成人供体造血干细胞不是成人非糖尿病患者胰岛β细胞的来源

该研究的机构审查委员会批准来自梅奥诊所。对梅奥诊所的血液和骨髓移植数据库进行了搜索，以确定在其一生中接受过性别不匹配供体造血干细胞移植的患者。只有在死亡后12小时内进行了完整的尸检，以及是否保存了足够大小和质量的胰腺组织，才能纳入病例。在31名患者中，26名患者接受了骨髓来源的移植，4名患者接受外周血来源的移植以及1名患者同时接受了外周血和骨髓来源的干细胞。在HLA A、B和DR抗原水平上，共有23名匹配的亲属供体、3名不匹配的家庭供体和5名不相关的供体。一名患者最初接受来自同一HLA同胞的骨髓移植，3年后在未进行再生障碍治疗的情况下，接受来自相同供体的第二次外周血衍生移植。患者按照机构指南进行治疗，包括移植物抗宿主病预防和传染病预防。

本人类研究还包括两名有记录的糖尿病患者（空腹血糖>126 mg/dl）和一名在造血干细胞移植前有空腹血糖受损（空腹葡萄糖110-125 mg/dl。糖尿病患者在造血干细胞移植后90天和94天存活，而空腹血糖受损的患者在造血细胞移植后29天存活。

尸检时获得胰尾和脾脏的随机样本，在10%甲醛中固定过夜后，将其包埋在石蜡中。为了本研究的目的，从32例患者的含有胰腺和脾脏的石蜡块中获取两个4μmol/l切片，并将其安装在Fisher牌喷墨白IJL-6109-Plus-600621带电载玻片上（Fisher分类号12550109；Fisher Scientific，宾夕法尼亚州匹兹堡）。每个病例的一个切片用苏木精和伊红染色，并进行检查（A.E.B.）以排除自溶，在此基础上未排除任何自溶。如前所述，每个病例的第二部分首先通过荧光原位杂交（FISH）进行分析，以检测X和Y染色体(5)如前所述，随后用于胰岛素(1). 简言之，切片脱蜡，并在73°C下变性3分钟，然后用光谱橙标记的X染色体着丝粒特异性探针和光谱绿标记的Y染色体着丝粒特异性探针（编号32-131051双色探针；Abbott-Vysis，Downers Grove，IL）杂交。将载玻片在加湿箱中培养过夜，以便在42°C下杂交探针。经过甲酰胺清洗程序后，将载玻片风干并用固定介质密封。在下一次染色之前，通过将载玻片浸泡在含有柠檬酸（10 mmol/l，pH 6.0）的加热PBS缓冲液中，去除安装介质和盖玻片。然后使用豚鼠抗猪胰岛素（稀释1:400；Dako，Carpintia，CA）作为一级抗体，并使用与异硫氰酸荧光素（FITC）或Cy3结合的抗豚鼠二级抗体（稀释1:100），用胰岛素对相同的载玻片进行荧光染色（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories）。所有载玻片均安装有Vectashield（Vector Laboratories，Burlingame，CA）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），并盖上滑盖。在最初的32例可用病例中，有1例FISH XY杂交不成功（定义为X和Y染色存在于至少50%的细胞中）；因此，该病例被排除在研究之外，共留下31例。这种连续染色技术的一个局限性是，有必要识别四个不同的实体（X染色体[红色]、Y染色体[绿色]、细胞质胰岛素[绿色或红色]和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色的细胞核[蓝色]），由于荧光显微镜上只有三个彩色立方体，我们受到了限制。因此，在有限数量的切片可用的病例中，我们使用与胰岛素结合的不同二级抗体（FITC或Cy3）重复该程序两次。值得注意的是，X和Y染色体在细胞核内以局部信号的形式出现。因此，它们可以与细胞质胰岛素颗粒区分开来；Y染色体荧光探针的大小通常大于X染色体的大小，因此我们首选Y染色体和胰岛素的荧光绿组合。

所有载玻片的初始筛选是通过使用Leica 6000显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）连接到装有Openlab软件的Macintosh计算机（Improvision，Lexington，MA）的高功率（×63）分析完成的。每个病例平均检查131个胰岛。为了清楚地显示细胞核内的X和Y染色体，必须进行高倍筛选。在所有供体染色体与胰岛素染色细胞质接近的情况下，使用共焦显微镜（如下所述）进行进一步检查，以确定胰岛素阳性细胞的细胞核是宿主还是供体来源。为了实现这一点，使用倒置显微镜（DM-IRE2；Leica，Dearfield，IL）和数码相机（ORCA，Hamamatsu City，Japan）检查FISH和胰岛素共衬载玻片，该数码相机连接到配备有氩、绿、红氦氖激光器和×60油物镜的共聚焦激光扫描单元。氩激光在488nm处激发FITC和Cy5，氦氖激光在633nm处激发红色荧光。使用×63油物镜进行扫描。

在所有病例中，大多数供体造血移植衍生细胞（由供体性染色体定义）存在于脾脏中(图1)，确保本研究中的每一例患者的供体造血干细胞植入。

胰腺中存在分散的供体造血衍生细胞，其密度随着造血干细胞移植存活时间的延长而增加，在～500天时达到稳定状态(图2). 这些细胞存在于血管内皮、外分泌胰腺导管和小叶间结缔组织中(图3). 内皮细胞通过其细长的细胞核及其在血管组织中的位置进行鉴定。同样，结缔组织也可以根据显微外观进行识别。仅凭形态学无法确定胰腺外分泌内的细胞；因此，它们可以代表组织巨噬细胞和/或胰腺腺泡细胞。由于我们可用的胰腺切片数量有限，我们无法使用特异性抗体染色进一步表征这些细胞。共聚焦成像保证了胰腺中的供体造血衍生细胞不是细胞融合的结果，因为镶嵌现象非常罕见(6).

然后，我们检查了胰腺的多个切片，这些切片被FISH染色以获得性染色体，并通过免疫荧光检测胰岛素以识别β细胞。尽管对4192个胰岛进行了广泛的调查，但没有发现β细胞（由胰岛素细胞质免疫染色定义）具有包含供体性染色体的细胞核(图4和5). 胰岛内偶尔出现供体衍生细胞，但共焦显微镜检查时，这些细胞不是β细胞，尽管它们偶尔与β细胞相邻(图5). 此外，从形态学上看，这些细胞与胰岛的血管和结缔组织成分最为一致。值得注意的是，在两例2型糖尿病患者中也没有发现供体衍生的β细胞。

在本研究中，我们探讨了造血干细胞是否会在成人中产生胰岛β细胞的问题。尽管每例患者的脾脏检查都确保了供体造血移植的成功，但我们无法识别任何具有供体性染色体的β细胞。目前的数据，在一个相对较大的病例队列中，对4000多个胰岛进行了检查，这意味着如果造血源性细胞在成人中有能力生成胰岛β细胞，那么在数量上必须可以忽略不计。

先前的研究已经检测了造血干细胞可能的转分化(2–4,7–10)或脾脏(11–14)体内胰腺β细胞中的细胞。其他研究已经检测了体外胰岛素分泌细胞中造血干细胞可能的转分化(15,16). 这些研究都是在啮齿动物身上进行的，并且得出了相互矛盾的结论。最初的报告支持造血转分化(2,15,16)或脾脏(11)细胞转化为胰岛β细胞，但随后的研究均为阴性(8–10,12–14). 目前的研究是第一份关于人类受试者的报告。我们确实观察到少量造血衍生细胞在人类胰腺中的植入在约700天后增加到稳定状态。虽然其中一些细胞无疑是组织巨噬细胞，但许多细胞具有上皮细胞的外观，这与之前在小鼠中的报告一致(7–10). 它们与完成稳态植入所需的时间一致，因为单靠巨噬细胞可能更快地达到稳态。由于我们限制了本研究中可用的宝贵切片集中于胰岛素和FISH联合分析，因此我们没有多余的切片来用特定的细胞标记物探索这些非内分泌胰腺细胞的性质。技术上需要注意的是，供体造血衍生细胞存在于胰岛及其周围，这些胰岛具有组织巨噬细胞的外观。如果不使用仔细的共焦显微镜将细胞核与胰岛素的免疫荧光染色相匹配，可能会产生来自造血供体细胞的偶尔β细胞的错误印象。在本研究中，我们受益于通过FISH和同一切片中胰岛素的相邻细胞质染色以及通过共聚焦显微镜直接检查细胞核性别的能力。当使用检查相邻切片中胰岛素和FISH的方法时，考虑到胰岛内偶尔观察到造血衍生非β细胞，很明显会产生转分化的错误印象。

人类受试者的现有数据与以下概念一致：β细胞数量的再生是通过β细胞复制而不是通过成人干细胞的β细胞转分化产生的(12–14,17–19). 另外，有人认为造血干细胞可能间接支持β细胞再生，可能是通过植入胰岛内的造血干细胞在胰岛内提供的局部信号来实现的(9,10). 我们自己对人类胰岛内偶尔出现造血干细胞的观察与这种作用并不矛盾。一项研究报告称，在自身免疫性1型糖尿病小鼠模型中，脾细胞转分化为β细胞以逆转糖尿病(11). 然而，随后的研究表明，这种作用是通过未知机制来抑制免疫介导的β细胞破坏而不是通过转分化来实现的(12–14)前一组质疑的结论(6). 目前尚不清楚通过造血或脾细胞移植治疗的1型糖尿病患者是否会获得这种益处。然而，鉴于造血移植相关的发病率，这对人类来说不是一种现实的治疗方法。

一些证据表明，2型糖尿病主要是一种胰岛疾病，与1型糖尿病一样，胰岛移植可以逆转其中的一种疾病(20). 此外，2型糖尿病患者胰岛的特征是β细胞数量减少，β细胞凋亡增加(21,22)这意味着在2型糖尿病的病理生理学中可能存在潜在的胰岛炎症成分。由于有人认为造血干细胞在胰岛炎症条件下会被吸引到胰岛，因此值得注意的是，在本研究中检测到的2型糖尿病患者中，我们仍然没有发现造血干细胞转分化产生β细胞的证据。关于本研究的另一个警告是，这里研究的所有病例都不可避免地患有危及生命的疾病(表1). 虽然值得注意的是，血管内皮细胞的积累速度与先前的研究一致，但这种疾病可能影响了造血干细胞转分化为胰岛β细胞的能力，尤其是骨髓增生受损(图2).

本研究中使用的造血干细胞来源于成人骨髓和外周血。另一种被认为是潜在的β细胞祖细胞来源的血源性干细胞来源是脐血干细胞。这种相对丰富的造血干细胞来源可能比成人来源的更容易转分化为胰腺β细胞。事实上，最近有报道称，从三名非糖尿病儿童（4周至14岁）尸检中获得的胰脏中约0.5%的胰脏β细胞具有母体微嵌合体，因此推测其来源于脐血(23). 这一发现表明，即使在没有糖尿病的情况下，造血干细胞也可能具有转分化为胰腺β细胞的能力。在同一份报告中，在一名患有糖尿病酮症酸中毒的11岁儿童的胰腺尸检中发现的母亲β细胞微嵌合体的频率为0.96%。在解释单个1型糖尿病病例与三个非糖尿病病例时必须谨慎。也就是说，与同一研究中报道的非糖尿病对照受试者相比，1型糖尿病患者母源性胰岛β细胞相对温和的增加（约0.4倍）远低于1型糖尿病个体母源性微嵌合体循环血细胞的约30倍。这似乎与糖尿病儿童循环细胞中积极补充β细胞相矛盾。干细胞生物学的一个积极兴趣领域是吸引干细胞迁移到组织并参与组织修复的信号是什么。迄今为止，在胰岛的背景下还没有已知的信号。目前，只能推测，如果存在这种信号，它们很可能由受损的β细胞释放，因此，在1型糖尿病的情况下可能最为明显。

我们确实注意到胰腺中的其他细胞类型来自供体细胞。考虑到先前的报道，造血干细胞能够分化为多种组织：造血谱系、血管内皮细胞，这一发现并不奇怪(24,25)和结缔组织(26). 最近，对骨髓移植小鼠的研究表明，造血细胞可以产生神经元(27)，肌肉发达(28)和肝脏(29)表型。多功能成人祖细胞已在体外从小鼠和人类造血细胞中获得，并分化为内胚层、中胚层和外胚层细胞(30,31). 其他对人类的研究表明，骨髓衍生细胞存在于成人器官中，例如心脏中的心肌细胞(32). 相反，其他研究与这些发现相矛盾(33,34)或者得出结论认为所感知的分化是由细胞融合引起的(35,36).

总之，在干细胞移植后长达3年的研究中，我们没有发现成人造血供体细胞在成人胰腺β细胞中转分化的证据。这些发现表明，成人造血干细胞对成人β细胞群的补充作用最小。这种移植可能发生在脐血来源的干细胞和/或胰岛明显发炎的情况下，如儿童早期1型糖尿病。

本研究部分由青少年糖尿病研究基金会（编号7-2005-1152）和拉里·希尔布洛姆基金会资助。

我们感谢拉里·希尔布洛姆岛研究中心的同事凯瑟琳·马德勒博士、塔蒂亚娜·古洛博士和丽娜·哈塔贾博士提出的有益建议。