC中的凋亡是不可靠的(27)。在96孔板中进行BREC凋亡，并根据制造商的说明，使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche Diagnostics，NSW，Australia）通过转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色进行检测。用300 nmol/l DAPI对细胞进行1分钟的复染，以观察细胞核。使用尼康Eclipse TE2000-U显微镜和数字视距相机（尼康，梅尔维尔，纽约，美国），并与运行NIS Elements F2.20（尼康）的计算机接口，捕获了三个不重叠的场/井。

为了确定Ang II是否影响GLO-I活性，如前所述制备细胞裂解物，并测定10μg裂解物(12)。为了测量mRNA水平，使用Trizol（Invitrogen，Vic，Australia）从BREC或BRP中提取0.5μg总RNA，并进行DNA酶处理和逆转录(26)。使用SYBR Green UDG Mater Mix（Invitrogen）和ABI 7900HT序列检测系统（澳大利亚维多利亚州应用生物系统公司）进行实时PCR检测GLO-I的mRNA水平。引物详见在线附录（表S1）。

如前所述，收集细胞并用硝酸还原酶处理以将硝酸盐还原为亚硝酸盐(12)。不^•在细胞中使用2,3-二氨基萘进行定量(28)。有关更多详细信息，请参阅在线附录。

程序符合澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）的《科学目的动物护理和使用规范》，并得到了阿尔弗雷德医学研究和教育区（AMREP）动物伦理委员会的批准。雌性8周龄Ren-2大鼠来自AMREP动物服务公司。从动物研究中心（澳大利亚西澳大利亚州珀斯）获得8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠，作为Ren-2大鼠研究的年龄匹配对照。所有大鼠都可以自由享用正常的鼠食和饮用水。他们被安置在一个稳定的环境中，保持在22±1°C（12小时光-暗循环）。Ren-2大鼠被随机分为以下组：1)非糖尿病对照，2)糖尿病控制，以及三)糖尿病+坎地沙坦（5 mg/kg/天，灌胃）。为了让大鼠成为糖尿病患者，他们隔夜禁食，并在大鼠尾部静脉注射链脲佐菌素（50 mg/kg，0.1M柠檬酸缓冲液；Sigma-Aldrich）(13，15，25)。两到三天后，大鼠开始使用坎地沙坦治疗4或20周。糖尿病大鼠每2天皮下注射胰岛素（Humulin，Eli Lilly Co.，USA，2单位）。每个月测量体重。每月使用尾袖法测量收缩压（AD Instruments，CO Springs，CO，USA）(13，15，25)。使用Accu-check Advantage II血糖仪（瑞士巴塞尔Grenzacherstrasse罗氏公司）测定血糖。在组织采集之前，用戊巴比妥（60 mg/kg，Sigma-Aldrich）麻醉大鼠。

如前所述，测量视网膜大血管中的脱细胞毛细血管和白细胞粘附(13，26)。有关更多详细信息，请参阅在线附录。

如前所述，通过实时PCR测定视网膜mRNA水平(26)。对从视网膜提取的1μg总RNA进行DNA酶处理和反转录。检测血管内皮生长因子（VEGF）、细胞间黏附分子-1（ICAM-I）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、GLO-I和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA水平。有关引物的描述，请参见在线附录（表S1）。

对于GLO-I活性，如在线附录所述制备快速冷冻的整个视网膜，并如BREC和BRP所述测定10μg视网膜。通过直接ELISA在GLO-I测定产生的未分析的视网膜裂解物中检测到组织MGO-AGE和arg嘧啶，一种特异性MGO-AGE。有关更多详细信息，请参阅在线附录。用竞争ELISA定量血浆MGO-AGEs和总AGEs（包括MGO-AGEs在内的所有AGEs）。有关更多详细信息，请参阅在线附录。不^•在参考文献中描述的视网膜裂解物中测量(28)。有关更多详细信息，请参阅在线附录。

对于所有细胞培养研究，实验均为一式三份，然后将整个实验独立重复至少三次。使用SPSS v11（SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）或GraphPad Prism five（GraphPad-Software Inc.，加利福尼亚州洛杉矶市，美国）对数据进行分析。在动物实验中，每组至少需要6只大鼠才能达到统计显著性。为了确定每组需要多少只动物，我们比较了糖尿病动物和治疗组在每个终点的先前实验数据，然后计算了达到预期功率0.8（80%）和P（P）数值为0.05。对动物和细胞培养数据集进行了正常性评估，在>2个治疗组的情况下，要么进行单因素方差分析（参数），然后进行适当的事后分析，以校正比较数，要么进行Kruskal-Wallis分析，然后进行单个Mann-Whitney分析U型进行了测试（非参数）。当只进行了两次治疗时吨测试（参数）或Mann-WhitneyU型进行了测试（非参数）。调查人员被蒙面告知这些团体。值为P（P）<0.05被认为是显著的。

为了确定Ang II是否诱导视网膜血管细胞凋亡，将BREC和BRP与100 nmol/l Ang II孵育24小时。与对照组相比，在BREC和BRP中，Ang II治疗分别导致TUNEL或Annexin阳性细胞增加500和30%(图1)。鉴于这一发现，我们接下来评估了BREC和BRP中的GLO-I，发现在这两种细胞类型中，与对照组相比，Ang II使GLO-I活性和mRNA降低了20%(图2)。为了证实Ang II参与GLO-I的下调，我们接下来在用AT1-RB，坎地沙坦治疗后测量GLO-I。在BREC和BRP中，坎地沙坦恢复了GLO-I活性和mRNA，以控制Ang II处理细胞的水平(图2)在BREC的情况下，GLO-I mRNA升高到对照水平以上(图2)。总的来说，BREC在恢复GLO-I功能方面对坎地沙坦的行动反应更为迅速。在几乎所有情况下，在不存在Ang II的情况下，坎地沙坦不会影响GLO-I水平（见补充图1，在线附录中提供）。

确定Ang II对GLO-I的下调是否涉及NO^•，我们测量到NO^•在存在或不存在坎地沙坦的情况下，经Ang II治疗后，BREC和BRP中的产量。在BREC中，Ang II对no没有影响^•而在BRP中，Ang II增加NO^•产量为1.2倍。在这两种细胞类型中，坎地沙坦都能减少NO^•与仅接受Ang II治疗的细胞相比，Ang II处理的细胞中的水平(图3).

体内BREC和BRP凋亡的对应物是无细胞毛细血管的形成。为了确定糖尿病大鼠视网膜中GLO-I的表达是否降低，以及是否与脱细胞毛细血管形成相关，我们首先评估了糖尿病20周后Ren-2大鼠视网膜的脱细胞毛细血管数量。与非糖尿病对照组相比，糖尿病Ren-2大鼠的视网膜中部和外周无细胞毛细血管形成增加，而坎地沙坦则减少(图4)。由于视网膜血管中的白细胞粘附可能先于无细胞毛细血管的形成，因此对4周和20周的时间点进行了检查。在糖尿病Ren-2大鼠中，与非糖尿病对照组相比，糖尿病4周和20周后粘附白细胞增加(图5)白细胞粘附在4周糖尿病组最为明显。在糖尿病Ren-2大鼠中，坎地沙坦将视网膜血管中白细胞粘附性的增加降低至控制水平或以下(图5).

与非糖尿病对照组相比，糖尿病大鼠视网膜ICAM-1和TNF-αmRNA水平增加了一倍，VEGF mRNA增加了0.5倍。在糖尿病Ren-2大鼠中，坎地沙坦使视网膜中ICAM-1和VEGF mRNA水平降低至非糖尿病对照组水平(图6)TNF-αmRNA降低至非糖尿病对照水平以下。(图6)。在糖尿病Ren-2大鼠中，与非糖尿病对照组相比，视网膜iNOS mRNA水平增加了0.3倍，坎地沙坦将视网膜iNOS mRNA水平降低到非糖尿病对照的水平以下(图6).

在Ren-2大鼠中，糖尿病4周和20周时发生的视网膜病理学伴随着GLO-I功能的调节。糖尿病4周时，视网膜GLO-I活性下降，但未检测到mRNA水平的变化(图7和补充图2，分别在在线附录中提供）。然而，糖尿病20周后，视网膜GLO-I mRNA下降(图7)。坎地沙坦增加了糖尿病Ren-2大鼠视网膜中GLO-I的表达，这与我们在BREC和BRP中的发现一致。为了确定糖尿病Ren-1大鼠视网膜GLO-I减少是否与这些动物中RAS的过度表达有关，对RAS抑制的非糖尿病和糖尿病Sprague-Dawley大鼠进行比较(图7)。非糖尿病Sprague-Dawley大鼠视网膜中GLO-I的表达与糖尿病无关。然后我们研究了RAS的GLO-I失调是否增加了MGO-衍生AGEs。在Ren-2大鼠糖尿病4周后，视网膜中MGO-AGE水平升高。在糖尿病Ren-2大鼠中，坎地沙坦倾向于减少视网膜MGO-AGE的增加，但这并不显著(图7)。视网膜中也检测到特定的MGO-AGE，即argpyrimidine，并且在Ren-2大鼠的糖尿病中没有变化；然而，与对照组相比，坎地沙坦确实降低了视网膜精嘧啶的水平(图7)。糖尿病20周后，糖尿病患者的血浆MGO-AGEs和总AGEs均升高，而坎地沙坦显著降低(图7)。视网膜NO^•与糖尿病和非糖尿病对照组相比，经坎地沙坦治疗的糖尿病Ren-2大鼠的血糖水平显著降低(图7).

结果见表S2中的在线附录。

本研究提供了新的证据，证明GLO-I是视网膜血管细胞存活的关键酶(12)，被视网膜中的Ang II下调。我们的研究结果得到了以下证据的支持：AT1-RB，坎地沙坦，改善了糖尿病视网膜病变中无细胞毛细血管的形成和炎症，伴随着视网膜GLO-I表达的恢复和MGO-AGEs的减少，尤其是特定的MGO-AGE精嘧啶。这些发现拓宽了Ang II在AGE途径中的已知作用，不仅包括细胞外AGE相关事件，如RAGE介导的细胞凋亡(24，29，30)也包括MGO-AGEs的细胞内形成。就视网膜GLO-I的调节机制而言，我们之前对视网膜周细胞的研究表明NO的作用^•(12)。我们现在将这一发现扩展到报道，在视网膜血管细胞中，坎地沙坦可以减少NO^•总的来说，本研究提供了有关Ang II如何与AGE途径相互作用以及坎地沙坦在糖尿病视网膜病变中发挥有效保护作用的细胞机制的新信息(图8).

在糖尿病20周时，我们观察到Ren-2大鼠的中段和外周视网膜中无细胞毛细血管形成增加，这与我们之前对Ren-2鼠的研究一致(13)并在糖尿病患者中观察到(31)。脱细胞毛细血管形成是内皮细胞和周细胞凋亡后视网膜微血管发生的一种病理现象(32)。这些事件可能导致视网膜区域无灌注，这被视为导致血管生成生长因子（如VEGF）的上调，进而导致病理性血管生成。视网膜血管细胞凋亡的机制尚未完全确定；然而，我们小组以前的研究表明，GLO-I对人类视网膜周细胞的生存是必要的(12)。本研究以这一信息为基础，通过在视网膜血管细胞中鉴定Ang II是一种新型的GLO-I活性负调控因子和细胞凋亡诱导剂。我们的发现支持了Ang II和GLO-I之间的相互作用，即在包括眼睛在内的组织中肾外RAS增强的糖尿病Ren-2大鼠中(15)，视网膜GLO-I表达降低，同时无细胞毛细血管增加。值得注意的是，在年龄匹配的糖尿病Sprague-Dawley大鼠中，视网膜GLO-I没有减少，这些动物也没有形成脱细胞毛细血管(13)。我们承认，当无细胞毛细血管出现时，长期糖尿病患者未检测到GLO-I活性；然而，在糖尿病视网膜病变的早期，当炎症达到最大时，GLO-I活性降低。坎地沙坦恢复视网膜GLO-I和减轻视网膜血管病变（包括炎症）的能力，这被认为是糖尿病视网膜病变的原因(33)在考虑Ang II阻滞剂（如坎地沙坦）提供视网膜保护的潜在机制时，这一点可能很重要。

虽然乙醛酸酶系统是AGE途径的关键调节器，但MGO-AGEs的形成与细胞损伤有关。迄今为止，该领域的大多数研究都集中于通过RAGE的AGEs对AGE介导的病理学，包括糖尿病视网膜病变的作用(34)。然而，AGEs可能不是体内主要的RAGE配体，因为蛋白质在与RAGE结合之前必须被严重糖基化，而这种广泛糖基化可能不会在体内发生(35)。虽然有越来越多的证据支持这种可能性，但关于细胞内AGEs对病理学的作用的详细报道有限(36，37)。RAGE范式的另一个维度是最近发现GLO-I可以通过调节MGO水平来控制RAGE及其配体的表达(38)，与细胞内糖基化可以控制RAGE表达的观点一致。在糖尿病肾病中，RAS对AGE形成的影响已被证实(20，，——23)，通常侧重于RAGE介导的信号。这也适用于糖尿病视网膜病变的有限研究，其中Ang II介导RAGE和AGE诱导的视网膜周细胞凋亡增加(24，29，30)。在本研究中，通过ELISA检测细胞内MGO-AGE形成的评估（使用针对MGO-AGEs异质混合物的抗体）显示糖尿病Ren-2大鼠的视网膜增加。考虑到精氨酸对赖氨酸的优先修饰，还研究了MGO与精氨酸残基反应形成的一种特殊MGO-AGE，即精氨酸嘧啶(39)以及之前在糖尿病肾脏中检测到的这种特殊成分(39，40)。然而，尽管糖尿病Ren-2大鼠视网膜MGO-AGEs升高，但精嘧啶并未增加，这一发现可能是因为精嘧啶的含量低于其他MGO-AGEs(41)。进一步证明Ang II影响视网膜MGO-AGEs的证据来自我们的发现，坎地沙坦能够恢复糖尿病视网膜Ren-2中的GLO-I，也可以降低视网膜MGO-AGEs和精氨嘧啶水平。这些结果与之前的一项研究一致，该研究报告称坎地沙坦降低了糖尿病大鼠视网膜中AGE戊糖苷的免疫标记，尽管在该研究中戊糖苷水平没有明确量化(42)。与坎地沙坦降低视网膜MGO-AGEs一致，坎地沙丹降低血浆MGO-AGE，值得注意的是，使用我们的检测方法在血浆中检测到的大多数AGEs都是MGO-衍生的。总的来说，我们的发现为RAS在糖尿病视网膜病变中观察到的AGEs调节建立了一种机制，这种机制可能确实与其他糖尿病并发症有关(20，，——23).

Ang II下调视网膜中GLO-I的可能候选机制是NO的增加^•这一假设是基于我们之前对人类视网膜周细胞的研究，该研究表明GLO-I在转录水平上受到NO的调节^•(12)。此外，有大量证据表明Ang II刺激NO^•产生，导致血管病理学(43)包括视网膜炎症和血-视网膜屏障的破坏(44，45)。在本研究中，尽管Ang II降低了培养的视网膜内皮细胞和周细胞中GLO-I的活性和表达，但它只增加NO^•视网膜周细胞水平。Ang II不刺激NO的原因^•视网膜内皮细胞中不清楚；然而，我们的数据表明Ang II通过AT1-R影响NO^•坎地沙坦降低NO时视网膜内皮细胞的生成^•两个细胞群中的水平。同样，在Ren-2视网膜中，NO^•糖尿病患者的血药浓度没有显著升高；然而，坎地沙坦降低了NO^•低于非糖尿病控制水平，支持视网膜中Ang II影响NO的观点^•通过AT1-R产生NO。解释我们的结果时需要考虑的是NO的生理水平^•是正常组织功能所必需的，可以抑制白细胞粘附(46)并调节血管舒张(47)。我们发现坎地沙坦降低了视网膜iNOS和NO^•低于控制水平可能表明需要进一步研究以确定低剂量的AT1-RB能否维持NO^•视网膜内的生理水平，伴随着视网膜病理学的降低和GLO-I的恢复。就NO的病理作用而言^•我们的研究结果与以前的研究一致，iNOS被认为是导致NO增加的主要因素^•糖尿病视网膜病变的水平(48，49)并报道坎地沙坦可以降低组织iNOS(22).

本研究的一个可能局限性是，坎地沙坦对Ren-2大鼠糖尿病视网膜病变的疗效可能是由于该动物的高血压降低，而不是血管紧张素II的生长因子作用受到抑制。然而，在我们之前的研究中，对年龄和血压匹配的糖尿病自发性高血压大鼠与糖尿病Ren-2大鼠的比较表明，前者并没有发展为严重的糖尿病视网膜病变，提示在Ren-2大鼠中RAS的过度表达在该模型中是糖尿病视网膜病变发生的主要原因(15)。此外，在糖尿病Ren-2大鼠中，β-受体阻滞剂阿替洛尔和AT1-RB缬沙坦均能产生类似的收缩压降低；然而，只有缬沙坦减弱了视网膜无细胞毛细血管的形成和视网膜功能的下降(13，14)。然而，据我们所知，高血压本身是否影响糖尿病患者视网膜GLO-I活性和表达尚不清楚，需要在未来的研究中进行调查。

总之，鉴于近期临床试验的积极结果，当前研究的结果是及时的，这些试验表明AT1-RB和血管紧张素转换酶抑制对糖尿病视网膜病变的视网膜血管具有保护作用(18，19，50)。我们的数据表明，GLO-I可能是连接RAS和AGE通路的关键酶，从而促进糖尿病视网膜病变的发展(图8)。这些发现增强了我们对RAS阻滞剂（如坎地沙坦）如何在分子水平发挥作用，在糖尿病等疾病中提供视网膜血管保护的理解。

这项研究由澳大利亚糖尿病研究信托基金和礼来公司授予a.G.M.的新研究员资助，以及阿斯利康（瑞典莫伦达尔）和国家卫生研究院授予Ram Nagaraj的资助（R01EY-016219和R01EY-09912）。A.G.M.是青少年糖尿病研究基金会博士后研究员。J.L.W.B.是澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）的高级研究员。M.E.C.是NHMRC澳大利亚研究员和青少年糖尿病研究基金会学者。M.C.T.由澳大利亚肾脏健康协会（Bootle Award）资助。没有报告与本文相关的其他潜在利益冲突。

A.G.M.设计并进行了实验，分析了数据，并准备了手稿。G.T.进行了实验并分析了数据。K.J.B.进行了实验，分析了数据，并审阅了手稿。R.J.P.设计并执行了血浆ELISA。M.C.T.设计了血浆ELISA实验。R.H.N.和M.E.C.为一些实验提供了建议，并审阅了手稿。J.L.W.B.设计了实验，并协助讨论和准备手稿。

我们感谢莫纳什大学免疫学系的凯莉·麦克马斯特提供的出色技术援助。我们还感谢墨尔本大学Bio21的Mike Griffin博士使用设备进行GLO-I活动实验。