Kisspeptin modulates fertilization capacity of mouse spermatozoa

Meng-Chieh Hsu; Jyun-Yuan Wang; Yue-Jia Lee; De-Shien Jong; Kuan-Hao Tsui; Chih-Hsien Chiu

doi:10.1530/REP-13-0368

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Kisspeptin调节小鼠精子的受精能力

在里面繁殖

作者：

徐梦琪

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王俊云（Jyun Yuan Wang）

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德申·郑

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宽浩咀

关浩翠国立台湾大学生物资源与农业学院妇产科动物科学与技术系，第50号，Ln。台湾台北市基隆路3段155号10673

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、和

Chih-Hsien Chiu先生

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DOI（操作界面）：: https://doi.org/10.1530/REP-13-0368

数量/发行：: 第147卷：第6期

页面范围：: 835–845

文章类型：: 研究文章

在线发布日期：: 2014年6月

版权：: ©2014生殖与生育学会2014

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基斯肽是下丘脑-垂体-性腺轴的上游调节器，是哺乳动物繁殖的主要调节系统之一。亲吻1及其受体亲吻1r（也称为G蛋白偶联受体54(Gpr54型))在各种器官中都有表达，但对其功能还没有很好的了解。本研究旨在研究kisspeptin和KISS1R在印迹控制区小鼠生殖组织中的表达谱和功能。为了确定kisspeptin和KISS1R在性腺、睾丸和卵巢组织中的表达模式和位置，采用免疫组织化学或免疫荧光染色法进行检测。Kisspeptin和KISS1R主要分别在睾丸间质细胞和生精小管中表达。KISS1R特异性定位于精子细胞和成熟精子的顶体区域。Kisspeptin在卵丘-卵母细胞复合体和卵巢及输卵管组织的输卵管上皮中表达，但不表达KISS1R。在Fluo-4负载精子中，kisspeptin 10处理后，精子细胞内钙浓度显著增加。用kisspeptin拮抗肽234处理精子后，IVF率下降。这些结果提示kisspeptin和KISS1R可能参与女性生殖道的受精过程。总之，本研究表明kisspeptin和KISS1R分别在雌性和雄性配子以及小鼠生殖组织中表达。这些数据强烈表明kisspeptin系统可以调节哺乳动物的受精和繁殖。

摘要

基斯肽是下丘脑-垂体-性腺轴的上游调节器，是哺乳动物繁殖的主要调节系统之一。亲吻1及其受体亲吻1r（也称为G蛋白偶联受体54(Gpr54型))在各种器官中表达，但其功能尚不清楚。本研究旨在研究kisspeptin和KISS1R在印迹控制区小鼠生殖组织中的表达谱和功能。为了确定kisspeptin和KISS1R在性腺、睾丸和卵巢组织中的表达模式和位置，采用免疫组织化学或免疫荧光染色法进行检测。Kisspeptin和KISS1R主要分别在睾丸间质细胞和生精小管中表达。KISS1R特异性定位于精子细胞和成熟精子的顶体区域。Kisspeptin在卵丘-卵母细胞复合体和卵巢及输卵管组织的输卵管上皮中表达，但不表达KISS1R。在Fluo-4负载精子中，kisspeptin 10处理后，精子细胞内钙浓度显著增加。用kisspeptin拮抗肽234处理精子后，IVF率下降。这些结果提示kisspeptin和KISS1R可能参与女性生殖道的受精过程。总之，本研究表明kisspeptin和KISS1R分别在雌性和雄性配子以及小鼠生殖组织中表达。这些数据强烈表明kisspeptin系统可以调节哺乳动物的受精和繁殖。

介绍

哺乳动物受精是一个复杂的过程，在此过程中，精子与输卵管内的卵母细胞相遇并融合。哺乳动物精子通过多种修饰和反应使卵母细胞受精，包括附睾成熟、女性生殖道获能、运动过度激活和顶体反应(Naz和Rajesh 2004年,吉田等. 2008). 只有获能精子识别并结合卵母细胞透明带，完成顶体反应(弗雷泽2010). 输卵管呈现复杂的环境，包括来自输卵管和卵泡液的特定信号，这些信号促进精子获能(李等. 1976,亨特2005). 这些信号激活多个事件，包括增加细胞内钙浓度（[Ca²⁺]_我)pH和cAMP水平，并诱导特定酪氨酸残基的磷酸化(维斯康蒂等. 1995,1999,弗雷泽2010). 然而，精子质膜上受体和通道的激活机制尚不清楚。

Kisspeptins属于精氨酸-苯丙氨酸酰胺肽家族，最初被鉴定为转移抑制基因的产物亲吻1(小谷等. 2001,缪尔等. 2001,Ohtaki公司等. 2001). kisspeptin前体含有145个氨基酸（kisspept 145），这些氨基酸被裂解成含有54个氨基酸（Kisspeption 54）、14个氨基酸（kisspeptin 14）、13个氨基酸（ki sspepton 13）或10个氨基酸（k sspeptin10）的肽。Kisspeptin肽共享一个共同的C末端十肽Arg–Phe–NH₂motif和具有类似的生物活性(2008年大学). Kisspeptins和kisspeptin受体KISS1R（也称为G蛋白偶联受体54）通过调节下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）的分泌，在哺乳动物繁殖中发挥关键作用(德鲁等. 2003,研讨会等. 2003). 中的突变接吻1或亲吻1r在小鼠中会引起性腺功能减退性性腺机能减退，这是一种以促性腺激素和性类固醇分泌不足为特征的综合征，会阻碍性成熟。

亲吻1和/或亲吻1r在下丘脑和外周生殖组织中检测到转录物或蛋白质，提示kisspeptin在生殖过程中具有额外的调节作用。在这种情况下，kisspeptin在大鼠输卵管中的表达具有区域和周期特异性。Kisspeptin被认为是一种防止异位着床的生理调节剂(盖坦等. 2007). 然而，KISS1R在啮齿动物输卵管中的分布尚不清楚。kisspeptin及其受体均在人和大鼠卵巢中表达。这个亲吻1大鼠排卵前黄体生成素（LH）的激增上调了该基因，提示其在排卵中可能起作用(卡斯特拉诺等. 2006,盖坦等. 2009).亲吻1和亲吻1r基因在人类和啮齿动物睾丸中的表达已有报道(Ohtaki公司等. 2001,寺尾等. 2004,赵等. 2010); 然而，蛋白质的表达和功能尚不完全清楚。最近，在人类精子中检测到kisspeptin和KISS1R，发现它们影响精子的运动(别针（Pinto）等. 2012). 此前的一项研究表明，kisspeptin存在于输卵管中，这表明kisspept可能参与获能、顶体反应和/或受精。为了验证这一假设，我们检测了小鼠性腺kisspeptin/KISS1R系统的mRNA和/或蛋白质表达模式。这项研究提供了kisspeptin调节小鼠精子受精的证据。

材料和方法

动物和材料

成年雄性（10–16周龄）和雌性（8–12周龄）印迹控制区（ICR）小鼠购自国立台湾大学，在22±1°C的光照12小时（0800–2000小时）：黑暗12小时（2000–0800小时）周期中保持，并提供食物和水随意在研究期间。在12只小鼠中检测了初始RT-PCR、组织学、kisspeptin和KISS1R表达模式。细胞内游离钙浓度（[Ca²⁺]_我)对9只雄性小鼠的精子进行了检测。每种性别的10只小鼠用于体外受精实验。所有实验方案均由国立台湾大学医学院动物护理与使用委员会批准。所有程序均符合美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南。

所有核苷酸引物均来自Bio Basic（加拿大安大略省马卡姆）。寡肽kisspeptin 10及其拮抗剂肽234(罗斯韦尔等. 2009)，从Kelowna International Scientific（台湾台北）购买。除非另有规定，否则所有其他试剂均购自Sigma–Aldrich或Invitrogen。

生精小管和间质细胞的分离

前面描述了分离生精小管和间质细胞的方法(津井等. 2012). 简单地说，取下小鼠睾丸白膜，用含有0.1%（w/v）BSA和200 U/ml 1型胶原酶的分离缓冲液1×Hanks平衡盐溶液（Invitrogen）清洗睾丸内容物一次（沃辛顿，加利福尼亚州莱克伍德，美国）。然后，将睾丸内容物转移到新鲜的隔离缓冲液中，并在37°C下孵育，平台在50 r.p.m.摇晃5分钟。睾丸内容物通过250米的尼龙过滤器，分离成生精小管和悬浮在滤液中的间质。间质细胞在300℃离心收集克持续5min，取出上层培养基。生精小管和间质细胞在液氮中冷冻，并在使用前储存在−80°C。

mRNA转录物的半定量RT-PCR分析

根据制造商的说明，用TRIzol试剂（Invitrogen）从曲精小管和间质细胞中提取总RNA。为了合成cDNA，将总RNA（1μg）与2.5μM寡核苷酸（dT）和500μM脱氧核苷酸三磷酸混合，并在65°C下变性5分钟。样品在冰上冷却，然后与40 IU RNaseOUT RNase抑制剂（Invitrogen）、5 mM二硫苏糖醇和200IU SuperScript III逆转录酶（Invitrogen），并在50°C下培养60分钟。通过加热到70°C并保持15分钟，使反应失活，cDNA产物在4°C下保存。PCR包括在95℃下变性2 min，然后是可变数量的扩增周期，定义为在95℃变性30 s，在58℃下退火30 s，以及在72℃下延伸40 s。包括72℃的最终延伸周期2 min。引物序列如下：亲吻1（正面，5′-TCGTTAAATGCCTGGGAAAAG-3′，反面，5′-TTCCAGTTGAGGTGACAGG-3′；登录号，NM_178260.3）；亲吻1r（正向，5′-GTCGGAAACTCATTGGTCATCTAC-3′，反向，5′-AGCGGAACACACACATCA-3′；登录号，NM_053244.5）；和Gapdh公司（正向，5′-GCCAAAAGGGTCATCTC-3′，反向，5′-CTTACTCCTTGGAGGCCATGT-3′；登录号，NM_008084.2）。引物对的设计使每个引物至少由一个内含子分开。基于特定靶点半定量分析的最佳扩增条件，对亲吻1和亲吻1r，进行了25个PCR循环Gapdh公司RT-PCR信号强度使用VisionWorksLS图像分析软件（UVP，Upland，CA，USA）进行量化。相对基因表达值相对于内部对照进行了标准化(Gapdh公司)表现为与对照生精小管相比的折叠变化。

免疫印迹分析

组织在冷裂解缓冲液（2%十二烷基硫酸钠、50 mM Tris、pH 6.8、5 mM EDTA、1%2-巯基乙醇和5%甘油）中用机械均质器研磨，并制备全组织提取物。含有30-60μg蛋白质的样品通过15%SDS-PAGE分离。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。通过在含有0.01%吐温20（PBST）和2.5%牛血清白蛋白的PBS中培养8小时来阻断膜在室温下培养8小时，然后在室温下在PBST中与kisspeptin 145（1:100稀释；产品编号ab19028，英国剑桥Abcam）和KISS1R（1:500稀释；产品号sc-134499；Santa Cruz Biotechnology）特异性兔多克隆抗体孵育18小时。然后，用PBST清洗膜四次，并用过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG（1:25000稀释；杰克逊免疫研究实验室，美国宾夕法尼亚州西格罗夫）。用PBST清洗膜，ECL系统（Merck Millipore）使用柯达X-OMAT胶片（伊士曼柯达公司）显示结合抗体。用15%的SDS-PAGE分离相同的提取物，并用考马斯蓝染色作为负荷对照。

免疫组织化学和免疫荧光分析

将福尔马林固定的小鼠组织包埋在石蜡中，切片成5μm厚的切片，并安装在聚乙烯上-我-赖氨酸涂层载玻片。在二甲苯中脱蜡后，通过降低乙醇浓度并在室温下用PBS洗涤，使组织重新水化。通过在10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0，含0.05%（v/v）吐温20，在微波炉中加热）中孵育两次10分钟，可恢复抗原结合位点。用1%（v/v）H淬灭内源过氧化物酶活性后₂O（运行）₂在甲醇中浸泡30分钟，用PBS将切片冲洗三次，每次5分钟。将载玻片在封闭缓冲液（含3%（v/v）正常山羊血清和0.2%（v/v）Triton X-100的PBS）中培养3小时。然后，用以下一级抗体在封闭缓冲溶液中稀释24小时，4小时°C，在潮湿的室内：兔抗kisspeptin 10（1:800稀释；产品编号T-4771，Bachem，Torrance，CA，USA）；兔抗kisspeptin 145（1:100稀释；Abcam）；和兔抗KISS1R（1:100稀释；产品编号ab12698，Abcam）。仅使用阻断缓冲液建立抗体阴性对照。在室温下用PBS清洗玻片五次，每次5分钟，并在潮湿的室内用生物素化山羊抗兔二级抗体孵育60分钟。根据制造商的说明，在用Vectastain Universal ELITE ABC试剂盒（Vector Laboratories，Burlington，ON，Canada）中的亲和素-生物素-HRP复合物培养30分钟之前，再次冲洗切片。额外冲洗后，将载玻片与二氨基联苯胺在室温下孵育10-20分钟，以观察免疫染色。最后，用蒸馏水冲洗载玻片两次，每次10分钟，用苏木精复染30秒，并在添加固定介质之前用乙醇和二甲苯水合（Hecht-Assistent；德国桑德海姆）。使用配备AxioCam ERc 5s（卡尔蔡司）数码相机的Axioskop 40显微镜（德国哥廷根卡尔蔡斯）观察幻灯片。

为了评估KISS1R的位置，使用带有顶体标记物透明带3受体（ZP3R）和Hoechst 33342（Sigma–Aldrich）的三重标记免疫荧光染色法检查睾丸切片和精子涂片。如上所述制备组织载玻片，并在37°C下使用25μg/ml胰蛋白酶进行额外处理10分钟，以回收sp56抗原。将玻片与稀释的兔抗KISS1R抗体和鼠抗p56抗体（1:100稀释；产品编号55101，QED Bioscience，San Diego，CA，USA）孵育24小时。将玻片清洗五次，每次5次在室温下分别用PBS培养min，然后用DyLight 488-共轭山羊抗兔和DyLight594-共轭山羊抗鼠二级抗体培养1h（1:400稀释；Jackson ImmunoResearch Laboratory），并用2μg/ml Hoechst 33342在室温下的封闭缓冲液中进行核染色。对于精子涂片样本，用甲醇冲洗载玻片5分钟，然后用上述抗体进行封闭和孵育处理。用PBS清洗三次，每次5分钟后，用Prolong Gold防褪色试剂（Invitrogen）安装载玻片，并用共焦显微镜TCS SP5 II（德国威兹拉尔莱卡）进行观察。

精子分离

精子细胞内钙的制备方法²⁺前面描述了测量(李等. 2005). 用于涂片和[Ca的精子制备²⁺]_我在改良的HEPES培养基（HM）中进行测量（120 mM NaCl，2 mM KCl，1.2 mM MgSO₄.7小时₂O、 0.36毫米NaH₂人事军官₄，15 mM NaHCO_三、10 mM HEPES、5.6 mM葡萄糖、1.1 mM丙酮酸钠、18.5 mM蔗糖、100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素）。通过在5%CO中充气，将培养基pH值调整为7.3–7.4₂使用前在37°C的培养箱中放置24小时。将附睾尾切成碎片，让活动精子在37°C的培养基中游泳20分钟。精子在1-ml 75%（v/v）Percoll梯度上分离，在300℃离心克持续30分钟，并收集以测量[Ca²⁺]_我。细胞用HM在100℃离心两次克将精子悬液涂抹在聚乙烯上，制备精子涂片-我-赖氨酸涂布的载玻片，随后进行空气干燥。将载玻片在冷甲醇中固定2分钟，再次风干，并储存在−20°C下。在体外受精实验中，从附睾尾分离的精子可以在37°C的商用人类输卵管液（HTF；Merck Millipore）中游泳20分钟，并稀释至最终浓度1×10⁶精子/ml用于进一步操作。

细胞内游离钙的测定²⁺在精子中

细胞内游离钙的变化²⁺浓度（[Ca²⁺]_我)在37°C下，使用Synergy H1混合多模微板阅读器（Bio-Tek，Winooski，VT，USA）在96周的黑板中对装有Fluo-4（Invitrogen）的非电容精子进行测量。精子（1×10⁸细胞/ml）加载15μM Fluo-4 AM，这是一种细胞渗透性荧光钙²⁺指示剂，并在37°C的黑暗中培养45分钟。在100℃下通过三个离心步骤去除多余的染料克在室温下保持5分钟。将颗粒重悬于HM中，加入或不加入1.8mM CaCl₂对于正常条件或低钙²⁺条件，并调整为5×10⁶每孔灌入100μl精子悬液；荧光激发波长为485nm，发射波长为520nm。在添加含有25–200μM kisspeptin 10的100μl（1:1稀释）溶液前后记录荧光。[Ca的变化²⁺]_我被测量为如果′–如果₀/如果₀（%），其中如果′是实验时间点的荧光强度如果₀是治疗前的平均荧光强度（-5至0分钟）。统计结果计算为[Ca的平均变化²⁺]_我在持续平台荧光期（27～30min）。

体外受精

非获能或获能精子在HTF中孵化，并在获能或顶体反应期间用肽234处理，以测试其对受精的影响。在对照组中，用0.9%生理盐水代替肽234溶液。详细程序如下所述。对于获能步骤，活动精子（1×10⁶精子/ml）置于容量限制条件培养基（含0.3%无脂肪酸BSA的HTF）中，并在37°C的培养室中补充50μM肽234或生理盐水2 h。然后，通过将卵丘-卵母细胞复合体（COC；有关制备细节，请参见下一段）添加到微孔中，并在27°C下用或不用50μM肽234孵育6小时来执行受精步骤。然后，用单一钾优化培养基加氨基酸（KSOM+AAs；Merck Millipore）清洗鸡蛋三次，并在新鲜KSOM+AA中培养。对卵裂进行形态学评估，以验证受精是否成功，受精定义为卵裂进入双细胞胚胎阶段。通过计数24小时时两个细胞胚胎的数量来确定受精率。

COCs的制备如下：雌性小鼠经腹腔注射10 IU妊娠母马血清促性腺激素（PMSG；Sigma–Aldrich）和10 IU人绒毛膜促性腺素（hCG；中国化工医药，台湾台北），间隔48 h诱导超排卵。注射hCG后12-14小时切除双侧输卵管，并将COC从壶腹释放到含有矿物油精子的HTF中。

统计分析

每个实验至少重复三次。数据表示为平均值+s.e.m（标准电气）数据由Student’s分析t吨-使用Sigma Plot Software（Systat Software，加利福尼亚州圣何塞，美国）进行测试或单因素方差分析，然后使用Duncan方法；P（P）<0.05表示显著性。

结果

的表达式亲吻1和亲吻1r生精小管和间质细胞中的基因

以前的研究报告称亲吻1和亲吻1r在睾丸中表达(Ohtaki公司等. 2001,Funes公司等. 2003). 为了探讨这些基因的表达模式，将成年小鼠睾丸组织分离为生精小管和间质细胞，并进行半定量RT-PCR和免疫印迹分析(图1A和D）。亲吻1间质细胞的转录水平是生精小管的3.3倍(n个=3,P（P）<0.05;图1B）。相比之下，亲吻1r间质细胞的转录水平是生精小管的14.3倍(n个=3,P（P）<0.001;图1C） ●●●●。这些结果表明kisspeptin(亲吻1)和KISS1R(亲吻1r)在小鼠睾丸中主要表达于间质细胞和生精小管。

生精小管和间质细胞KISS1R和kisspeptin的免疫检测

基因表达分析由免疫组织化学分析补充，以确定KISS1R和kisspeptin蛋白在成年小鼠睾丸组织中的表达和分布模式。精子细胞中检测到强烈的KISS1R免疫反应(图2A）但不存在于精原细胞、精母细胞或生精小管中的支持细胞中(图3A和B）。KISS1R在睾丸间质室的Leydig细胞中很少检测到(图2D）但约占总Leydig细胞的12.4±4.9%（平均值±s.d公司.;n个=7; 在每个小鼠睾丸中计数的至少300个细胞）表达KISS1R。相反，在睾丸间质室的Leydig细胞中检测到强烈的kisspeptin免疫反应(图2E） ●●●●。Kisspeptin免疫染色在生精小管的大多数细胞中均未检测到，但在细长精子细胞的残体中检测到，精细胞是精子在精子发生过程中发育的过渡细胞(图2B）。KISS1R和kisspeptin的强免疫染色分别存在于滋养层巨细胞和合胞体滋养层细胞中，作为阳性对照(图2G和H）。作为免疫组化程序的阴性对照，相邻切片在没有初级抗体的情况下进行培养(图2C、 F和I）。

KISS1R在精子细胞中特异表达(图2A）而不是精原细胞或精母细胞(图3A和B）。为了验证这一观察结果，对不同成熟阶段的精子细胞进行了KISS1R免疫染色，包括圆形和细长的精子细胞(图3). 我们对成年ICR小鼠附睾尾采集的睾丸切片和精子涂片进行了三重荧光分析(图4). 样本染色KISS1R（绿色）、顶体标记物透明带3受体ZP3R（红色）和细胞核（蓝色），并通过共焦扫描激光显微镜进行可视化。KISS1R在不同发育阶段的精子细胞中与顶体共定位，但不与细胞膜共定位。相比之下，使用精子涂片对kisspeptin（绿色）、ZP3R（红色）和细胞核（蓝色）进行的三重荧光分析显示，在小鼠精子中检测不到kisspept的表达(补充图1，请参阅补充数据在本文末尾给出）。这些结果强烈表明KISS1R在小鼠精子细胞和成熟精子中表达。

附睾kisspeptin的免疫检测

这些结果表明kisspeptin可能在精子中起作用。附睾为精子的成熟和储存提供了最佳环境。附睾液伴随射出的精子进入精浆并可能保护精子(雷耶斯·莫雷诺等. 2002). 在附睾上皮（包括附睾头、附睾体和附睾尾）中检测到强kisspeptin免疫反应性，但在周围平滑肌中未检测到(图5). 这是附睾中kisspeptin的首次报道。

卵巢和输卵管kisspeptin的免疫检测

为了在排卵前期收集卵巢卵泡和输卵管，用PMSG预处理48小时后处死小鼠。在小鼠卵巢组织中检测到Kisspeptin免疫反应，特别是在卵泡、黄体和间质腺中。在排卵前卵泡颗粒层、卵母细胞周围的卵丘细胞、卵母细胞质中检测到Kisspeptin(图6A和B）和卵泡膜细胞（数据未显示）。排卵后，在COCs中明显检测到kisspeptin免疫反应性(补充图2，请参阅补充数据在本文末尾给出）。此外，强kisspeptin免疫标记表明在纤毛输卵管上皮中存在kisspept(图6E和F）。相比之下，在排卵前卵泡的颗粒细胞和卵母细胞以及纤毛输卵管上皮中未检测到KISS1R(图6C和G），但在间质腺中检测到（数据未显示）。

kisspeptin对细胞内钙的影响²⁺精子中的浓度

小鼠精子中KISS1R的存在强烈表明kisspeptin系统在调节精子功能中起作用，这通常与[Ca²⁺]_我水平。因此，我们分析了kisspeptin对[Ca的影响²⁺]_我在装载Fluo-4的小鼠精子中。25、50和100μM kisspeptin 10的治疗引起浓度依赖性[Ca²⁺]_我增加，小鼠精子中的荧光强度分别增加22.2±4.5、85.5±14.4和129.9±24.9%(图7A和B）。kisspeptin暴露后，荧光强度迅速增加，并在5-10分钟内达到稳定。先前的研究表明，激活的KISS1R通过G蛋白q/11（G_{2011年第2季度})–磷脂酶C（PLC）–肌醇1,4,5-三磷酸受体（InsP_三R）转染中国仓鼠卵巢K1细胞系和GnRH神经元的信号通路(小谷等2001年,线路接口单元等. 2008). 我们研究了kisspeptin 10诱导小鼠精子中钙增加的性质。在低钙中²⁺介质，[Ca²⁺]_我50μM和100μM kisspeptin 10的浓度依赖性增加分别为71.1±18.3和206.6±14.1%(图7C和D）。这些结果表明，kisspeptin诱导[Ca²⁺]_我通过释放细胞内钙进行动员。

kisspeptin拮抗剂对精子受精能力的影响

综上所述，这些结果表明，受精可能涉及kisspeptin的系统调节，KISS1R在精子上表达，kisspept由附睾上皮、输卵管上皮、卵母细胞和卵丘细胞分泌。我们检测了精子在获能或顶体反应期间无kisspeptin信号的情况下的受精能力。通过体外受精评估精子的受精能力。在获能步骤中，将附睾尾精子在无获能条件培养基（对照组，仅添加生理盐水）或50μM肽234（P234组）（一种kisspeptin拮抗剂）的条件培养基中培养2 h，然后将这些精子用于IVF检测。肽234处理的精子受精率显著降低(图8B类；n个=7;P（P）<0.05）。然而，在受精过程中，肽234处理的获能精子的受精率与对照组没有显著差异(图8C；n个=3;P（P）=0.21). 这些结果表明，在获能过程中，kisspeptin拮抗剂会降低小鼠精子的受精能力。

讨论

此前的研究报告称，kisspeptin及其受体KISS1R在调节下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）中发挥重要作用，HPG轴控制生殖功能，如青春期开始和季节性繁殖。然而，亲吻1和亲吻1r除下丘脑外，在其他组织中也表达(Ohtaki公司等. 2001,趣味等. 2003). kisspeptin在这些组织中的作用尚不清楚。在本研究中，我们提供了KISSR在小鼠精子中表达的证据，kisspeptin信号可能调节精子的受精能力。

据我们所知，这是首次报道kisspeptin和KISS1R在小鼠生精小管和间质细胞中的表达。我们的结果表明，Leydig细胞主要表达kisspeptin，而KISS1R表达水平较低。用kisspeptin 10或kisspept拮抗剂处理的原代小鼠Leydig细胞，无论有无羊LH，其睾酮分泌均未发生改变(补充图3，请参阅补充数据这表明kisspeptin可能不会影响Leydig细胞中的类固醇生成。然而，持续皮下注射或单次高剂量kisspeptin 54会导致大鼠睾丸退化(汤普森等. 2006,2009,Ramzan&Qureshi 2011年). GnRH受体拮抗剂西曲利预处理阻断kisspeptin诱导的睾丸退化，表明GnRH-介导的过程是通过急性过度刺激HPG轴，而不是kisspept对睾丸的直接影响(汤普森等. 2009). 本研究表明，kisspeptin/KISS1R系统可能以自分泌或旁分泌的方式调节重要的睾丸功能，但不参与Leydig细胞的类固醇生成。

本研究结果表明，kisspeptin由间质中的Leydig细胞大量产生，KISS1R由精子细胞和成熟精子等生殖细胞表达。间质细胞和生殖细胞之间可能存在由kisspeptin系统介导的相互作用。然而，KISS1R免疫染色仅在顶体区域观察到，而在发育中精子细胞的质膜上未观察到，这表明莱迪格细胞中的kisspeptin可能不会影响精子生成。必须考虑血-睾丸屏障，以评估kisspeptin何时可以进入这些生殖细胞发挥作用。需要进一步的实验来阐明kisspeptin是否对睾丸组织中的生殖细胞起作用。附睾尾成熟的小鼠精子在顶体区域保留KISS1R，与人类精子的先前结果一致(别针（Pinto）等. 2012). 目前的结果表明，kisspeptin 10治疗可诱导浓度依赖性[Ca²⁺]_我增加。因此，KISS1R很可能在附睾精子发生晚期或成熟期间从顶体膜转移到质膜。这需要使用高倍免疫电子显微镜进行确认。

精子中的细胞内钙对调节运动、获能、顶体反应和其他过程很重要(科斯特洛等. 2009). 增加[Ca²⁺]_我在kisspeptin治疗KISS1R表达的CHO细胞和GnRH神经元后，先前已经观察到(小谷等. 2001,线路接口单元等. 2008). kisspeptin与[Ca变化的关系²⁺]_我结果表明，kisspeptin 10（25–100μM）诱导[Ca浓度依赖性增加²⁺]_我在小鼠精子中。kisspeptin的有效浓度可能取决于细胞类型，因为有效剂量范围从小鼠GnRH神经元的10 nM到牛垂体前叶细胞的1μM，再到小鼠精子的25μM(图7;汉族等. 2005,角川等. 2008). 这个K_d日大鼠KISS1R水平相当低（nM水平；小谷等. 2001); 较高浓度的kisspeptin10可能作用于其他膜受体。然而，目前关于kisspeptin 10对小鼠精子作用的数据与使用人类精子的数据相似（10μM；别针（Pinto）等. 2012). 提高[Ca的有效孕酮浓度²⁺]_我依赖于物种；需要微摩尔浓度的孕酮来刺激[Ca的增加²⁺]_我在小鼠精子中，而在人类精子中，纳米摩尔浓度就足够了(富卡米等. 2003,利什科等. 2011). 在低钙环境中²⁺培养基中，kisspeptin 10仍诱导细胞内钙水平升高(图7C和D）。因此，它可能动员细胞内钙池，如顶体和线粒体中的钙池_{2011年第2季度}–PLC–InsP_三R通路在kisspeptin诱导的细胞内钙动员中起着重要作用。

kisspeptins和kisspeptin 145前体在雌性大鼠、绒猴和人类生殖组织的输卵管纤毛上皮、卵母细胞和卵丘细胞中均有表达(卡斯特拉诺等. 2006,盖坦等. 2007,2009).亲吻1排卵前卵巢中的基因表达增加，表明kisspeptin调节卵泡生成、排卵和/或黄体生成(卡斯特拉诺等. 2006,盖坦等2009年). Kisspeptin可能有助于防止异位妊娠，因为在排卵前也发现kisspept表达增加(盖坦等2007年). 然而，目前的结果表明，KISS1R在小鼠卵巢和输卵管的卵丘细胞、卵母细胞或输卵管上皮中不表达，但在精子的顶体区域检测到。因此，这些数据表明kisspeptin/KISS1R系统可能参与调控配子的受精过程。

调节精子功能所需的kisspeptin的来源可能是附睾上皮(图5)除了Leydig细胞，但不是精子(补充图1). 经过几个清洗步骤后，精子的[Ca没有变化²⁺]_我在长时间孵育过程中，对照组的[Ca²⁺]_我对用25μM kisspeptin 10治疗的反应。因此，我们推断附睾上皮分泌kisspeptin来调节精子功能。精浆由多种离子、能量底物和有机化合物组成，如柠檬酸、脂类、氨基酸、肽、低分子量和高分子量蛋白质。这些成分支持精子在女性生殖道中的存活，并有助于成功受精(Juyena&Stelletta 2012年). 我们认为精浆中含有kisspeptin，由附睾上皮分泌(图5)、精囊和/或前列腺(Ohtaki公司等. 2001,柯蒂斯等. 2010). 精液中kisspeptin的确切来源需要通过未来的实验来阐明。

这是首次报道kisspeptin对精子受精能力的影响。目前的数据表明，在获能过程中而不是在受精过程中使用kisspeptin拮抗剂会降低精子的受精率。这表明kisspeptin不调节顶体反应，这与之前在人类精子中描述的反应一致(别针（Pinto）等. 2012). 本研究支持kisspeptin在获能过程中调节精子的受精能力，并可能保护附睾和输卵管等生殖道中的精子功能的观点。

总之，我们报道kisspeptin/KISS1R系统可能调节小鼠精子的受精过程。KISS1R在精子顶体区表达，kisspeptin在卵丘细胞、卵母细胞和输卵管上皮上表达。Kisspeptin诱导的浓度依赖性[Ca²⁺]_我增加，而kisspeptin拮抗剂减少精子受精。未来的研究将集中于kisspeptin在精子中激活的特定功能和信号通路。

补充数据

这篇文章的在线版本链接到http://dx.doi.org/10.1530/REP-13-0368.

利益申报

作者声明，不存在可能被视为损害所报告研究公正性的利益冲突。

基金

这项工作得到了中华民国台湾国家科学委员会的资助（NSC101-2313-B-002-016）。

致谢

我们感谢Li-Ying Sung博士（中华民国台湾大学生物技术研究所生物资源与农业学院）为体外受精实验提供技术支持。

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kisspeptin的表达谱(亲吻1)和KISS1R(亲吻1r)在小鼠睾丸组织中。（A）从三只成年ICR小鼠的睾丸中分离出生精小管（1–3道）和间质细胞（4–6道），并通过RT-PCR对其进行分析亲吻1和亲吻1r表达式。（B和C）亲吻1和亲吻1r用图像分析软件定量分析生精小管和间质细胞的mRNA表达水平。（D）用免疫印迹法分析两个小鼠的生精小管和间质细胞kisspeptin和KISS1R蛋白的表达。加载控制显示为考马斯蓝染色*P（P）<0.05和***P（P）<0.001. 误差线是指+s.d公司.

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小鼠睾丸组织中KISS1R和kisspeptin的免疫组织化学染色。用特异性抗体对成年ICR小鼠的（A和B）生精小管、（D和E）间质细胞和（G和H）胎盘（免疫染色阳性对照）进行KISS1R（上部）或kisspeptin（中部）染色。阳性免疫染色呈棕色，用箭头表示。插入面板以2.5倍的放大倍数显示原始图像。（C、F和I）未经一级抗体培养的切片显示为阴性对照。ES，细长精子细胞；S、精子细胞；五十、莱迪格细胞；滋养层巨细胞；和ST，合胞体滋养层。比例尺=50μm（A、B、C、D、E和F）或200μm（G、H和I）。

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小鼠睾丸组织不同成熟阶段精子细胞KISS1R的免疫组织化学染色。用特定抗体对成年ICR小鼠睾丸组织切片进行KISS1R染色。KISS1R（棕色）在精子细胞成熟的不同阶段特异表达。（A、B、C、D、E、F、G、H、I和J）图像通过光学显微镜以1000倍放大率拍摄，（A、B、C、D、E、F、G、H、I和J）原始图像以4倍放大率的中心视图。免疫反应呈棕色，并用箭头表示。ES，细长精子细胞；RS，圆形精子细胞；S、精母细胞；SG，精原细胞；St，Sertoli细胞；和L，Leydig细胞。比例尺=20μm（A、B、C、D、E、F、G和H）或5μm（A、B、C、D、E、F、G和H）。

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早中期精子细胞和成熟精子KISS1R和ZP3R的免疫荧光染色。通过KISS1R（绿色）、ZP3R（红色）和细胞核（蓝色）染色，对成年ICR小鼠的睾丸切片和从附睾尾收集的精子进行三重荧光分析。通过共焦扫描激光显微镜观察图像。比例尺=2.5μm。

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小鼠附睾中kisspeptin 10和kisspeptin 145的免疫组织化学染色。成年小鼠的头（A和B）、体（D和E）和尾（G和H）附睾切片用与所有活性形式的kisspeptin反应的kissspeptin 10抗体和与kisspept前体反应的kissipeptin 145抗体进行染色。免疫反应呈棕色，并用箭头表示。（C、F和I）无一级抗体培养的切片显示为阴性对照。E、上皮；SM，平滑肌；Sp，精子质量。比例尺=50μm。

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雌性小鼠生殖组织中kisspeptin 10、kisspept 145和KISS1R的免疫组织化学染色。卵巢（A、B和C）和输卵管（E、F和G）组织用抗kisspeptin 10（与所有活性形式的kisspept反应）、抗kissspeptin 145（与kisspetin前体反应）和抗KISS1R（与kissipeptin受体反应）抗体染色。免疫反应呈棕色，并用箭头表示。（D和H）未经初级抗体培养的切片显示为阴性对照。O、卵母细胞；C、卵丘细胞；E、上皮细胞；和SM，平滑肌。比例尺=100μm（A、B、C和D）或200μm（E、F、G和H）。

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kisspeptin 10对细胞内钙的影响²⁺小鼠精子中的水平。（A和C）[Ca的变化²⁺]_我不同剂量的kisspeptin 10（Kp10）处理的精子中（A）正常或（C）低钙水平²⁺媒体。（B和D）四个或七个独立实验中持续平台期曲线的统计分析。用Fluo-4 AM装载附睾尾的小鼠精子，并用96周倍增阅读器记录Fluo-4AM荧光强度的变化*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）与对照组相比<0.001。误差线是指+s.e.m（标准电气）.

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kisspeptin拮抗肽234（P234）对小鼠精子受精能力的影响。（A）流程图显示了在获能或受精期间没有kisspeptin信号的情况下检测精子受精能力的实验设计。（B）将未获能精子与50μM P234在获能培养基中预孵育，并添加卵丘-卵母细胞复合体（COCs）进行受精。（C）将获能精子与P234在人输卵管液（HTF）中孵育，并加入COCs进行受精。这些数据反映了每个处理三到七个独立实验的平均值，每个处理至少包括30个鸡蛋。括号中的数字表示鸡蛋的总数*P（P）与对照组相比<0.05；NS，无显著差异。误差线是指+s.e.m公司.