Eya1和Six1对哺乳动物颅骨板感觉神经发生的早期步骤至关重要

在脊椎动物中，所有外周感觉神经元都来源于板片中的前体或神经嵴细胞。质粒是脊椎动物头部增厚的外胚层的焦点区域，可产生神经元和非神经元结构（眼睛的晶状体和垂体前叶）(Le Douarin，1984年). 神经原板包括嗅觉板、耳板、三叉神经板和鳃表板。其中，只有嗅板和耳板产生神经元和非神经元成分，而三叉神经和鳃表板只产生三叉神经（V）和远端膝状体（VII）、岩板（IX）和结节（X）神经节的感觉神经元。面部（VIIth）、舌咽（IXth）和迷走神经（Xth）颅神经也有相关的近端面部（VII）、颈静脉（IX）和上神经节（X），这些神经节起源于神经嵴(艾尔·勒·列夫尔和勒·杜阿林，1982年;达米科·马特尔和诺登，1983年)以及分支运动和内脏运动起源的纤维(Fritzsch和Northcutt 1993年;Ma等人，2000年). 尽管这些颅神经节内感觉神经元的个体发育已被很好地描述，但腭外胚层细胞是如何被诱导分化为神经元细胞的，以及引导其沿着这一途径发育的分子机制尚不明确。

小鼠的靶向突变表明，碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子神经原（Neurogs）在血小板衍生的颅骨感觉神经元的早期发育中起着关键作用。早在E8.5，Neurog1和Neurog2就在颅骨板中表达，并作为细胞命运承诺的关键决定因素(Fode等人，1998年;Ma等人，1998年;Ma等人，1999年;Ma等人，2000年). 而Neurog1是V和VIII感觉神经元形成所必需的(Ma等人，1998年)，Neurog2是VII、IX和X的鳃表板源性感觉神经元正常发育所必需的(Fode等人，1998年). 最近的研究发现，Neurogs可能激活一系列下游bHLH因子，包括Math3、Neurod和Nscl1，以促进板源感觉神经元的发育(Fode等人，1998年;Ma等人，1998年). 神经对这些因子的正常表达是必要的，但目前尚不清楚所有这些基因是否都以线性途径作用，并且没有一个被证明是Neurog1或Neurog2的直接靶点。

远端VII、IX和X神经节的鳃表板源性感觉神经元也依赖配对同源域转录因子Phox2a和Phox2b进行分化和存活。Phox2a公司已显示在的上游运行Phox2b手机(Pattyn等人，1999年)和中Phox2a公司^–/–和Phox2b手机^–/–小鼠，鳃表板产生正常数量的成神经细胞，但这些成神经细胞无法激活其更特异的分化程序(Morin等人，1997年;Pattyn等人，1999年;Pattyn等人，2000年). 鳃上腭感觉前体需要Phox2a作为神经元亚型特异性基因表达的子程序，该子程序在遗传上独立于需要Neurog2功能的泛神经元基因表达子程序(Fode等人，1998年). 然而Neurogs公司和照片2基因在神经元细胞中的作用方式尚未阐明。

小鼠Eya基因家族，与眼睛缺失(艾娅)，这是眼睛正常发育所必需的果蝇属(Bonini等人，1993年)，由四名成员组成(Eya1-4号机组)并编码一种转录共激活剂，该转录共激活剂包含一个参与蛋白质-蛋白质相互作用的保守C端Eya结构域和一个不同的N端反式激活结构域(Xu等人，1997年a;Xu等人，1997年b;Borsani等人，1999年). Eya蛋白的保守Eya结构域与眼窦（So）或腊肠（Dach）相互作用，后者是其他调节因子果蝇属眼睛发育(Chen等人，1997年;Pignoni等人，1997年).埃亚1基因在包括许多外胚层板在内的多个域中表达，这种表达模式似乎从爪蟾从斑马鱼到哺乳动物(Xu等人，1997年a;Sahly等人，1999年;David等人，2001年;Schlosser和Ahrens，2004年). 在颅骨板中，埃亚1已经证明在耳板发育中起着重要作用(Xu等人，1999年;Zheng等人，2003年).Six1型，六个基因家族的成员，与果蝇so，编码同源结构域蛋白，其基因产物与Eya1发生物理相互作用(Buller等人，2001年). 在耳腭发育期间，Six1型下游功能和遗传相互作用埃亚1(Zheng等人，2003年). 有趣的是，Six1型-缺陷小鼠耳朵的三个部位都有缺陷，与埃亚1突变体(Xu等人，1999年;Zheng等人，2003年). 然而，Eya1和Six1是否在耳和其他板源性感觉神经元的生成中起作用尚不清楚。

三叉神经鳃运动神经元离开大脑似乎需要质粒和神经嵴源性神经节(穆迪和希顿，1983年;Ma等人，2000年). 所有VII和VIII神经节缺乏分化(Zheng等人，2003年)可能不仅会改变内耳传出神经进入面神经的轨迹(Ma等人，2000年)但可能会导致面鳃运动神经元纤维重新定向到仍然存在的颅神经。埃亚1-和Six1型-因此，零突变体可以为所有鳃运动神经元都需要感觉神经元纤维才能生长到周围神经的假设提供一个检验(Fritzsch和Northcutt，1993年).

在这项研究中，我们探讨了Eya1和Six1是否是特定平台前体规范、存活和分化以及从脑干流出的鳃运动神经元所必需的。我们发现，除了影响VIII神经节的形成外，这些基因还控制鳃表板的神经发生。在内耳神经发生过程中，Eya1和Six1对于神经发生的启动似乎是不可或缺的，但两者都可能调节成神经细胞前体细胞的渐进分化。相比之下，令人惊讶的是，突变的鳃表板前体细胞不能同时表达鳃表膜板源性感觉谱系的神经元命运和神经元亚型特征，这是因为在鳃外板源性感官谱系中神经元2和Phox2a公司不久后，在突变的placodal外胚层中检测到细胞死亡增加，表明在缺乏正常发育程序的情况下，placodal祖细胞发生凋亡。此外，神经胶质标记物的整体染色Sox10型E10.5处的神经丝抗体和E13.5处运动神经元的逆行和顺行标记表明，Eya1和Six1都调节着面鳃运动神经元的正常走行。总之，我们的分析确定Eya1在Six1的上游起作用，并且两者都是鳃上腭祖细胞获得神经命运和亚型感觉特性的关键决定因素。

埃亚1-和Six1型-据报道，产生了无效小鼠(Xu等人，1999年;Laclef等人，2003年). 按照说明对小鼠和胚胎进行基因分型(Xu等人，1999年;Xu等人，2002年).

在PBS中解剖用于组织学和原位杂交的胚胎，并在4°C下用4%多聚甲醛（PFA）固定过夜。将胚胎膜保存在DNA分离缓冲液中进行基因分型。对于全山和切片原位杂交，我们在每个探针的每个阶段使用4-6个野生型或突变胚胎，如所述(Xu等人，1997年a).

如前所述，使用抗神经丝单克隆抗体2H3（发育研究杂交瘤库）进行整体免疫染色(Mark等人，1993年).

为了进行神经元追踪，我们解剖了E13.5胚胎，将其固定在4%PFA中，并如前所述使用亲脂性染料的快速扩散进行标记(Maklad和Fritzsch，2003年a). 解剖胚胎，并用BioRad 2000共焦显微镜观察染色填充轮廓。

胚胎第八神经节由神经元和神经母细胞的混合物组成，共同来源于耳外胚层的神经母细胞(Adam等人，1998年;Farinas等人，2001年). 神经母细胞前体是耳外胚层离开前指定的第一个细胞谱系神经细胞1被发现是所有VIII感觉神经元形成所必需的(Ma等人，1998年;Ma等人，2000年). 我们之前曾报道过埃亚1-和Six1型-在较老的胚胎中，零突变体缺乏第八神经节(Xu等人，1999年;Zheng等人，2003年). 然而，尚不清楚是否在缺乏Eya1或Six1的情况下指定神经母细胞谱系。确定内耳神经发生的阶段埃亚1或Six1型突变，我们首先分析了神经细胞1是神经发生的早期标记，在E8.5到10.5的两个突变胚胎中。神经细胞1在E9.0的腹侧耳杯中的神经母细胞前体中表达，并且随着耳发育的进行其表达会扩大(图1A、D、G、J).神经细胞1在正常胚胎中形成第八神经节的迁移前体中也检测到表达（数据未显示，参见图4A). 总共埃亚1^–/–或Six1型^–/–突变体胚胎（每个阶段每个突变体四个），神经细胞1在耳泡完全闭合之前，E9.0的表达几乎未受影响(图1B、C)表明这两个突变体的神经发生都是正常启动的。然而，神经细胞1突变体耳泡中的表达从E9.25显著降低，到E10.5，只有少数神经细胞1-在两个突变体的腹侧小泡中都检测到表达细胞(图1E、F、H、I、K、L). 此外，一些补丁神经细胞1-在突变体中也观察到阳性细胞从耳囊中移出（数据未显示，参见图4B、C)这表明突变耳外胚层中指定的成神经细胞前体能够分层形成第八神经节。

为了进一步证实这一观察结果，我们分析了神经元在突变胚胎中的表达。Neurod是一种有效的神经元分化因子，在Neurog1下游形成VIII感觉神经元中发挥作用(Lee等人，1995年,Ma等人，1998年). 与…对比神经细胞1^–/–突变体，观察到感觉神经元完全丧失(Ma等人，1998年;Ma等人，2000年)，一些感觉神经元仍然留在神经元^–/–老鼠(Kim等人，2001年). 在E9.5正常胚胎中，神经元在耳泡内的细胞和迁移细胞中强烈表达，形成第八神经节的感觉神经元(图1M). 在所有四个E9.5突变胚胎中神经元-阳性细胞显著减少，检测到其在耳泡内和远离耳泡的细胞中的表达(图1N、O)，证实在没有Eya1或Six1的情况下，神经母细胞被诱导分化为感觉神经元。尽管如此，我们的结果清楚地表明Eya1和Six1对感觉神经元的维持是必要的，可能是通过调节神经元分化。

因为我们没有检测到老年人的第八神经节埃亚1^–/–和Six1型^–/–胚胎在其正常位置的组织切片上，年轻突变胚胎中观察到的成神经细胞可能退化，从而无法形成形态学上可检测到的神经节。因此，我们试图确定发育中的第八神经节中的成神经细胞是否在突变体中发生异常细胞死亡。对E8.5至9.5正常和突变胚胎的横切面进行处理，以用于凋亡细胞核的TUNEL检测方法。年第八神经节原基细胞死亡埃亚1^–/–和Six1型^–/–胚胎在E9.25左右首次被观察到，并在E9.5时在两个突变体中变得明显（箭头，图1Q，R)而在对照组中很少见到凋亡细胞(图1P). 因此，第八神经节的形成缺陷可归因于，至少部分原因是细胞死亡增加。

为了确定突变体中其他颅感觉神经节的形成是否也受到影响，我们用SCG10系列是分化神经元的早期标记，用于标记颅感觉神经节。在E10.5处，SCG10系列正常胚胎中很容易观察到第五、第八和远端第八、第九和第十神经节的表达(图2A). 然而，埃亚1^–/–和Six1型^–/–形成第八神经节原基的突变前体未能表达SCG10系列(图2B，C). 引人注目的是，埃亚1^–/–胚胎也缺乏SCG10系列鳃表板源性神经节的表达(图2B)，而其表达存在于埃亚1^–/–第五神经节轻度缩小。同样，SCG10系列染色可见于Six1型^–/–第五神经节，但在Six1型^–/–第八，在所有分析的六个胚胎的第九和第X神经节中减少(图2C). 这些结果表明，除了第八神经节的缺陷形成外埃亚1和Six1型由bHLH转录因子Neurog2指定的突变体，即形成鳃表板源性神经节，也需要Eya1和Six1功能。早期神经分化标记缺乏表达SCG10系列在变异胚胎中表明埃亚1和Six1型E9.5至10.5胚胎中颅感觉神经节前体的显性神经分化所必需的。这些数据表明，Eya1对所有鳃表板源性远端神经节的形成至关重要，而Six1可能调节感觉神经元亚群的形成。

鳃下板是小鼠胚胎在大约E8.5和10.5发育期间出现的短暂外胚层增厚。在此期间，这些斑块内的外胚层细胞变得柱状且有丝分裂活跃，并被认为产生成神经细胞或未成熟神经元，这些细胞从斑块上分层，向背内侧迁移，并聚集形成远端神经节原基。确定受埃亚1或Six1型突变后，我们分析了鳃表板神经发生的早期标记物bHLH基因的表达。在小鼠中，placodal神经元前体首先表达神经元2(图2D)然后分层并开始表达神经元1、神经元、数学3和Nscl1号机组当它们靠近聚集地点聚集时。最近的研究表明神经元2阻断基板上神经元前体的分层并消除其在早期胚胎中的泛神经元命运(Fode等人，1998年). 令我们惊讶的是，埃亚1^–/–缺少胚胎神经元2E9.5-10.0在所有鳃表板中的表达(图2E). 与…对比埃亚1突变体，Six1型^–/–胚胎在第VIIth前体中表现出不同的表型。在六个E9.5-10.0中Six1型^–/–胚胎被染色神经元2，只显示了两个神经元2-单侧在第VIIth前体细胞中的极少数细胞中染色（数据未显示），其他细胞完全缺乏神经元2表达式(图2F). 在第九和第X前体中，神经元2在所分析的所有六个胚胎中都存在表达，但在第IX个胚胎中显著降低，在第X个前体中影响较小(图2F).

作为所有人埃亚1^–/–E9.5-10.0的胚胎缺乏神经元2表达，我们试图通过检测神经元2早期表达，从E8.5到9.5，使用切片原位杂交。神经元2在鳃外板中强烈检测到表达(图2G、J、M). 引人注目的是，没有神经元2在这些结构中检测到表达埃亚1^–/–处于这些阶段的胚胎(图2H、K、N)，与显而易见的不同神经细胞1在耳外胚层的表达。在所有三个Six1型^–/–胚胎，仅残留神经元2在VIIth前体中观察到表达(图2I)，其在第九代中的表达也降低，但在第X代前体中相对正常(图2I、L、O)与全山染色观察到的结果相似(图2F). 这一结果表明神经元2鳃上板的表达需要Eya1功能。

自删除以来神经元2结果在早期阶段，远端VII和IX神经节的神经命运短暂丧失，这些神经节的发育似乎在后期恢复神经元2^–/–动物，可能是由于功能补偿神经细胞1(Fode等人，1998年;Ma等人，1998年;Ma等人，1999年)因此，我们分析了E9.5到10.5突变胚胎中的其他神经元bHLH基因，以进一步确定埃亚1和Six1型突变的鳃表板。成绩单神经细胞1，与神经元2在腭突细胞和强烈的迁移性神经元前体中(图3A、D)，在中未检测到埃亚1^–/–远端VII、IX或X前体(图3B、E和数据未显示）。与第八神经节可变表型的观察结果一致Six1型^–/–用神经元2探针，六个中的两个Six1型^–/–胚胎显示了一些神经细胞1-双侧第八神经节原基中的阳性细胞(图3C)其他四个胚胎缺乏神经细胞1表达式（未显示数据）。同样，神经细胞1在第九个(图3F)并且在所有六个样本的X前体中含量较低Six1型^–/–胚胎（数据未显示）。在E9.5野生型鳃上板的切片中，我们发现神经元也在脱层前的板层外胚层内的细胞中表达，以及在向浓缩的第八、第九和第十神经节迁移的脱层前体中表达(图3G，J). 这些数据与之前报道的仅在小鼠迁移前体中的表达略有不同(Fode等人，1998年). 的表达式神经元在里面埃亚1^–/–鳃表前体缺失(图3H、K)，缺少Six1型^–/–六个胚胎中有四个的第七神经节(图3I)在所有分析的六个胚胎中，第九和第十神经节减少(图3L). 只有少数神经元-在6例患者中，有2例在双侧第VIIth前体细胞中观察到阳性细胞Six1型^–/–胚胎（数据未显示）。同样，一些数学3-或Nscl1号机组-在六分之二的第六代原基中观察到阳性细胞Six1型^–/–两种探针的双侧胚胎（数据未显示图3R)而在所有六个样本中，它们在第九个样本中的表达大幅减少，在第X个样本中略有减少Six1型^–/–胚胎(图3O、R). 在埃亚1^–/–胚胎，一些数学3-和Nscl1号机组-阳性细胞也见于埃亚1^–/–所分析的所有六个胚胎的X染色体单侧或双侧(图3N、Q). 总之，这些标记物的缺乏表达进一步表明埃亚1的上游功能神经元2-调控途径和Eya1缺失导致控制正常表达bHLH基因的感觉神经元命运的基因程序失活。

在颅感觉神经节的发育过程中，配对同源域蛋白Phox2a通过阻断多巴胺-β-羟化酶（DBH）的瞬时表达来控制去甲肾上腺素能特性，DBH是去甲肾上腺素（去甲肾上腺素）的末端生物合成酶，以及相关同源结构域蛋白Phox2b和GDNF受体亚单位Ret的表达(Morin等人，1997年;Pattyn等人，1997年). 作为Phox2a公司和神经元2独立激活，Phox2a控制的神经元亚型身份在遗传上独立于Neurog2控制的泛神经元基因表达子程序(Fode等人，1998年).Phox2a公司在鳃表板和迁移前体中表达(图4A)，同时Phox2b手机只在聚集形成神经节的细胞中表达(图4B)(Pattyn等人，1997年). 在埃亚1^–/–胚胎，表达Phox2a公司和Phox2b手机在第八和第九前体中也被废除(图4C、D)，尽管较弱Phox2a公司表达以及极少Phox2b手机-在Xth前体细胞中观察到表达细胞(图4C、D). E9.0-10.0的切片原位杂交进一步证实了这一观察结果（数据未显示）。相反，Six1型^–/–胚胎显示相对正常Phox2a公司和Phox2b手机在第X位表达，在第IX位表达减少，不存在（对于Phox2a公司)或明显减少（对于Phox2b手机)分析的所有四个胚胎的第八代前体细胞(图4E、F)，与在Six1型^–/–远端颅神经节（图2,三). 而我们对弱者的观察Phox2a公司中的表达式埃亚1^–/–第X个前体表明照片2基因可能独立于埃亚1在第X神经节的亚群中，缺乏照片2第VIIth和IXth的表达以及第X神经节的显著减少表明埃亚1和Six1型是正常表达的感觉神经元亚型前体的规范所必需的Phox2型基因。

为了进一步明确早期阻滞对腭突前体分层的影响，并测试颅骨神经嵴细胞是否会迁移到远端神经节，我们检查了晚期远端神经节的发育。E11.5至出生的组织学分析和E11.5-13.5的神经丝标记染色显示埃亚1^–/–胚胎完全缺乏鳃下板源性远端VIIth和IXth颅神经节(图5). 然而，在埃亚1^–/–胚胎(图5E). 在Six1型^–/–胚胎，虽然在每个阶段的所有四个胚胎中都完全没有第八神经节，但第九神经节存在，但大小减小，并且在所有胚胎中第X神经节相对正常(图5C、F、I、L). 综上所述，这些分析进一步证实了突变体中神经发生的早期停滞，并且在没有Eya1或Six1的情况下，颅骨神经嵴细胞无法填充远端神经节，这与神经元2突变体(Fode等人，1998年).

由于突变体中的远端神经节在后期未能恢复，我们进一步检查了第八、第九和第X颅神经的神经嵴衍生近端神经节的发育情况。转录因子Sox10已被证明对头部和躯干感觉神经节的形成至关重要，这些神经节来源于神经嵴细胞，它是外周神经胶质发育的关键调节因子(Britsch等人，2001年). 因此，我们使用Sox10型作为标记颅感觉神经节的探针。近端VII、IX和X神经节的anlagen被明亮的染色Sox10型在E9.5-10.5突变胚胎和正常胚胎中容易看到(图6A-C)，证实了这两个突变体在这些阶段都存在一些神经嵴衍生的近端VII、IX和X神经节。神经丝抗体染色进一步证实了这一点(图6D-F和图5A-F). 有趣的是，全山Sox10型神经丝染色显示，远端X神经节的最后部位于埃亚1^–/–胚胎（箭头，图6B、E). Vth神经节的发育似乎也受到突变的影响，因为其大小在埃亚1^–/–和Six1型^–/–胚胎(图6B、C、E、F). 发源于第五神经节的神经有时支配两个突变体的第二鳃弓（开放箭头，图6B、C、F). 这可能是由于V投射错误或尾侧鳃肌运动纤维通过V神经节的路径错误造成的。

为了进一步证实这一观察结果，并检查颅VII和VIII感觉神经节缺失对相关颅神经发育的影响，我们对颅神经组织及其在E12.5（数据未显示）和E13.5的投影进行了逆行和顺行标记。将亲脂性荧光染料从外周应用于颅神经V（红色）和VII/VIII（绿色），可标记正常胚胎中的V和VII运动神经元、V、VII和VIII传入神经以及V和VIII根(图6G-I). 在E13.5中埃亚1^–/–和Six1型^–/–从外周向VII/VIII神经注射DiI后，标记突变胚胎、无第八神经投射、VII运动神经元和传入神经(图6H、N、I、O). 然而，在这两个突变体中，V神经注射可以填充VII运动神经元(图6H、N、I、O). 而第五神经节外VII纤维的小突起在埃亚1^–/–胚胎(图6N)，一些VII运动神经元直接进入脑干内的第V神经节（箭头，图6O)或者投射到大脑外，只为了连接V神经（箭头，图6I)英寸Six1型^–/–胚胎。这一观察表明，我们早期关于突变体V系统异常纤维投射的数据(图6B、C、F)实际上显示了VII鳃运动神经元的走行错误。除了外周神经的走线错误外，我们还观察到脑干中的纤维轨迹发生了改变。在野生型小鼠中，V束的感觉成分中脑V（MesV）成分通常与降V束中的其他V纤维一起运行(图6J). 然而，在这两个突变体中，这条束都位于正常接受内耳投射的鼻翼板区域(图6H，I). 此外，在突变体中，V系统的中心投影明显扩大(图6K，L). 将长滤纸条应用于基板中所有耳前和耳后运动神经元，并将不同颜色的亲脂示踪剂应用于耳后翼板，可靠标记野生型动物内耳传出神经和耳周VII神经(图6P). 在埃亚1^–/–然而，它只标记了少数IX/X感觉神经元（红色）、外展神经（VI）、V和滑车神经（IV）（全部为绿色，图6Q). 在Six1型^–/–胚胎，VII运动神经元单独离开，但在大脑外与V纤维结合(图6R，I). 这些数据表明，包括内耳传出神经在内的所有内耳神经支配都缺失了，并且在这两个突变体中，如果存在第VII神经运动神经元，则与第V神经一同退出。

我们之前报道过小鼠埃亚1表达于颅骨板，包括E9.5的鳃表板(Xu等人，1997年a). 然而Six1型在小鼠发育过程中，外鳃板的表达以及这两个基因在外鳃板衍生的感觉神经元生成中的表达之间的详细关系尚未研究。因此，我们着手建立这些基因的表达如何与基因表达的区域和周期相关神经细胞2.Eya1早在E8.5（胚胎发育前），就在所有三个鳃下板中观察到表达。在E8.5至10.5胚胎的横切面上，埃亚1在基板细胞、迁移前体细胞和发育中的神经节中检测到表达(图7A，B和数据未显示）。然而，没有埃亚1在这些阶段，在V染色体上观察到表达（数据未显示）。杂合子X-gal染色Six1型^lacZ公司胚胎在E8.5到10.0时，它重演了Six1型mRNA表达模式(Xu等人，2003年;Zheng等人，2003年)，透露了Six1型在E8.5（转向前）胚胎的远端VIIth和IXth血小板前体细胞中强烈表达，在第X个血小板前体中弱表达（数据未显示）。从E9.0到10.0，在神经节无核细胞中的placodal、迁移和聚集神经元前体中观察到其表达(图7C、D、H). 类似于埃亚1，没有Six1型在V染色体上观察到表达（数据未显示）。因此，Six1型似乎早在埃亚1在远侧鳃表板中，两者稍早神经元2(Fode等人，1998年).

作为埃亚1作用于的上游Six1型耳腭发育期间(Zheng等人，2003年)，我们检测了它们在各自突变胚胎中的表达，以测试这两个基因在鳃上膜发育过程中是否也在同一遗传途径中发挥作用。有趣的是，埃亚1表达不受影响Six1型^–/–E9.0-10.0时的鳃上板(图7F、G)，但是Six1型在中检测不到表达埃亚1^–/–E9.5时的鳃上板(图7I)，表明Eya1-Six1型调控途径也在鳃表腭的发育中起作用。

Bmp7型在咽部内胚层中，已被证明是鳃表板诱导的信号分子，并且可以诱导Phox2a公司-直接来自非膜鳃板头部外胚层的阳性神经元(Begbie等人，1999年). 除了咽外胚层，埃亚1和Six1型在咽内胚层和神经嵴间质中表达(Xu等人，2002年). 因此，我们检查了Bmp7型中的表达式埃亚1^–/–和Six1型^–/–并发现其表达未受影响(图7E、J和数据未显示）。因此，Eya1和Six1可能在鳃表感觉神经元的早期发育中发挥细胞自主功能。

研究神经前体细胞的缺失埃亚1^–/–胚胎，我们进行TUNEL标记以确定胎盘外胚层细胞是否发生异常凋亡。E10.0中出现更多细胞死亡埃亚1^–/–牌匾(图8A-D). 第VIIth前体细胞中的凋亡细胞也增加，但所有三种前体细胞的第IX和X前体细胞相对正常Six1型^–/–胚胎分析（数据未显示）。这一分析表明，一旦未能激活其正常发育程序，突变胚胎中的祖细胞就会发生凋亡。

具有不同胚胎起源的颅感觉神经节神经元必须发育适当的神经节，并向适当的靶区和细胞及其后脑内的中央靶核发出外围过程(科尔德斯，2001;Fritzsch，2003年;Maklad和Fritzsch，2003b). 虽然已知近端神经节和VIII的神经元由Neurog1指定，而鳃表神经元由Neurag2决定(Fode等人，1998年;Ma等人，1998年;Ma等人，1999年)，驱动这些过程的细胞和分子机制尚不清楚。我们的结果表明，在没有Eya1或Six1的情况下，存在需要Neurog1功能的成神经细胞前体。相比之下，正常发育需要Neurog2功能的VIIth、IXth和Xth颅神经的远端神经节在埃亚1^–/–和Six1型^–/–胚胎。此外，我们发现，感觉神经节形成的破坏导致颅神经中鳃运动神经元的进一步模式缺陷。这些分析现在确定了这两个基因在颅神经模式和多样化中的特定作用。

耳外胚层早在耳板在形态学上变得明显之前的阶段就被编程为第八神经节的神经发生。最近的研究发现，正常的神经发生需要许多基因，但对其发育的细胞机制知之甚少。在这项研究中，我们仔细评估了第八神经节的神经发生埃亚1和Six1型变种，使用神经细胞1和神经元作为早期的分子标记，现在已经证明埃亚1和Six1型基因对于神经发生的启动是不可或缺的。然而，我们发现缺乏Eya1或Six1会减少耳外胚层内成神经细胞前体细胞的数量，这表明它们需要维持神经发生。自神经细胞1表达水平在神经细胞1-突变耳外胚层中检测到的阳性细胞，但数量神经细胞1-无效突变胚胎中的阳性细胞明显减少(图1)，耳外胚层内神经发生减少的一个可能解释是Eya1和Six1是神经母细胞祖细胞增殖所必需的。与这一想法一致，脉冲期BrdU掺入研究显示，早在E8.75突变胚胎中通常指定神经母细胞的腹面区域中BrdU标记细胞较少(Zheng等人，2003年). 此外，TUNEL检测发现，突变耳外胚层发生异常凋亡，也可能导致神经母细胞祖细胞减少(Xu等人，1999年;Zheng等人，2003年).

指定后，神经母细胞前体通常从外胚层迁移并聚集形成第VIII神经节。这种上皮-间充质转变涉及分层前体的许多变化，细胞外基质（ECM）可以诱导和增强其显性分化(海伊，1993). 我们的数据还表明，神经母细胞分层不需要Eya1和Six1(图1). 作为异常凋亡，这可能反映了埃亚1-或Six1型-在尚未表达的突变体神经节原基中观察到依赖性前体细胞SCG10系列(图2)，它们可能调节前体细胞的进行性分化。应该注意的是埃亚1和Six1型也表达于耳周间质。然而，尚不清楚其间充质表达的缺失是否也会导致该缺陷。Eya1或Six1的组织特异性缺失需要解决它们在间质中表达对耳神经节发育的相对贡献。尽管如此，我们早期的结果表明Eya1和Six1都调节早期神经元的分化和维持。

除了耳板，埃亚1和Six1型在其他神经原性斑块和颅感觉神经节中共存(Xu等人，1997年a;Sahly等人，1999年;David等人，2001年). 中的研究果蝇属眼部影像盘显示艾娅是上位的所以两种基因相互交叉调节以维持其表达(Pignoni等人，1997年). 我们的发现Six1型鳃下板的表达是埃亚1依赖性表明果蝇Eya-Six鳃表腭发育中的调节盒，与早期耳发育中观察到的调节盒相似(Zheng等人，2003年). 与这两个突变体的共同耳表型相比，远端颅神经节的表型在Six1型比中的埃亚1突变体。正如我们发现的那样Six1型几乎早在埃亚1，这一发现的一个经典解释是与另一个共表达分子的功能冗余。关系密切的家庭成员Six4系列也在早期的颅感觉神经节中表达，并显示出与Six1型(Oliver等人，1995年;Esteve和Bovolenta，1999年;小林等，2000年;潘杜尔和穆迪，2000年;Ghanbari等人，2001年;Ozaki等人，2001年). 尽管Six4系列尚未描述小鼠胚胎发育期间在小鸡中的表达Six4系列在外胚层板中检测到转录物，包括嗅觉板、视神经板、耳板和所有鳃表板，只要它们获得身份(Esteve和Bovolenta，1999年). 因此，Six1型和Six4系列可以补偿彼此在颅感觉神经节中的作用。在不同的bHLH基因之间发现了这种补偿机制神经元2和神经病1，Mash1和数学3，或马什1和神经元2在神经发生中(Ma等人，1999年;Tomita等人，2000年;Nieto等人，2001年)，对于同系物帕克3和第7页，以及Pax1型和第9页其他发育系统中的基因(Borycki等人，1999年;Peters等人，1999年). 这可以解释为什么Six1型突变表型似乎是可变的，比埃亚1突变体以及为什么Six4系列突变小鼠没有表现出胚胎表型(Ozaki等人，2001年).

我们的数据表明，虽然突变体的第八和第八神经节中形成了一些神经元前体，但在E13.5中未发现任何感觉神经元的踪迹。在没有任何可存活的感觉神经元的情况下，VII运动神经元通过两个突变体的V神经节系统投射。这与先前在没有V神经节的情况下将V运动纤维重新路由到VII神经的发现一致(Ma等人，2000年)支持感觉神经元可能吸引鳃运动神经元纤维的假说(Fritzsch和Northcutt，1993年). 以前曾注意到躯体感觉纤维向前庭核的中央扩张(Fritzsch，1990年). 然而Six1型和埃亚1突变小鼠可能与这些基因的中枢和外周作用有关。值得注意的是，人类的单倍体不足眼睛A1或SIX1系列结果出现鳃耳肾综合征（BOR），这是一种以鳃裂、听力损失和肾脏异常为特征的常染色体显性发育障碍(Abdelhak等人，1997年;Ruf等人，2004年). 还描述了不到20%的受影响患者出现的轻微异常，包括面神经麻痹、泪道再生障碍和味觉流泪(Smith和Schwartz，1998年)这些特征反映了颅神经轨迹的异常。

神经元前体的分层是脑板神经发生过程中分化的第一个形态学标志。在参与早期感觉神经发生的转录因子中，Neurog2似乎是神经元前体分层所必需的，而这一过程在神经元2突变鳃表板(Fode等人，1998年). 虽然Phox2a也在鳃表板中表达，但它并不控制神经元前体细胞的分层及其聚集到神经节原基中(Morin等人，1997年). 我们的研究表明，Eya1和Six1的最初表达发生在脱层前鳃表板的外胚层神经元2和Phox2a公司在突变胚胎中丢失（图2,三)，表明发生分层之前需要Eya1和Six1功能。因此，Eya1可能在鳃表腭外胚层神经元前体的初始选择中起作用，如果没有Eya1神经元2-和Phox2a公司-可以不指定表达细胞。作为埃亚1在迁移前体和形成神经节中也表达，可能在神经元前体分化过程中调节迁移和聚集。

由于表达Phox2a的鳃表板细胞也表达最高水平的神经元2转录本，相同的信号可能参与这两个基因的诱导，耦合通用和神经元识别子程序(Lo等人，1999年). 然而，诱导信号的性质目前尚不清楚。我们的结果表明Eya1可能诱导神经元2和Phox2a公司当Neurog2和Phox2a被激活时，它们将触发腭外胚层细胞中的神经元分化。未能激活其正常分化程序将导致这些外胚层细胞凋亡(图8). 与Eya1在Neurog2和Phox2a基因上游起作用的观点一致，远端感觉神经节的形成在埃亚1^–/–胚胎比神经元2^–/–(Fode等人，1998年)或Phox2a公司^–/–胚胎(Morin等人，1997年). 我们的数据表明，存在不同的机制控制不同板之间的鳃上神经元分化。一些鳃表神经元完全无法发育，但其他神经元，如第X神经节，部分存在于埃亚1^–/–胚胎，或在Six1型^–/–胚胎。同一神经节在神经元2和Phox2a公司突变小鼠(Fode等人，1998年). 我们的研究结果表明，在埃亚1^–/–胚胎比神经元2^–/–通过标记分析判断的胚胎（图4,5)与以下观点一致：埃亚1的上游功能神经元2因此，尽管不同的板对区域特异性信号有可能产生反应，但我们的研究清楚地表明，Eya1和Six1通过调节神经元2和Phox2a公司.

值得注意的是埃亚和六基因也在肌原细胞中共同表达，并参与控制肌肉发育的分子网络(Heanue等人，1999年;Fougerousse等人，2002年;Laclef等人，2003年). 与神经系统相似，肌肉的分化主要依赖于四种bHLH因子：Myf5、MyoD、Myogenin和Mrf4(Weintraub等人，1991年). 与它们在神经发生中的早期作用相反，来自肌肉的最新数据表明埃亚和六基因似乎参与肌源性分化的后期步骤，但不激活Myf5的表达，Myf5作为肌源性决定因子激活其他bHLH肌源性因子(Fougerousse等人，2002年;Delfini和Duprez，2004年). 因此Eya-Six公司调节层级可能通过神经和肌肉中的类似分子网络进行操作，但在感觉神经元和肌肉分化程序之间的不同步骤起作用。

我们感谢J.-F.Brunet慷慨提供Phox2a公司和Phox2b手机，D.Anderson代表SCG10系列，M.Wegner代表Sox10型现场探针和J.Davenport寻求技术援助。通过从M.J.默多克慈善信托基金会（M.J.Murdock Charitable Trust）获得拨款购买的设备，光学显微镜和图像分析成为可能。这项工作得到了美国国立卫生研究院RO1 DC05590（B.F.）和美国国立卫生研究院RO1 DC05824（P.-X.X.X.）的支持。