逆行内大麻素信号转导减少GABA能突触向促性腺激素释放激素神经元的传递

大麻素通过降低下丘脑GnRH输出抑制生育。γ-氨基丁酸（GABA）_A类受体（GABA_A类-R） 介导的传播是GnRH细胞的主要输入，可能具有兴奋性。我们假设大麻素通过抑制GABA能量输入发挥作用。我们对成年雄性GnRH-绿色荧光蛋白转基因小鼠的急性切片进行了松斑电生理研究。浴敷1型大麻素受体（CB1）激动剂WIN55212可降低GnRH神经元放电率。这种作用在谷氨酸受体拮抗剂犬尿酸存在时可以检测到，但在荷包牡丹碱也存在时则消失，表明GABA_A类-R参与。在免疫细胞化学实验中，CB1免疫反应性轴突与GnRH神经元形成接触，一个子集建立了具有GABA能神经传递特征的对称性突触。在河豚毒素存在的情况下，通过全细胞斑贴电生理学继续进行功能研究。WIN55212降低了GABA的频率_A类-R-介导的微型突触后电流（mPSCs）（反映自发的小泡融合）被CB1拮抗剂AM251阻止，这表明突触前CB1的激活抑制了GABA的释放。AM251单独增加了mPSC频率，提供了内源性大麻素类物质对GABA具有张力抑制作用的证据_A类-R驱动GnRH神经元。当用四氢利普抑素在细胞内阻断二酰基甘油脂肪酶时，mPSC频率没有增加，这表明紧张抑制是由GnRH神经元产生2-花生四烯醇甘油引起的。氯化镉₂在细胞外溶液中可以维持动作电位和自发囊泡融合。在这些条件下，当AM251阻断内源性大麻素介导的对自发囊泡融合的阻断时，GnRH神经元的放电增加，揭示了内源性内源性大麻素对GnRH-神经元放电的抑制作用。逆行内源性大麻素信号可能是GnRH神经元在生理和病理条件下调节兴奋性GABA能输入的重要机制。

大麻植物的主要精神活性物质Δ-9-四氢大麻酚（THC）调节在下丘脑控制下运作的一系列内分泌功能(1). THC通过抑制腺垂体LH分泌影响生殖生理的各个方面(2–5). 普遍认为，大麻素通过减少下丘脑GnRH神经元的神经分泌输出来抑制促性腺激素的释放。因此，1）THC不抑制腺垂体LH分泌在体外(6,7)，2）GnRH防止大麻素对排卵和LH分泌的抑制作用(三,6,8)侧脑室注射THC后血清LH降低与下丘脑腹内侧GnRH含量增加相一致(6).

在中枢神经系统中，THC的作用主要通过位于轴突末端的1型大麻素受体（CB1）发挥(1,9). 外源性四氢大麻酚或主要内源性大麻素配体（内源性大麻素）2-花生酰甘油（2-AG）和阿那达明对CB1的激活抑制神经递质的突触前释放，包括γ-氨基丁酸（GABA）(9–12)和谷氨酸(13,14). 2-AG在野生型（WT）小鼠中抑制LH分泌的能力，而在CB1受体敲除（KO）小鼠则没有，这证明了CB1受体在生殖轴中枢抑制调节中的重要性(15).

GnRH神经元的脉动分泌活动受突触输入的生理或病理改变的影响(16). 氨基酸神经递质GABA在这种传入调节中起着关键作用。GnRH神经元接受GABA能突触(17)并表达功能性GABA_A类受体（GABA_A类-卢比）(18–22)和GABA_B类(23)受体。而GABA是成人下丘脑的主要抑制性神经递质(24)成熟的GnRH神经元保持较高的细胞内氯化物浓度，这可能导致对GABA的兴奋性反应_A类-成年小鼠的R激活(18,21)和老鼠(25,26). GABA能驱动GnRH神经元的调节通常与代谢有关(27)，性类固醇(28)和昼夜节律(29)向GnRH神经元发出信号。

在目前的研究中，我们假设大麻素抑制GABA能神经传递到GnRH神经元。GABA下降_A类-R介导的驱动反过来会降低GnRH神经元的活性。为了验证这个假设，我们进行了一系列电生理和神经解剖研究。

材料和方法

动物

实验医学研究所（IEM）医学基因技术部（Medical Gene Technology Unit of Experimental Medicine）培育的成年性腺完整雄性小鼠来自当地群体。他们被安置在光控（光照12小时，暗循环12小时，0700小时开灯）和温度控制（22±2摄氏度）的环境中，可以免费获得标准食物和自来水。所有研究均获得了IEM动物福利委员会（编号：A5769-01）的许可，并符合欧洲共同体的法律要求（第86/609/EEC号法令）。采用C57BL/6J遗传背景培育的GnRH-绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠（n=70）进行电生理实验。在这个动物模型中，GnRH启动子片段在大多数GnRH-神经元中驱动选择性GFP表达(30). 对于免疫组织化学，使用了GnRH-GFP小鼠（n=5）和纯合CB1-KO小鼠（n=12）及其WT同窝伙伴（CB1-WT；n=12）。CB1-KO动物的亲本来源于比利时布鲁塞尔自由大学生物休曼与分子研究所（Institute de Recherche Inter-disciplinaire en Biologie Humaine et Moleculaire）(31)早先在IEM中转移到CD1（法国阿尔伯雷Charles River）基因背景。

脑切片准备和记录

小鼠于1100至1200小时之间因颈椎脱位而死亡。快速取出大脑，并将其浸入冰镇人工脑脊液（aCSF）中，该脑脊液中冒泡了95%O的混合物₂和5%CO₂溶液包含以下内容（单位：m米)：氯化钠135、氯化钾3.5、氯化钠_三26、硫酸镁₄1.2，NaH₂人事军官₄1.25，氯化钙₂2.5和葡萄糖10。解剖下丘脑块，用VT-1000S振捣器（德国威兹拉尔Leica GmBH）在冷冻充氧aCSF中从内侧隔/视前区（POA）制备250μm厚的冠状切片。将含有POA的切片沿中线平分，并在饱和O的脑脊液中平衡₂/CO公司₂在室温下保持1小时。在记录期间（在33℃下1400到1800小时），通过向aCSF中加入O来给脑片充氧₂/CO公司₂天然气。使用Axopatch 200B接线灯放大器、Digidat-1322A数据采集系统和pCLAMP 9.2软件（加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件公司）进行记录。用BX51WI IR-DIC显微镜（Olympus Co.，Tokyo，Japan）观察细胞。贴片电极（外径=1.5 mm，薄壁；加利福尼亚州克莱蒙特Garner Co.）用Flaming-Brown P-97拉拔器（加利福尼亚州诺瓦托Sutter Instrument Co.）拉拔，并用MF-830微锻抛光（日本东京Narishige）。

根据GnRH-GFP神经元的绿色荧光、典型的纺锤形形状和POA中的地形位置，使用外荧光滤光片组在470 nm处短暂照射，识别出GnRH-GFP神经细胞(30). 对照记录后，用各种药物处理切片10分钟，并重复记录250秒。评估药物疗效时，每个神经元作为自己的对照。

松-补丁-灯实验

记录GnRH神经元在33 C下的动作电流放电。移液管电位为0 mV，移液管电阻为1–2 MΩ，松斑密封电阻为7–40 MΩ。所含移液管溶液（单位：m米)：氯化钠150、氯化钾3.5、氯化钙₂2.5，氯化镁₂1.3、HEPES 10和葡萄糖10（pH 7.3，NaOH）。

记录基础动作电流后，在1μ米持续10min，重复记录。在调查GABA参与的实验中_A类-WIN55212动作中的R激活，离子型谷氨酸受体首先被2 m阻断米氰尿酸（Kyn）10分钟，然后GABA_A类-20μRs米荷包牡丹碱（Bic）-甲碘化物作用10分钟。随后，将WIN55212添加到细胞外溶液中。结合使用离子型谷氨酸受体阻滞剂和Bic是预防脑片兴奋性张力失衡策略的重要组成部分(21,32,33).

在CdCl存在的情况下，强直性内源性大麻素释放对GnRH神经元放电的推测作用被提出₂(200 μ米; 10分钟）。氯化镉₂在aCSF中，由于自发囊泡融合，允许动作电位和神经递质释放继续，但阻止动作电位依赖性神经递质的释放(34). 通过研究添加CB1拮抗剂AM251（1μ米; Tocris，Ellisville，MO）在CdCl存在的情况下向aCSF注射10分钟₂.氢氧化钠₂人事军官₄在本实验中，aCSF中省略了，以避免沉淀。

全细胞贴片灯实验

将电池电压箝位在−70 mV的保持电位。移液管偏移电位，串联电阻（R_秒)和电容在记录前进行了补偿。仅使用低保持电流（<50 pA）和稳定基线的细胞。输入电阻（R_在里面)，右_秒，和膜容量（C_米)在每次记录之前，也使用5-mV超极化脉冲进行测量。为了确保一致的记录质量，只使用带有R的单元格_秒<20兆欧，R_在里面>500 MΩ和C_米>接受10 pF。此外，如果这些值在测量过程中变化超过20%，则记录将被丢弃(35). 所含移液管溶液（单位：m米)：HEPES 10、KCl 140、EGTA 5、CaCl₂0.1、Mg-ATP 4和Na-GTP 0.4（pH 7.3，NaOH）。贴片电极的电阻为2–3 MΩ。在所有实验中，通过添加电压敏感性Na-通道抑制剂河豚毒素（TTX）（750 n米; 在对照组10分钟前，记录Tocris对aCSF的微突触后电流（mPSCs）。苦毒毒素（100μ米; 在aCSF中使用Sigma，St.Louis，MO）来验证mPSCs与GABA相关_A类-R激活。在随后的实验中，通过用CB1激动剂WIN55212（1μ米; 在其他实验中，切片与CB1拮抗剂AM251（1μ米; Tocris）10分钟并记录。然后是WIN55212（1μ米)最后，研究了调节GABA能传入GnRH神经元的内源性大麻素的来源：将二酰甘油（DAG）脂肪酶抑制剂四氢利普抑素（THL）添加到细胞内溶液中，浓度为10μ米阻止2-AG合成。为了尽量减少THL溢出，快速接近GnRH细胞（<1分钟），aCSF的流速从5–6 ml/min增加到8–9 ml/min。就在释放移液管中的正压之前，流速恢复到5–6 ml/min，以避免切片的任何机械移动。在对照记录之前，让含有THL的移液管溶液与细胞内环境平衡25分钟。然后添加AM251 10分钟并重复记录。

统计分析

每个实验组包含8到10个记录的细胞，来自6到7只动物。离线存储和分析记录（250秒）。使用我们实验室开发的Corrector软件（L.Tatai、G.Lőcsei、B.Wittner和Judit BaílintneíFarkas）对动作电流和mPSC记录进行基线校正。简而言之，背景电流的波动通过一个300点窗口的运行平均值来平滑，该窗口逐点移动。在应用的采样率（4 kHz）下，该宽度不会导致mPSC和动作电流失真。使用PClamp 9.2软件（Molecular Devices Co.）的Clampfit模块进行事件检测。组数据表示为平均值±扫描电镜使用学生的t吨测试或方差分析，然后进行Newman-Keuls（NK）测试（GraphPad Software，Inc.，GraphPad，San Diego，CA），并在P（P）<0.05。

免疫组织化学切片的制备

用氯胺酮（25 mg/kg）、木聚维酮（5 mg/kg）和哌泊酚（2.5 mg/kg）混合液在盐水中深度麻醉小鼠，并首先通过升主动脉灌注10 ml PBS[0.1米（pH值7.4）；PBS]，然后在PBS中加入40 ml固定剂。该固定剂含有4%的多聚甲醛（PFA）用于明场和荧光显微镜，4%的PFA和0.2%的戊二醛（GA）用于电子显微镜。立即用10 ml 4%PFA冲洗含GA的溶液，以防止组织和抗原过度交联。灌注后的大脑在4C的2%PFA中放置过夜。从POA/下丘脑前部（AH）的头端-末端用振动棒切割30μm厚的冠状切片。

附着于GnRH神经元的CB1免疫反应（IR）纤维的共聚焦显微镜分析

用0.5%Triton X-100（20分钟）、0.5%过氧化氢（H₂O（运行）₂和2%正常马血清（20分钟）。在室温下进行PBS（3×5 min）的所有处理和冲洗，除了在4℃下进行一级抗体和荧光色度培养外。一级抗体在鸡尾酒中应用72 h；山羊抗CB1抗体（1:100，针对小鼠CB1的C末端31个氨基酸）(36)在转基因小鼠的研究中，将抗血清与GnRH兔抗血清（1:10000；LR1；来自R.Benoit，McGill University，Montreal，Canada）混合，或者作为替代，与GFP兔抗血清（1:5000，ab3080；Millipore，Bedford，MA）混合。通过连续应用生物素化驴抗兔免疫球蛋白（IgG，1:500，2 h；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）、过氧化物结合亲和素-生物素复合物（ABC）（1:1000，1 h；Vector Laboratories，Burlingame，CA）、生物素化酪胺（1:200，0.5 h）、，和Alexa Fluor 488-共轭链霉亲和素（1:500，24小时；分子探针，尤金，俄勒冈州）。CB1-IR位点与碳菁3-偶联驴抗原IgG反应（1:500，12 h；Jackson ImmunoResearch）。最后，将节段安装在玻璃载玻片上，并用Vectashide安装介质覆盖玻片（Vector Laboratories）。

使用Radiance 2100共焦显微镜（英国Hemel Hempstead Bio-Rad实验室），使用以下激光线和滤光片对荧光信号进行研究：Alexa Fluor 488和增强型GFP的488 nm、543 nm Cy3和二向色/发射滤光片、Alexa Furo 488和强化型GFP为560 nm/500–540 nm、Cy3为650 nm/560–610 nm。使用一个60×油浸物镜制备了一系列光学截面。顺序扫描的红色和绿色通道与激光Vox软件（Bio-Read Laboratories）和兼容IBM-的个人计算机（德克萨斯州奥斯汀市戴尔公司）合并并显示。只有当光学切片中的CB1和GnRH-IR轮廓之间的间隙小于0.7μm时，才考虑同位。CB1受体免疫标记的特异性通过与CB1-WT动物组织平行处理的CB1-KO小鼠切片中无免疫反应来验证。

GnRH神经元CB1-IR输入的光镜和电镜分析

用PFA-GA混合物固定的一组脑切片用1%硼氢化钠预处理30分钟，用0.5%H预处理₂O（运行）₂然后，用15%（15min）的蔗糖对其进行冷冻保护，然后在PBS中用30%的蔗糖进行冷冻保护（12h）。在液氮上进行三次连续的冻融循环，以使切片渗透。最后，使用2%的正常马血清（20分钟）以防止非特异性抗体结合。连续两步对预处理的切片进行CB1和GnRH双重免疫染色。首先，将切片在山羊抗CB1抗体（1:900，4 d）、生物素化驴抗原IgG（1:500，1 d；Jackson ImmunoResearch）和ABC Elite溶液（1:1000，1.5 h）中孵育。该信号用银金强化镍二氨基联苯胺可视化，并在别处进行了详细修改(37). 接下来，将切片转移到兔抗GnRH抗体（1:5000，2天）、生物素化驴抗兔IgG（1:500，1天）和ABC Elite溶液（1:1000，1.5小时）中。用二氨基联苯胺检测GnRH信号。用1%四氧化锇处理双标切片60分钟，用2%醋酸铀酰（在70%乙醇中制备）处理40分钟，然后用升序的乙醇和环氧丙烷脱水。在预先涂有液体脱模剂的一对玻璃显微镜载玻片之间，在TAAB 812中等环氧树脂中进行平包埋（电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德）。允许树脂在56℃下聚合2 d。使用Leica Ultracut UCT超薄切片机（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）将超薄切片收集到Formvar涂层的单槽网格上，与2%柠檬酸铅进行对比，并使用Jeol-100C透射电子显微镜进行检查。

结果

CB1受体的激活降低GnRH神经元的活性

为了验证大麻素信号抑制GnRH神经元电活动的假设，采用松斑法从成年雄性GnRH-GFP转基因小鼠的GnRH-神经元记录动作电流(38). 给药CB1激动剂WIN55212（1μ米)将动作电流的频率降低到控制的49±15%（控制，0.6±0.07 Hz；WIN55212，0.3±0.08 Hz）(P（P）=0.0136，按学生配对t吨测试）(图1A). 这一发现支持了POA中CB1信号导致GnRH神经元电活动净减少的假设。振幅没有变化（对照组的107±6.5%）。

突发（S/B）内的平均峰值数（对照细胞为4.2±0.2）减少了8±2.5%(P（P）=0.043，学生配对t吨测试）响应WIN55212处理。间期（IBI）（对照组为34±11.2秒）增加了47±11%(P（P）=0.022），而脉冲间隔（S/B之间的时间，在对照细胞中为0.2±0.03秒）没有改变。

WIN55212通过调节GABA降低GnRH神经元活性_A类-R信号

在其经典的作用模式中，内源性大麻素与突触前CB1受体结合，以减少神经递质的释放(9). 因为GABA通过GABA行事_A类-R是GnRH神经元传入调节中的主要神经递质(16)，我们分析了在GABA存在下WIN55212的作用_A类-R阻滞剂Bic（20μ米). 因为在这种范式中，由于不平衡的兴奋音调，不可能正确解释实验结果(21,32,33)，细胞外溶液还含有离子型谷氨酸受体阻滞剂Kyn（2 m米).

Kyn使GnRH神经元的放电频率增加了95±20.8%（对照组，0.48±0.07 Hz；P（P）=0.0022（按配对学生）t吨测试）。S/B增加了14±3.1%(P（P）=0.021；对照组为4.2±0.2），IBI下降48±9%(P（P）= 0.017; 控制，34±11.2秒）。针对随后服用1μ米WIN55212，频率降低了33±2.4%(P（P）=0.015（按配对学生）t吨测试）(图1、B和D）。S/B参数降低了13±4%(P（P）=0.037），IBI增加了57±13%(P（P）= 0.029). 在整个治疗过程中，动作电流的幅度没有变化。上述研究结果表明，1μ米WIN55212可以独立于离子型谷氨酸受体降低GnRH神经元的放电活动。表明潜在机制包括GABA_A类-R依赖性神经传递，我们测试了WIN55212是否也能降低GABA存在时GnRH神经元的放电活动_A类-R拮抗剂Bic（20μ米). 与之前的研究结果类似，GnRH神经元的放电频率（0.55±0.07 Hz，100%）在2 m米Kyn，达到控制频率的181±24.4%(P（P）=0.037（成对学生）t吨测试）(图1、C和E）。S/B增加14±3.1%（对照组4.2±0.2；P（P）=0.037），IBI下降48±9%（对照组，34±11.2秒；P（P）= 0.025). 在添加Bic 10分钟后，放电率下降了57±10.3%（方差分析，P（P）=0.0143和NK试验，P（P）=0.012；缅元+比克与。缅元）(图1、C和E）。S/B下降23±4.2%(P（P）=0.033），IBI增加了63±18%(P（P）= 0.021). 随后添加1μ米WIN55212无法进一步降低放电频率，提供了CB1受体激活通过干扰GABA降低GnRH神经元活性的证据_A类-R介导的信号传导。有趣的是，GnRH神经元的放电率趋向于增加而不是减少（70.5±21.9%），尽管这种影响没有达到统计学意义（NK试验，P（P）=0.071，缅元+比克+WIN与。缅元+比克）(图1、C和E）。S/B和IBI没有进一步变化。在整个治疗过程中，动作电流的幅度和脉冲间隔保持不变。

GnRH神经元的GABA能传入表达CB1受体

上述发现证实了WIN55212对GnRH细胞活性的抑制作用是由包含GABA能中间神经元并使用GABA的神经回路介导的_A类-卢比。这种电路的复杂性尚不清楚。因为GABA是GnRH神经元传入调节中的主要神经递质(16)此外，GABA_A类-R激活刺激GnRH神经元(18,21,25,26,39)，我们假设WIN55212直接抑制GnRH神经元的GABA能输入，从而降低GnRH-神经元的活性。为了研究这一机制，我们研究了GnRH神经元突触传入上CB1受体的存在。首先用共焦显微镜检查CB1-IR轴突。这些研究揭示了CB1-IR纤维与GnRH神经元的核周和树突的频繁并置(图2，A–D）。用双标记预埋免疫组织化学法进一步研究神经接触。在光镜下研究时，单个CB1-IR纤维经银金强化镍二氨基联苯胺染色后显示中等的标记强度，并在POA/AH中形成密集的网络，GnRH神经元（经棕色DAB染色）驻留于此(图3、A和B）。在电子显微镜下，GnRH神经元呈现中等电子密度(图3C). 在轴突轮廓中观察到高电子密度银金颗粒检测到的CB1免疫反应(图3、D和E）。CB1-IR轴突终末与GnRH-IR树突形成突触接触(图3D)和perikarya(图3、E和F）。这些突触属于两种不对称突触(图3、D和E）和对称(图3F)类别，表明对GnRH神经元的CB1-IR输入的功能多样性。照片面板显示了五只小鼠在光镜、共焦显微镜和电镜实验中获得的免疫细胞化学结果。

通过突触前CB1受体的大麻素信号降低GnRH神经元中GABA能mPSC

细胞外应用100μ米苦毒毒素（n=8个细胞）(图4A)，表明它们是由GABA引起的_A类-R激活。

CB1受体激动剂WIN55212（1μ米)降低了mPSC的频率(图4GnRH神经元52±8%（对照，0.4±0.03 Hz，Student’st吨测试，P（P）= 0.0035). mPSC的振幅没有显著变化（对照组，−49±6 pA；WIN55212，−54±104 pA）(图4E). 在AM251存在的情况下，WIN55212无法改变mPSC的频率或振幅（AM251对照组，0.6±0.08 Hz；AM251+WIN55212，0.7±0.05 Hz；AM25对照组，−50±8 pA；AM251+WIN55211，−五十±8 pA.）(图4，C–E），证实CB1受体介导GnRH神经元GABA能传入中自发囊泡融合的突触前抑制。

内源性大麻素抑制GnRH神经元上泡状GABA的释放

CB1拮抗剂AM251（1μ米)单独增加mPSC的频率63±15%（对照，0.4±0.03 Hz；AM251，0.6±0.08 Hz）（学生的配对t吨测试，P（P）= 0.0489) (图5、A和D）。mPSC频率的增加表明AM251可以暂停内源性抑制性内源性内源性大麻素对GABA能终末的作用。mPSC的振幅保持不变（对照组，−49±6 pA；AM251，−50±8 pA）(图5E).

内源性大麻素对GnRH神经元放电起内源性刹车作用

AM251通过暂停内源性阻断随机GABA囊泡融合来增加mPSCs的频率。为了测试这种阻滞是否也对GnRH神经元尖峰放电起到刹车作用，在CdCl存在的情况下进行了松斑测量₂(200 μ米). 氯化镉₂维持动作电位并阻止动作电位依赖性神经递质的释放。由于它避免了由于随机、自发的小泡融合而导致的神经递质释放，因此已成功用于小脑浦肯野细胞中GABA能mPSC的早期研究以及CB1激动剂WIN55212对其的抑制(34).

氯化镉₂应用10min后，GnRH细胞的放电率降低了33±12%（对照组，0.6±0.04Hz；P（P）=0.030，学生的t吨测试），这可能反映出GABA输入缺乏动作电位依赖性神经递质释放，或低电压激活的钙通道启动的尖峰消失(图5、B和F）(40,41). 添加AM251后，燃烧率增加了210±22%(P（P）= 0.012) (图5、B和F）。氯化镉₂S/B降低10±2%（对照组，4.2±0.2；P（P）=0.043），而AM251将S/B增加到17±5.2%(P（P）= 0.046). 氯化镉₂IBI增加82±23%（对照组，34±11.2秒；P（P）=0.028），而AM251降低了63±17%(P（P）= 0.034). 这些数据表明，GnRH神经元的兴奋性处于抑制性内源性大麻素张力之下。

GnRH神经元产生2-AG能抑制GABA对GnRH-神经元的驱动

在一种经典的内源性大麻素信号传导模式中，突触前神经递质的释放被突触后来源的内源性大麻素抑制(9). 大脑中最丰富的内源性大麻素是2-AG(11). 因此，我们假设GnRH神经元产生2-AG，这解释了突触前抑制GABA释放的原因。将DAG脂肪酶抑制剂THL添加到10μ米阻断GnRH细胞中的2-AG合成。与对照组相比，THL显著增加了mPSC的频率[对照组为0.4±0.03 Hz；THL为对照组的148±12%(图5，C与A相比）；组间分析/ANOVA，然后是事后（post-hoc）NK测试/ANOVA，P（P）=0.00008，F=8.481；NK、，P（P）= 0.0235]. 此外，THL阻止了AM251对mPSC频率的影响（THL对照，0.6±0.07 Hz；THL+AM251，0.6？.05 Hz）(图5、C和D）。mPSC的振幅不受影响（THL对照，−48±5 pA；THL+AM251，−49±2 pA）(图5、C和E）。这些数据提供了证据表明，强直性抑制是由GnRH神经元产生2-AG引起的。

讨论

本研究提供了电生理学和形态学证据，证明逆行内源性大麻素信号通过激活突触前CB1受体减少GABA能传入GnRH神经元的驱动。GABA降低_A类-R信号反过来抑制GnRH神经元的放电活动。该机制如图所示图6.

虽然有些争议(19,20)，越来越多的证据表明，GABA可以作为突触后GABA的兴奋性神经递质_A类-啮齿动物和鱼类成年GnRH神经元的R通道(18,21,25,26,39). 本研究发现WIN55212通过GABA降低GnRH神经元的放电频率_A类-GABA能传入的R依赖机制和CB1受体激活降低GABA_A类-GnRH神经元中R-介导的mPSCs为GABA对Gn RH神经元活动的兴奋作用提供了间接证据。

虽然在WIN55212存在下，GnRH神经元电活动降低可能是由于大麻素对一个复杂的多神经元回路的作用影响到GnRH-神经元，但形态学实验结果表明，GnRH神经元接受直接的大麻素敏感神经元输入。CB1-IR突触子集的对称形态也表明GABA能神经传递(17). GABA是GnRH神经元传入调节的主要神经递质(16).

为了进一步研究这些突触释放GABA的大麻素依赖性调节，在TTX存在下从GnRH神经元记录mPSC，以排除活动依赖性效应。我们发现，CB1激动剂WIN55212减少了GnRH神经元上GABA的释放，GABA频率的降低揭示了这一点_A类-R介导的mPSC。这一发现与大麻素可以通过动作电位无关机制调节神经递质释放的概念相一致(1,9). mPSCs的频率而非振幅发生改变的观察结果与WIN55212治疗对GABA释放的突触前效应一致(42).

我们认为突触前CB1抑制GABA能传入GnRH神经元可能是大麻药物抑制LH释放的主要机制(2–6,8). 在生理学背景下，细胞内应用THL后GnRH神经元的mPSC频率降低，表明GnRH神经元产生2-AG以张力抑制其GABA能输入。因为GABA在GnRH神经元活动的调节中起着关键作用(29,43–45)这种逆行信号的任何改变都会导致GnRH神经元活动的功能性后果。因此，GABA能驱动对GnRH神经元的调节通常与代谢有关(27,45)，雌激素(29)和昼夜节律(29)向GnRH神经元发出信号。如果传递这些传入方式的GABA能通路被GnRH神经元的逆行内源性大麻素信号调节，则需要澄清。

AM251本身增加了GnRH神经元中GABA能mPSCs的频率，这一观察表明内源性大麻素的产生和逆行作用。此外，在CdCl存在下进行的松斑实验的结果₂提供证据表明内源性大麻素起到内源性刹车的作用，抑制GnRH神经元尖峰反应，而AM251可以暂停这种反应。

在GnRH细胞内阻断DAG脂肪酶后，缺乏强直抑制，这表明GnRH-神经元是起作用的内源性大麻素2-AG的来源。鉴于GABA在GnRH神经元传入调节中的兴奋作用，这种抑制音调可能特别重要(18,21,25,26,39). 由于GnRH神经元的活动是由GABA和谷氨酸这两种兴奋性神经递质驱动的，因此需要其他控制系统来稳定GnRH网络的活动。有证据表明，GnRH神经元的激活抑制了GABA能对这些细胞的传入驱动(46). 我们认为内源性大麻素逆行信号可能在这一现象中起着至关重要的作用。类似于其他类型的神经元(9)GnRH细胞可能会通过增强内源性大麻素的产生来对激活作出反应，而内源性大马士革素的产生反过来又会减少或关闭GnRH-神经元释放GABA。在GABA去极化的相同特定背景下，内源性大麻素对GABA驱动的活性也有类似的强烈控制作用，以发育皮层网络(47).

大麻素是否也抑制GnRH神经元的谷氨酸能输入尚待确定。目前的免疫电镜研究发现，除了GnRH神经元上的对称突触外，还有CB1-IR不对称突触的形态学证据，这表明一些大麻素敏感的传入可能是谷氨酸能的。另外，这种突触也可能属于下丘脑中观察到的非典型GABA能终末(48,49). 值得注意的是，雌性大鼠室周前腹侧核的一组神经元表现出GABA/谷氨酸双重表型(50)它们的突触形态可能不典型。然而，尽管在目前和以前的研究中，在所有GnRH神经元中都检测到GABA能PSC(19,20,27,28)，优化的记录条件未能在20-35%的GnRH神经元胞体中检测到谷氨酸能兴奋性PSCs(51). 这只能部分归因于技术问题，即兴奋性输入通常由远端树突接收，对细胞体的记录影响较小(51). 值得注意的是，在松斑实验中，WIN55212显示，当离子型谷氨酸和GABA时，GnRH神经元的放电频率有增加的趋势_A类-R介导的神经递质均被暂停。虽然这种影响没有达到统计学意义(P（P）=0.07），这一趋势表明，其他大麻素敏感性机制也有助于调节GnRH神经元网络。本实验中GnRH-神经元活性的增加可能是由于突触前释放GABA减少，这可能会使突触后GABA撤回_B类受体介导的GnRH神经元抑制(23). 或者，WIN55212可以减少直接作用于GnRH神经元的未知抑制性神经递质/神经调节剂的释放，或影响作用于Gn RH神经元上的多突触通路。

抑制GABA能传入GnRH神经元的逆行内源性大麻素信号传导的现有证据并不排除大麻素配体也通过其他机制和作用位点影响GnRH-释放的可能性。已经证明，anandamide可以减少含有GnRH神经分泌终末的下丘脑内侧移植物的GnRH-分泌(52). 这一发现，以及之前在小鼠正中隆起不明神经分泌轴突终末上观察到的CB1免疫反应(53)和青蛙的GnRH轴突末端(54)，提出大麻素也直接影响GnRH神经分泌终端释放GnRH。体外GT1-7神经元既是大麻素的来源，又是靶细胞。它们合成、运输和降解大麻素，并拥有大麻素受体，其激活抑制GnRH的脉动分泌(55). 因为小鼠GnRH神经元在双标记中不包含可检测的CB1 mRNA水平就地杂交实验(55)，这些数据与小鼠下丘脑的生理相关性需要澄清。

逆行内源性大麻素信号可能被神经内分泌下丘脑中的其他神经系统广泛使用。我们先前的免疫细胞化学实验显示，CB1-IR纤维对POA和下丘脑有密集的神经支配(53,56)并在弓状核、视上核和室旁核显示CB1-IR突触终末(53,56). 其他人的功能观察表明，内源性大麻素信号调节GABA能和/或谷氨酸能突触传递到弓状核的前阿片黑皮素神经元(42,57)和细小细胞(58,59)和大细胞神经元(60)室旁核。进一步的证据表明内源性大麻素信号强烈参与了ghrelin的机制(59)和糖皮质激素(61)调节室旁核小细胞神经元的谷氨酸能突触输入。

内源性大麻素的张力产生和逆行作用对GnRH神经元来说并不是唯一的现象。因此，在下丘脑阿片黑皮素原中，CB1抑制后mPSC的频率增加(42,57)和催产素神经元(62,63)海马锥体细胞(64). 在海马体中，CA3锥体细胞强直释放内源性大麻素导致突触前大麻素受体持续激活，并在皮层网络中提供状态依赖性开关(64). 内源性大麻素对GnRH细胞GABA能输入的类似沉默可能是代谢、昼夜节律、压力、情绪和类固醇信号传递到GnRH网络的重要门控机制的基础。GnRH神经元产生内源性大麻素的驱动力，以及GnRH细胞受调控的大麻素敏感GABA能传入的功能特征尚待确定。雌激素可能是内源性大麻素合成的一个重要调节剂，因为在去卵巢和雌激素替代的女性下丘脑中检测到较高水平的内源性大麻素与。去势和车辆处理的雌性或完整雄性大鼠(52). 在我们的斑贴试验中，在TTX存在的情况下检测到补剂2-AG的释放，这表明这种现象至少部分地与活性无关。其潜在机制可能与GnRH神经元中目前未知的组成型活性受体的功能有关。例如，代谢型谷氨酸受体（mGluRs）可以在海马体中显示这种构成活性(65)mGluR的激活确实可以导致海马、小脑和皮质纹状体神经元中2-AG的合成增加（综述见参考文献。11). mGluRs也存在于GnRH神经元中(66). mGluR和/或其他组成活性受体参与GnRH细胞分泌的强直性内源性大麻素需要澄清。

我们在本研究中提供了证据，表明逆行内源性大麻素信号传导是GnRH神经元在生理和病理条件下减少兴奋性GABA能输入的重要调节机制。

致谢

我们感谢R.A.Benoit博士捐赠LR1 GnRH抗体，感谢Norbert Haöjos博士和Jaönos Szabadics博士的宝贵意见，感谢Hajni Bekoö和Barna Laöszloö提供技术援助。

这项工作得到了匈牙利国家科学基金会（Orsza⁄gos Tudoma⁄nyos Kutata⁄si Alapprogramok K69127和T73002）和匈牙利健康研究委员会基金会（Ege⁄szse⁄guñgyi Tudomaкnyos-Tanaкcs 122/2009）的支持。根据245009号赠款协议，导致这些结果的研究得到了欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）的资助。

披露摘要：作者无需披露任何信息。

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