来自癌相关成纤维细胞的外显子miR-196a通过靶向CDKN1B和ING5使头颈癌对顺铂产生耐药性

摘要

背景

顺铂耐药是晚期头颈癌（HNC）面临的主要挑战。临床上迫切需要了解顺铂耐药的潜在机制并制定有效的策略。然而，肿瘤基质如何调节HNC生长和化疗耐药尚不清楚。

结果

我们表明，癌相关成纤维细胞（CAFs）对顺铂具有固有的耐药性，并通过外体将功能性miR-196a从CAFs传递到肿瘤细胞，从而在调节HNC细胞存活和增殖方面发挥积极作用。然后，外泌体miR-196a结合新的靶点CDKN1B和ING5，赋予HNC细胞顺铂耐药性。CAF的外体或外体miR-196a缺失在功能上恢复了HNC顺铂敏感性。重要的是，我们发现miR-196a包装到CAF衍生外显子中可能由异质核核糖核蛋白A1（hnRNPA1）介导。此外，我们还发现高水平的血浆外体miR-196a在临床上与整体生存率低和化疗耐药相关。

结论

本研究发现，CAF衍生的外体miR-196a通过靶向CDKN1B和ING5使HNC对顺铂产生耐药性，表明miR-196 a可能是HNC顺铂耐药性的一个有希望的预测因子和潜在的治疗靶点。

背景

头颈癌（HNC）是一种常见的侵袭性恶性肿瘤，与主要的发病率和死亡率相关，仍然是全球主要的健康负担[1]. 鳞状细胞癌占全世界确诊的大多数HNC病例，总的5年生存率约为50%[2]. 恶性增殖和化疗耐药仍然是HNC治疗的限制因素，导致复发和不良结果[2,三,4]. 尽管治疗取得了进步，但在过去40年里，总体预后仍然很差[2]. 因此，更好地了解HNC的生物学机制对于改善这些糟糕的结果是必要的。

目前HNC的治疗方案包括手术、放疗、化疗和最近的抗EGFR-抗体治疗[5]. 对于化疗，顺铂仍然是晚期HNC患者的核心药物。然而，患者对以顺铂为基础的化疗总是有良好的初始反应，但随后会复发，因为顺铂耐药性，无论是获得性还是固有性，都会发展，从而显著降低临床疗效[三]. 因此，迫切需要阐明顺铂耐药性的潜在机制，并发现预测HNC患者顺铂反应的可靠生物标志物。进一步的研究表明，化疗耐药的部分原因是耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的细胞自主功能[6]. 然而，肿瘤微环境在决定治疗反应方面的重要性日益明显[7].

在过去的十年中，肿瘤微环境在肿瘤进展和化疗耐药中的作用受到了广泛关注[8]. 在我们之前的研究中，肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤基质的主要成分，已被证明在促进HNC进展中起着关键作用[9,10]. 越来越多的证据表明，CAF通过分泌生长因子、重塑细胞外基质和增强治疗抵抗来促进HNC进展[8,11]. 有趣的是，最近的研究表明，CAF释放的外泌体可增加多种癌症的肿瘤细胞化疗耐药性[12,13,14,15,16].

外显体（30–150 nm）是起源于多泡体（MVB）的微泡，可以通过传递细胞内物质参与细胞间通讯，包括蛋白质、信使RNA（mRNAs）、微RNA（miRNAs[17,18]. 外泌体介导的miRNA递送被广泛认为有助于许多癌症的耐药性发展[19]. 除了肿瘤细胞分泌的外体miRNA外，CAF衍生的外体介导的miRNA传递也在化疗耐药中起重要作用。Richards等人发现，在吉西他滨治疗期间，CAF-衍生的外体miR-146a可促进胰腺癌细胞的存活和增殖[15]. 据报道，在卵巢癌中，miR-21通过外泌体从CAFs转移到癌细胞，通过靶向APAF1抑制癌细胞凋亡并赋予紫杉醇耐药性[14]. 另一项研究表明，CAF分泌的外体miR-21被证明可以加速结直肠癌对奥沙利铂的耐药性[20]. 然而，CAF对顺铂治疗的反应以及CAF衍生的外泌体如何导致HNC的顺铂耐药性仍不清楚。此外，这些外体miRNAs在调节受体HNC细胞顺铂耐药性中的功能作用尚未阐明。

我们以前的研究表明，CAF可能在调节HNC细胞顺铂耐药性中发挥关键作用[9,10]. 在本研究中，我们旨在研究CAF衍生的外泌体对受体HNC细胞增殖和存活的影响。进一步的实验，包括miRNA阵列，用于识别从正常成纤维细胞（NF）和CAF分离的外显子中的差异miRNA特征。此外，我们证明miR-196a通过外体直接从CAF转移到HNC细胞，并且我们还确定了外体miR-196 a调节HNC细胞顺铂耐药性的分子机制。

结果

HNC衍生的CAF具有天生的抗化学性

首先，比较从HNC组织中获得的CAF与HNC细胞的天然顺铂耐药性。CAF具有纺锤形形态，在培养中粘附，与NF相比，表达更高水平的特异性成纤维细胞标记物α-SMA、FAP和FSP1（附加文件1：图S1a；图1a、 b）[21]. 如图所示1c、 CAF的存活率高于同样顺铂剂量的顺铂耐药HN4-res和顺铂敏感HNC细胞（CAL 27、SCC-25和HN4）。在确定CAF对顺铂具有耐药性后，我们接下来评估了是否暴露于顺铂的CAF的存活率增加可能是由于CAF衰老而非合并药物所致。然后分析顺铂处理的CAF和HNC细胞的增殖情况。因此，在顺铂治疗期间，最耐化学药物的CAF细胞系CAF1保留了最多的增殖，而第三大抗顺铂CAF细胞株CAF3的增殖显著降低（图1d） ●●●●。除了增殖外，我们还试图研究其他机制是否也有助于CAF对顺铂的耐药性。我们比较了具有相似增殖率的CAF3和HN4-res细胞的存活率。值得注意的是，顺铂治疗后CAF3细胞的存活率高于HN4-res细胞（图1e） ●●●●。此外，CAF中的顺铂IC50远高于NF、原发癌细胞和HNC细胞系（附加文件1：图S1b，c）。据报道，导致顺铂耐药性的机制包括顺铂摄取减少（例如CTR1）、药物流出增加（例如MRP2、ATP7A和ATP7B）、解毒增加（例如GSH和GST）、DNA修复改变（例如ERCC1、ERCC4、MLH1、MSH2和BRCA1/2），抗凋亡蛋白（例如Bcl-2和XIAP）的改变[22]. 因此，CTR1、MRP2、ATP7B、GST、ERCC1、ERCC4、Bcl-2和XIAP是细胞内耐药的关键调节因子[6,22]，进行进一步分析。如图所示1与NF或HNC细胞相比，CAF中CTR1（一种与顺铂耐药相关的质膜铜转运体）的蛋白表达f和g较低。此外，CAF中XIAP、ERCC1、ERCC4、GSTK1和Bcl-2的蛋白水平高于NF或HNC细胞。当在CAF、NF和HNC细胞中检测到这些基因的mRNA表达水平时，也得到了类似的结果（附加文件1：图S1d）。据报道，ERCC1-ERCC4是一种核苷酸切除修复相关因子，与HNC患者的生存率和/或对顺铂治疗方案的反应性呈负相关[22,23]. 进一步分析表明，通过特异性siRNA沉默ERCC1或ERCC4可显著降低CAF的顺铂耐药性，而ERCC1和ERCC4的敲除则表现出更明显的效果（附加文件1：图S1e–g）。综上所述，这些数据表明CAF天生对顺铂具有耐药性。

图1

来源于HNC的CAF天生对顺铂耐药。一免疫荧光染色检测NFs和CAF的α-SMA、FAP和FSP1表达（标尺，20μm）。b条六对NF和CAF中α-SMA、FAP和FSP1蛋白水平的Western blot分析。c（c）将NFs、CAF和HNC细胞用或不用10μM顺铂处理8天，测量细胞存活率以获得细胞存活率百分比，并将其归一化为对照细胞。d日将NFs、CAF和HNC细胞用或不用10μM顺铂处理24 h，检测细胞活力以计算顺铂处理期间增殖细胞的百分比。e（电子）10μM顺铂治疗8天后，存活CAFs（CAF3）和顺铂耐药HN4-res细胞的百分比，其增殖保持率相似。（f）,克NFs、CAF、CAL 27、SCC-25、HN4和HN4-res细胞中MRP2、ATP7B、CTR1、XIAP、ERCC1、ERCC4、GSTK1和Bcl-2蛋白水平的Western blot分析。评估带强度。（ns，无显著差异*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001; ****第页 < 0.0001)

CAF衍生的外泌体增加HNC细胞增殖和存活

考虑到CAF的固有化疗耐药性，我们接下来评估CAF分泌的功能因子是否影响HNC细胞的增殖和存活。首先，我们测定了CAF条件培养基（CM）对顺铂敏感性HNC细胞增殖和存活的影响。结果表明，与NF-CM和肿瘤细胞-CM相比，CAF-CM显著促进CAL27和HN4细胞增殖（图2a；其他文件1：图S2a）。然而，来自HN4-res细胞的CM并未引起CAL 27和HN4细胞增殖的显著增加（附加文件1：图S2b），表明该效应是CAF特有的。同时，我们观察到，与生长在肿瘤细胞-CM、NF-CM或HN4-res-CM中的HNC细胞相比，生长在CAF-CM中并随后用顺铂治疗的HNC电池的细胞存活率显著增加（图2b；其他文件1：图S2a，b）。这些结果表明，含有几乎所有分泌因子的CAF-CM可以影响HNC细胞的增殖和顺铂耐药性。

图2

CAF衍生的外泌体增加HNC细胞增殖和顺铂耐药性。一将CAL 27和HN4细胞在CAF-CM或对照CM中生长6天，并检测细胞活力。b条CAL 27和HN4细胞在CAF-CM或对照CM中培养6天，然后进行MTT分析以检测这些细胞的顺铂反应。c（c）将CAL 27和HN4细胞在对照CM、CAF-CM或胞外体缺失的CAF-CM中培养6天，并检测细胞活力。MTT分析用于评估这些细胞对顺铂的耐受性。d日HNC细胞与DMSO处理的HNC细胞、DMSO治疗的CAF或GW4869处理的CAF共培养6天，然后评估HNC细胞的生存能力。MTT法检测顺铂处理后共培养HNC细胞的存活率。e（电子）来自CAFs或顺铂处理的CAFs（10μM）的外泌体的大小分布和数量的NanoSight粒子跟踪分析。（f）使用或不使用顺铂治疗（10μM）的NF、CAF或HNC细胞外显子数量的NanoSight颗粒追踪分析。克NFs、CAF或HNC细胞CM中的外体蛋白浓度（10μM），无论是否接受顺铂治疗。小时将CAL 27和HN4细胞与来自CAF的DiO-标记的外泌体（25μg/mL）孵育24 h，并通过共焦显微镜（标尺，20μm）检测绿色外泌物信号。我与来自CAF的DiO-标记的外泌体（25μg/mL）孵育指定时间后，流式细胞术分析DiO-阳性CAL 27或HN4细胞。j个用来自HNC细胞、CAF或顺铂处理的（10μM）CAF的外泌体（25μg/mL）处理HNC细胞6天。测定细胞活力，并进行MTT分析以评估这些细胞的顺铂反应。k个用来自HNC细胞、顺铂处理的（10μM）HN4-res细胞或顺铂处理（10μM）CAF的外泌体（25μg/mL）处理HNC细胞6天。MTT法测定这些细胞的存活率和存活率。（NT，无顺铂治疗；CT，顺铂治疗，ns，无显著差异*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001; ****第页 < 0.0001)

外泌体是由几乎所有类型的细胞分泌的纳米膜小泡，在细胞间通讯中起着重要作用。由于CAF-CM调节HNC细胞生长和顺铂耐药性，我们试图研究CAF-衍生的外泌体是否有助于这种作用。幸运的是，我们发现通过超速离心或通过GW4869（附加文件1：图S3）显著降低了CAF-CM增加CAL 27和HN4细胞增殖和顺铂抵抗的能力（图2c、 d）。然后，我们通过超速离心从CAF-CM中纯化了外显体，并通过阳性外显体标记物（Alix、HSP90、HSP70、CD63、CD9和Rab5）和阴性标记物GRP94确认了它们的身份[24,25]（附加文件1：图S4a）。CAF衍生的外泌体直径约为100 nm，呈现典型的杯状形态，这已通过粒度分析和透射电子显微镜证实（附加文件1：图S4b，c）。有趣的是，我们发现与NFs和HNC细胞相比，CAF在顺铂治疗后表现出最大的外体释放增加（图2e–g）。进一步分析显示，顺铂治疗后CAF中CD63、nSMase2、RAB35、RAB5A、RAB9A、RAB27A和RAB7的mRNA表达水平增加（附加文件1：图S5），表明顺铂可能通过上调CD63和nSMase2的表达促进外泌体的生物生成，并通过增加CAF中RAB35、RAB5A、RAB9A、RAB27A和RAB7的表达加快外泌物的转运和释放[26].

为了确定CAF-衍生的外泌体是否被HNC细胞内吞，从CAF-CM中纯化外泌物，用3,3′-二十八烷氧基碳菁高氯酸盐（DiO）标记，并与HNC细胞孵育24小时2h、 i）。在功能上，与NFs的外泌体相比，经CAF或顺铂处理的CAF衍生外泌体能显著促进HNC细胞的增殖和化疗耐药性（图2j；其他文件1：图S2c），而来自化学抗性HN4-res细胞的外泌体引发了较温和的作用（图2k；其他文件1：图S2d）。总的来说，这些数据表明CAF或顺铂处理的CAF释放的外泌体加快了受体HNC细胞的生长和存活。

从CAF到HNC细胞的miR-196a外显子转移

为了研究CAF-衍生外泌体促进受体HNC细胞增殖和顺铂抵抗能力的功能分子，通过miRNA阵列分析NF-和CAF-派生外泌物的miRNA表达水平。我们观察到CAF衍生的外泌体，尤其是顺铂处理的CAF衍生外泌物，显示miR-196a-5p（也称为miR-196a）表达显著增加（附加文件2：表S1；其他文件1：图S6a，b）。机制分析表明，p38和ERK MAPK信号通路通过刺激c-Myc与miR-196a启动子的结合，参与了顺铂刺激的CAF中miR-196 a表达的调节（附加文件1：图S7a–h）。此外，与顺铂处理的CAF的外显子培养后，HNC细胞中miR-196a表达显著增加（附加文件1：图S6c，d）。此外，与邻近正常组织相比，HNC组织中miR-196a水平上调（附加文件1：图S6e，f），与HNC细胞和NF相比，CAF表达的内源性miR-196a水平显著升高（图三a；其他文件1：图S6g）。这些结果表明，肿瘤微环境中的CAF可能通过直接miR-196a转移增加HNC细胞中miR-196 a的表达水平。

图3

miR-196a从CAF到HNC细胞的外体转移。一使用实时PCR分析miR-196a在NFs、CAF、正常口腔上皮细胞（称为正常）、原发癌细胞和HNC细胞系中的表达。b条将CAL 27和HN4细胞与对照CM、CAF-CM或外显体缺失的CAF-CM孵育24小时。使用实时PCR测定这些细胞中miR-196a的表达水平。c（c）CAL 27和HN4细胞与DMSO处理的HNC细胞、DMSO治疗的CAF或GW4869处理的CAF共培养24小时。然后使用实时PCR检测HNC细胞中miR-196a的表达水平。d日瞬时转染Cy3-标记miR-196a（Cy3-miR-196 a）的CAF与CAL 27或HN4细胞共培养48 h。使用荧光显微镜检测HNC细胞（标尺，20μm）中的红色荧光信号。e（电子）实时PCR分析RNase A（2 mg/mL）单独或与Triton X-100（0.1%）联合治疗20分钟后CAF-CM中miR-196a的表达。（f）实时PCR分析miR-196a在外显体、外显体缺失CM和来自CAF的整个CM中的表达。克与来自HNC细胞（Ctrl-Exos）、CAF或转染或不转染miR-196a模拟物的CAF的外泌体（25μg/mL）孵育24小时后，通过实时PCR检测CAL 27和HN4细胞中miR-196 a的表达。小时在与来自HNC细胞（Ctrl-Exos）、CAFs和用或不用抗miR-196a转染的CAFs的外泌体（25μg/mL）孵育24小时后，通过实时PCR检测CAL 27和HN4细胞中miR-196a的表达。我,j个用指示的外泌体（25μg/mL）处理CAL 27和HN4细胞6天，并用MTT分析测定这些细胞中的顺铂反应。（ns，无显著差异*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001; ****第页 < 0.0001)

为了确定miR-196a是否通过外泌体从CAFs直接转移到肿瘤细胞，HNC细胞分别与CAF-CM和外泌体缺失的CAF-CM孵育。我们观察到在CAF-CM中生长的HNC细胞表达较高水平的miR-196a；然而，当CAF-CM的外泌体被物理或药物耗尽时，HNC细胞中miR-196a的表达显著降低（图三b、 c）。此外，瞬时转染Cy3标记miR-196a的CAF与HNC细胞共培养48小时。通过共焦显微镜在癌细胞中观察到荧光标记的miR-196 a（图三d） 表明miR-196a通过外显体从CAF转移到HNC细胞。此外，在RNase A治疗后，CAF-CM中miR-196a的水平没有变化，但当RNase A+Triton X-100同时治疗时，miR-196的水平显著降低（图三e） ，表明细胞外miR-196a主要被包裹在膜内，而不是直接释放。有趣的是，miR-196a在外泌体和整个CAF-CM中的水平几乎相等（图三f） ●●●●。此外，与miR-196a过表达的CAF外显子孵育后，细胞内miR-196 a水平显著增加，而与miR-96a敲除的CAF孵育时，细胞内的miR-196a水平没有显著增加（附加文件1：图S8a，b；图三g、 h）。在功能上，当与来自CAF的外显子培养时，HNC细胞对顺铂不敏感，尤其是miR-196a过度表达的CAF，而CAF中miR-196 a的敲除消除了这种作用（图三i、 j）。这些发现表明，功能性miR-196a可以通过外泌体从CAF转移到HNC细胞。

miR-196a包装到外泌体中由hnRNPA1介导

为了研究miR-196a是否被特异性包装成外显体，我们利用RBP特异性数据库（RBPDB，http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/; 阈值0.7）[27]结果表明，锌指ran-binding domain-containing protein 2（ZRANB2）、异质核核糖核蛋白A1（hnRNPA1）和ELAV-like protein 1（ELAVL1）基序具有特异的miR-196a结合位点（图4a） ●●●●。进一步研究表明，在CAF中使用特定siRNAs敲除hnRNPA1显著降低了外体miR-196a水平，而细胞miR-196水平几乎没有变化（图4b–d），表明hnRNPA1在外体miR-196a水平中起调节作用。此外，miRNA下拉分析表明，在细胞质和外显体中观察到hnRNPA1和miR-196a之间的相互作用，但在细胞核中没有观察到。然而，当miR-196a的UAGGUA序列突变时，hnRNPA1结合能力受损（图4e） ●●●●。此外，随后进行细胞内RNA免疫沉淀（RIP）分析和CAF的胞外体裂解物，我们发现与IgG组相比，hnRNPA1抗体组中miR-196a富集（图4f） ●●●●。同时，与对照组裂解物相比，来自顺铂处理的CAF的细胞和胞外体裂解物显示出显著的miR-196a富集（图4g） ●●●●。共焦分析显示，当CAF预先转染hnRNPA1特异性siRNAs时，miR-196a通过外显体从CAF向HNC细胞的转移减少（图4h） ●●●●。此外，在顺铂治疗后，CAF中hnRNPA1的mRNA和蛋白表达水平基本保持不变，而在顺铂刺激的CAF的外体中观察到hnRNPAl蛋白水平增加（附加文件1：图S7i）。因为顺铂可以促进CAFs中miR-196a的表达（附加文件1：图S7a–h），我们推测顺铂通过上调细胞miR-196a的表达和hnRNPA1从细胞到外泌体的易位，从而介导miR-196 a向外泌体内的更大包装，从而加速了CAF产生外体miR-196a。

图4

hnRNPA1蛋白介导miR-196a包装到CAF衍生的外泌体。一通过RBPDB分析预测miR-196a序列和RBP基序之间的特定相互作用（阈值0.7）。b条Western blot和实时PCR结果显示，转染特定siRNA后48小时，CAF中ZRANB2、hnRNPA1和ELAVL1的表达水平。c（c）使用实时PCR检测转染靶向ZRANB2、hnRNPA1或ELAVL1的特异性siRNA的CAF外显子中miR-196a的表达。d日实时PCR分析显示miR-196a在hnRNPA1沉默的CAF中表达。e（电子）通过用细胞核、细胞质或外泌体CAFs裂解物和指示的生物素化miR-196a或突变miR-196a进行的miRNA下拉得到的样品中hnRNPA1表达的蛋白质印迹分析；生物素化聚（G）用作阴性对照。（f）用抗hnRNPA1抗体（或IgG作为对照）对CAF的细胞或外体裂解物进行RIP分析。免疫沉淀样品中的miR-196a水平通过实时PCR测定，并以输入样品的百分比（%输入）报告。克RIP分析以确定miR-196a上hnRNPA1相对于经或不经顺铂处理的CAF细胞质或外体裂解物中IgG的富集。小时CAL 27和HN4细胞与同时转染Cy3-miR-196a和靶向hnRNPA1的特异性siRNAs的CAF共培养48小时。使用荧光显微镜检测HNC细胞中的红色荧光信号（比例尺，10μm）。我用CAL 27细胞加上用hnRNPA1、sh-NC或sh-hnRNPA1转染的CAFs的混合物对裸鼠进行皮下异种移植，并显示肿瘤生长曲线和肿瘤体积。j个利用FISH分析检测miR-196a在异种移植瘤中的分布，并评估miR-196 a在肿瘤细胞中的表达。k个108对HNC样本和邻近正常组织中hnRNPA1 mRNA表达水平。我对HNC组织中miR-196a的表达与hnRNPA1的表达进行相关性分析(n个 = 108）（NT，无顺铂治疗；CT，顺铂治疗*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001; ****第页 < 0.0001)

我们随后确定了CAF-衍生hnRNPA1在体内肿瘤生长中的有效作用。异种移植试验的结果表明，CAL 27加CAF-hnRNPA1细胞形成的肿瘤比对照组的肿瘤生长更快，并且抑制CAF中hnRNPAl的表达显著降低了肿瘤生长（附加文件1：图S9a，b；图4i） ●●●●。此外，荧光原位杂交（FISH）分析显示，当hnRNPA1在邻近CAF中表达上调时，肿瘤细胞中miR-196a的表达更高，而抑制hnRNPAl在CAF中的表达导致肿瘤细胞中的miR-196信号降低（图4j；其他文件1：图S9c，d）。此外，我们还发现，与邻近正常组织相比，HNC组织中hnRNPA1的表达上调，HNC中hnRNPA1的表达与miR-196a的表达呈正相关（图4k、 l）。进一步分析表明，hnRNPA1在HNC中的上调与肿瘤增大、淋巴结转移、肿瘤晚期和化疗耐药密切相关（附加文件1：图S10）。

上述数据表明，hnRNPA1可能通过结合miR-196a的5′末端存在的特定基序（UAGGUA），在将miR-196 a包装成外泌体中发挥重要作用，这表明miR-196a是特异性分类为CAF衍生外泌物。重要的是，hnRNPA1介导的miR-196a分选机制可能在HNC进展和化疗耐药中发挥积极作用。

miR-196a促进HNC细胞增殖和顺铂耐药

在确定癌细胞可以摄取CAF-衍生的外体miR-196a后，我们接下来试图研究miR-196 a是否有助于HNC细胞的化疗耐药性。因此，miR-196a过度表达（附加文件1：图S8a）显著增加CAL 27和HN4细胞的生长速度（图5a；其他文件1：图S11a），并且在miR-196转染的CAL 27和HN4细胞中观察到比对照细胞更高百分比的EdU阳性细胞（图5b；其他文件1：图S11b）。同时，MTT和集落形成分析表明，miR-196a过度表达显著提高了CAL 27和HN4细胞的顺铂耐药性（图5c、 d；其他文件1：图S11c，d）。相反，在HNC细胞中miR-196a敲除（附加文件1：图S8b）显著降低肿瘤细胞增殖和化疗耐药（图5a–d；其他文件1：图S11a–d）。由于miR-196a显著影响CAL 27和HN4细胞增殖和顺铂抵抗，我们推测miR-196 a可能通过影响HNC细胞的细胞周期或细胞凋亡发挥作用。流式细胞术分析显示，与对照细胞相比，异位miR-196a表达显著降低了CAL 27和HN4细胞G1峰的细胞百分比，并增加了S峰的细胞比例。正如预期的那样，miR-196a敲除显著增加了G1峰中的细胞数量，减少了S峰中的那些细胞数量（图5e；其他文件1：图S11e）。类似地，miR-196a过表达抑制了CAL 27和HN4细胞的基础凋亡率和顺铂诱导的凋亡，而miR-196a敲低显著增加了HNC细胞的基础凋亡和顺铂诱导的凋亡（图5f、 克；其他文件1：图S11f、g和S12）。因此，我们得出结论，miR-196a可以通过促进G1/S细胞周期转变和抑制细胞凋亡来增强HNC细胞的增殖和顺铂抵抗。

图5

miR-196a通过促进G1/S转变和抗凋亡来调节HNC细胞的增殖和存活。一转染miR-196a或抗-miR-196a后48小时用CAL 27细胞进行细胞增殖分析。b条转染miR-196a或抗-miR-196a后48小时EdU-incoming细胞的代表性显微照片和定量。c（c）MTT法检测转染miR-196a或抗-miR-196a的CAL 27细胞48小时，然后以指定浓度顺铂治疗72小时。d日转染miR-196a或抗-miR-196a并经顺铂治疗（3μM）的CAL 27细胞的平板集落形成试验。e（电子）转染后48小时，用流式细胞仪分析转染miR-196a或抗-miR-196a的CAL 27细胞的细胞周期分布。（f）,克流式细胞术分析转染miR-196a或抗-miR-196a的CAL 27细胞转染48小时后顺铂诱导的（10μM）凋亡。(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001)

由于其他miRNAs（miR-10b-5p、miR-708-5p、miR-335-5p、miR-10a-5p和miR-218-5p）在顺铂处理的CAF的外泌体中上调（附加文件1：图S6a–d），我们试图确定这五种miRNAs是否也参与了顺铂耐药性或是否存在协同效应。我们观察到，转染miR-10b-5p或miR-10a-5p的HNC细胞的存活率明显提高，并且miR-196a在顺铂耐药中表现出更积极的作用。然而，因子分析表明miR-196a和miR-10b-5p或miR-196和miR-10 a-5p没有协同作用（附加文件1：图S13）。这些数据强调了miR-196a在这些miRNAs中对顺铂耐药的重要性。

CDKN1B和ING5是HNC外体miR-196a的直接靶点

为了确定miR-196a调控的靶基因，我们使用了一种常用的算法miRecords(http://c1.accurascience.com/miRecords/)，这是动物miRNA-靶相互作用的综合资源。为了提高预测的准确性，miRecords中11个数据库中至少有5个预测的基因被选为假定靶点。在这些假定的目标中，基因本体分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)揭示了12个候选基因，其表达的改变可能有助于增殖或化学抗性表型（图6a；其他文件三：表S2）。因此，我们选择这12个基因作为潜在的下游miR-196a靶基因。实时PCR分析显示，miR-196a过表达显著抑制CAL 27和HN4细胞中CDKN1B和ING5的表达，而抗miR-196 a则表现出相反的作用（图6b；其他文件1：图S14a，b）。正如预期的那样，CAF衍生的外体miR-196a显著抑制了CAL 27和HN4细胞中CDKN1B和ING5的表达（图6c；其他文件1：图S15a）。在HNC样本中，我们发现CDKN1B和miR-196a的表达呈负相关，而miR-196 a的过度表达也与ING5的下调有关（附加文件1：图S14c-e；图6d、 e）。上述数据表明CDKN1B和ING5是推测的直接miR-196a靶点。使用3′UTR荧光素酶报告子分析，我们发现miR-196a过度表达显著抑制了表达野生型CDKN1B和ING5 3′UTR报告子的293T或HNC细胞的荧光素酶活性，而抗miR-196 a特异性地消除了这种抑制。此外，CDKN1B和ING5 3′UTR的miR-196a结合种子区的突变消除了miR-196 a的抑制作用（图6f–h；其他文件1：图S16a，b）。CDKN1B和ING5 mRNA 3′UTR序列中miR-196a的这些假定结合位点在脊椎动物中进化上是保守的（附加文件1：图S17）。此外，CAF分泌的外体miR-196a也有效降低了表达野生型CDKN1B和ING5 3′UTR报告物的293T或HNC细胞的荧光素酶活性（图6i；其他文件1：图S15b；S16c）。为了测试miR-196a与其各自的靶转录物（CDKN1B和ING5）之间的关联，我们采用了一种最近描述的方法，从转染生物素化形式的miRNA模拟物的细胞中，使用链霉亲和素涂层珠捕获miRNA-mRNA复合物[28]. 有趣的是，CDKN1B和ING5的mRNA水平在从转染生物素标记miR-196a的HNC细胞分离的下拉材料中显著富集（图6j、 k）。如图所示6l、 异位miR-196a表达或用CAF衍生的外泌体治疗可降低CAL 27和HN4细胞中p27（由CDKN1B编码）和ING5蛋白的表达，而miR-196 a敲除可增加这些表达水平。进一步的实验表明，CAF衍生的外体miR-196a可以在功能上调节HNC细胞中p27和ING5蛋白的表达（附加文件1：图S15c）。这些数据表明CDKN1B和ING5是外体miR-196a的真正靶点。

图6

CDKN1B和ING5是HNC细胞外体miR-196a的直接靶点。一显示通过基因本体分析预测的miR-196a候选靶基因的图表。b条转染miR-196a或抗-miR-196a后48小时，CAL 27和HN4细胞中CDKN1B和ING5 mRNA的表达。c（c）与来自HNC细胞（Ctrl-Exos）和CAF的外泌体（25μg/mL）孵育48小时后，CAL 27和HN4细胞中的CDKN1B和ING5 mRNA水平。d日,e（电子）对HNC组织中miR-196a的表达与CDKN1B或ING5的表达进行相关性分析(n个 = 108).（f）预测CDKN1B和ING5基因3′UTR的miR-196a靶序列。克与miR-196a和荧光素酶报告子共同转染的293T细胞中相对CDKN1B或ING5报告子活性。小时抗miR-196a对293T细胞CDKN1B或ING5报告荧光素酶活性的影响。我CAF衍生的外泌体（25μg/mL）对293T细胞中CDKN1B或ING5报告荧光素酶活性的影响。j个显示miRNA靶点免疫沉淀程序的示意图。k个靶转录物与miR-196a的相互作用。用生物素化miR-NC或miR-196a转染CAL 27或HN4细胞48 h。通过实时PCR分析生物素-miR-196a打倒的材料中CDKN1B和ING5 mRNA的水平，并将其归一化为β-肌动蛋白。我用miR-196a或抗-miR-196a转染CAL 27和HN4细胞，或用CAF衍生的外泌体（25μg/mL）孵育48小时。通过western blot分析检测所示细胞中p27和ING5的表达。米转染miR-NC、miR-196a-plus对照载体、miR-96a-plus CDKN1B质粒或miR-196a+ING5质粒后48小时，对HNC细胞进行细胞周期和顺铂诱导的细胞凋亡分析。（ns，无显著差异*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001)

CDKN1B和ING5在miR-196a介导的顺铂耐药中表现出不同的功能

在确定CDKN1B和ING5为miR-196a的直接靶点后，我们分析了CDKN1和ING6在化疗耐药中的功能作用。特异性siRNAs沉默CDKN1B或ING5显著促进HNC细胞增殖和顺铂抵抗（附加文件1：图S18a–c），而CDKN1B或ING5过度表达显著降低了这些细胞的生长和顺铂耐药性（附加文件1：图S18d–f）。有趣的是，我们观察到CDKN1B失调主要与G1/S细胞周期转变有关，而ING5基因主要调节顺铂诱导的细胞凋亡（附加文件1：图S18g–j）。此外，miR-196a介导的G1/S细胞周期转换可通过异位CDKN1B表达而非ING5表达来挽救。同样，受抑制的miR-196a介导的凋亡可以通过外源性ING5表达而不是CDKN1B表达来挽救（图6m） ●●●●。此外，CAF-衍生的外体miR-196a可以通过下调p27或ING5蛋白表达来调节细胞周期和顺铂诱导的HNC细胞凋亡（附加文件1：图S15c，d）。因此，这些结果表明CDKN1B和ING5在miR-196a介导的HNC细胞顺铂耐药中发挥不同的作用。

外体miR-196a通过CDKN1B和ING5下调促进HNC细胞对顺铂的耐药性

为了进一步阐明CDKN1B基因在miR-196a介导的细胞周期转换中的功能作用，用靶向CDKN1 B的特异性siRNA瞬时转染CAL 27和HN4细胞，然后进行蛋白质印迹分析。结果，转染HNC细胞中p27蛋白水平降低，CDK2、CDK4、Cyclin D1和Cyclin-E1水平升高（图7a） ●●●●。此外，我们还通过将ING5靶向siRNA转染到HNC细胞，分析了ING5基因在细胞凋亡中的有效作用。如图所示7b、 转染HNC细胞中ING5、Bax、Cleaved Caspase 3和Cleaved-PARP蛋白水平显著降低，Bcl-2水平显著上调。用CAF衍生的外泌体处理CAL 27和HN4细胞时也获得了类似的结果（附加文件1：图S19a，b）。同时，siRNA敲低p27或ING5蛋白显著赋予亲代细胞顺铂抗性（图7c） ●●●●。此外，同时转染miR-196a和质粒，以表达缺乏内源性3′UTR的互补DNA（CMV-CDKN1B和CMV-ING5），显著降低了miR-196a-介导的顺铂耐药促进作用（图7d） ●●●●。当用不含3′UTR的CDKN1B或ING5表达质粒转染HNC细胞，然后用CAF衍生的外泌体处理时，也获得了类似的结果（附加文件1：图S19c）。相反，在HNC细胞中同时敲除CDKN1B和ING5可消除抗miR-196a诱导的化疗耐药抑制，而仅敲除每种蛋白的效果有限（图7e） ●●●●。为了进一步阐明miR-196a通过CDKN1B阻遏诱导顺铂耐药的功能，将CMV-CDKN1 B和CMV-CDK1B 3′UTR转染到miR-196a-过表达细胞中。正如预期的那样，western blotting显示，在miR-196a转染后CDKN1B显著下调，但在CMV-CDKN1 B转染后被挽救，而不是CMV-CDN1B 3′UTR转染后。在功能上，miR-196a对顺铂耐药的促进作用被异位CMV-CDKN1B表达所抵消，但没有受到CMV-CDK1B 3′UTR转染的实质性影响（图7f） ●●●●。此外，在研究miR-196a通过ING5阻遏诱导顺铂耐药的功能时，也观察到类似的现象（图7g） ●●●●。总之，这些结果表明，外体miR-196a通过CDKN1B和ING5下调促进了HNC细胞对顺铂的耐药性。

图7

miR-196a通过CDKN1B和ING5下调加速HNC细胞对顺铂的耐药性。一Western印迹显示用CDKN1B特异性siRNA转染后48小时，CAL 27和HN4细胞中p27、p21、CDK2、CDK4、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E1蛋白水平。b条Western blot显示转染ING5特异siRNA后48 h CAL 27和HN4细胞中的ING5、Bcl-2、Bax、全长Caspase 3、裂解Caspase 2、全长PARP和裂解PARP蛋白水平。c（c）左：western blot显示转染CDKN1B或ING5特异性siRNA后48小时CAL 27和HN4细胞中p27和ING5蛋白水平。右图：MTT分析显示转染后48小时CAL 27和HN4细胞的顺铂反应，如图所示。d日左：western blot显示同时转染miR-196a和外源表达载体（CDKN1B或ING5）后48小时CAL 27和HN4细胞中的p27和ING5蛋白水平。右图：转染后48小时CAL 27和HN4细胞中的顺铂反应，如图所示。e（电子）左：western blot显示转染抗miR-196a和CDKN1B或ING5特异性siRNA后48小时CAL 27和HN4细胞中的p27和ING5蛋白水平。右图：转染后48小时CAL 27和HN4细胞的顺铂反应，如图所示。（f）左：western blot显示miR-196a和外源性表达载体（CDKN1B或CDKN1 B 3′UTR）转染后48小时CAL 27和HN4细胞中的p27蛋白水平。右图：如图所示，转染后48小时CAL 27和HN4细胞对顺铂的耐药性。克左：western blot显示转染miR-196a和外源表达载体（ING5或ING5 3′UTR）后48小时CAL 27和HN4细胞中的ING5蛋白水平。右图：如图所示，转染后48小时CAL 27和HN4细胞对顺铂的耐药性。（ns，无显著差异*第页 < 0.05**第页 < 0.01; ***第页 < 0.001)

CAF衍生的外体miR-196a在体内促进HNC细胞顺铂耐药

为了确定CAF衍生的外体miR-196a是否影响体内HNC细胞的致瘤性和顺铂耐药性，我们通过皮下注射转染或不转染miR-196 a的CAL 27细胞以及CAF和CAL 27的混合物到裸鼠臀部建立了异种移植模型。注射12天后，所有小鼠每隔4天接受5次腹腔注射4 mg/kg顺铂。经顺铂治疗后，CAL 27加CAF形成的肿瘤比CAL 27组的肿瘤生长更快，GW4869显著降低了CAL 27细胞中CAF介导的顺铂耐药性（图8a；其他文件1：图S20a）。这些结果表明，CAF衍生的外泌体参与了CAF介导的HNC顺铂耐药。此外，miR-196a-过度表达的CAL 27细胞比CAL 27更能耐受顺铂治疗（图8b；其他文件1：图S20b），表明miR-196a可以赋予CAL 27细胞体内的顺铂耐药性。此外，CAF中miR-196a的过度表达促进了CAF介导的CAL 27细胞对顺铂的耐药性，而CAF中micR-196a表达的下调逆转了这种效应（图8b；其他文件1：图S20b）。上述数据表明，CAF衍生的外体miR-196a在HNC中赋予顺铂耐药性。有趣的是，CDKN1B和ING5的表达与异种移植组织中miR-196a的表达呈负相关。实时PCR、western blotting和免疫组织化学染色检测到，在CAL 27-miR-196a和CAL 27+CAFs组中miR-196a表达显著上调，而在CAL 27+CAFs+GW4869和CAL 27+CAF-anti-miR-196组中部分下调。然而，CDKN1B和ING5 mRNA和蛋白质水平与miR-196a的趋势相反（附加文件1：图S21）。在功能上，miR-196a的过度表达和与CAF的孵育均增加了异种移植瘤顺铂治疗后Ki-67阳性细胞的比例，并减少了凋亡细胞的数量，而CAF衍生的外体或外体miR-196 a的缺失则逆转了这些影响（附加文件1：图S21c，d）。这些数据表明，CAF分泌的外体miR-196a可通过下调体内CDKN1B和ING5水平，赋予HNC细胞顺铂耐药性。

图8

CAF衍生的外体miR-196a增强体内HNC细胞对顺铂的耐药性。一用CAL 27细胞（含或不含CAF）建立异种移植小鼠模型。给小鼠腹腔注射顺铂（4 mg/kg，每4天一次），并添加或不添加GW4869（2 mg/kg，每隔2天）。显示肿瘤生长曲线、肿瘤体积和肿瘤重量。b条CAL 27细胞稳定转染miR-196a或不转染miR 196a，CAF稳定转染micr-196a或抗miR-196 a。如图所示，用预转染的CAL 27细胞或CAFs对裸小鼠进行皮下异种移植。小鼠腹腔注射顺铂5次（4 mg/kg，每4天一次）。显示肿瘤生长曲线、肿瘤体积和肿瘤重量。c（c）上调的miR-196a水平与HNC组织中肿瘤大小增加、淋巴结转移和肿瘤晚期相关。d日实时PCR分析显示化疗敏感患者HNC组织中miR-196a的表达(n个 = 20） 和化疗耐药患者(n个 = 20).e（电子）Kaplan-Meier对总生存率的分析。与miR-196a低表达患者相比，miR-196高表达患者的总体生存率显著降低。（f）用实时PCR检测HNC患者和健康献血者血浆中的外周血miR-196a水平。克HNC患者手术前后匹配血浆中miR-196a外体的实时PCR分析(n个 = 40).小时化疗敏感患者血浆中miR-196a外体表达的实时PCR分析(n个 = 20） 和化疗耐药患者(n个 = 20).我根据治疗前血浆中的中位数外体miR-196a水平，对高和低miR-196 a组74例HNC患者的总体生存率进行Kaplan-Meier分析。j个血浆外体miR-196a表达ROC曲线分析鉴别耐药组(n个 = 20） 来自化疗敏感组(n个 = 20). AUC，曲线下面积。k个一个提出的模型说明了CAF衍生的外体miR-196a在调节HNC细胞增殖和顺铂耐药性中的调节作用。(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001; ****第页 < 0.0001)

肿瘤组织和血浆中miR-196a上调表明HNC患者发生恶性转化并与化疗耐药相关

除了顺铂耐药外，我们的数据还显示，CAF-衍生的外体miR-196a赋予HNC细胞对阿霉素和紫杉醇均不耐受（附加文件1：图S22），表明外体miR-196a在化疗耐药中起着重要作用。

为了研究miR-196a是否解释HNC的恶性转化和耐药，分析了miR-196 a的表达与HNC患者临床特征的相关性。如附加文件所示1：图S6e和f，与相邻正常组织相比，HNC组织中miR-196a水平上调。进一步分析表明，在HNC组织中miR-196a上调与肿瘤大小增加、淋巴结转移、肿瘤晚期和化疗耐药相关（图8c、 d；其他文件4：表S3）。此外，Kaplan-Meier和Cox回归分析表明，高miR-196a水平与80例HNC患者的总体生存率降低显著相关（图8e；其他文件4：表S4）。此外，HNC中的CDKN1B和ING5下调（附加文件1图S14c–e）与肿瘤增大、淋巴结转移、肿瘤晚期和化疗耐药密切相关，最终导致HNC患者预后不良（附加文件1：图S23、S24）。有趣的是，CDKN1B或ING5的表达与HNC中hnRNPA1的表达呈负相关（附加文件1：图S10e，f）。

由于在CAF-CM中检测到外体miR-196a（图三e） 然后，我们探索HNC患者血浆中是否存在外体miR-196a。幸运的是，在血浆外体RNA中检测到miR-196a。与健康献血者相比，HNC患者的血浆外体miR-196 a水平升高（图8f） ●●●●。此外，肿瘤切除后血浆外体miR-196a水平降低（图8g） 表明血浆外体miR-196a主要由肿瘤组织产生。化疗耐药患者血浆中的外显子miR-196a水平显著高于化疗敏感患者（图8h） 。同样，血浆外体miR-196a水平与肿瘤增大、淋巴结转移和肿瘤晚期之间也存在正相关（附加文件5：表S5）。此外，Kaplan-Meier分析表明，HNC患者血浆中高外体miR-196a水平与总生存率降低相关，Cox比例风险回归分析进一步证明，高血浆外体miR 196a表达是HNC患者的重要预后因素（图8i；其他文件5：表S6）。重要的是，受试者工作特性（ROC）曲线分析表明，用血浆外泌体miR-196a水平区分化疗耐药组和化疗敏感组的能力是可接受的准确（图8j） ●●●●。这些数据表明，血浆外体miR-196a可以作为一个有价值的预后因素以及HNC患者化疗耐药性的独立预测因子。

讨论

HNC患者由于增殖和化疗耐药，总体预后较差。化疗已被广泛接受为晚期癌症的主要治疗手段，顺铂仍是HNC化疗的一线药物之一。不幸的是，顺铂耐药性变得越来越严重，并且仍然是HNC临床治疗的主要损害之一[三]. 因此，研究顺铂耐药的分子机制对改善HNC患者预后具有重要意义。除了多种已报道的机制外，如药物外排、DNA修复增加以及对药物诱导的凋亡不敏感[三]最近的研究表明，抗药性的机制在很大程度上是由肿瘤微环境的改变而不是肿瘤细胞的改变所决定的[13,14,29,30]. CAF是肿瘤基质中最丰富的细胞，不是被动成分，而是可能对化疗产生潜在反应和影响的关键因素[29,30,31]. 然而，CAFs如何调节癌症，尤其是HNC的化疗耐药性，目前尚不清楚。将CAF作为化疗耐药的基质驱动因素，我们旨在研究CAF介导的HNC顺铂耐药的机制。在本研究中，我们发现HNC衍生的CAF天生对顺铂具有耐药性，并确定CAF-CM在顺铂治疗期间支持HNC细胞的生长和存活。此外，HNC细胞与CAF共培养后对顺铂不敏感。用阿霉素或紫杉醇处理HNC细胞也获得了类似的结果。因此，我们得出结论，CAF可以使HNC细胞对化疗药物具有难治性，但具体机制尚不清楚。

CAFs通过分泌趋化因子、细胞因子、生长因子等调节恶性行为的机制已经被描述[8,9,10,32]. 最近的研究表明，外泌体通过传递致癌DNA、蛋白质和非编码RNA，促进肿瘤进展并增加癌细胞的耐药性[12,19]. 最近的报告表明，CAF衍生的外泌体在促进许多癌症的化疗耐药性方面发挥着关键作用[19,33]HNC未对其进行广泛评估。在我们的研究中，我们证明了CAF分泌的外泌体促进了HNC细胞对顺铂的耐药性，并且用顺铂治疗CAF可增加耐药型外泌物的释放。考虑到HNC肿瘤主要由基质细胞组成的证据，以CAF为靶点的基于外泌体的治疗可能具有更好的疗效。我们的数据表明，外体分泌抑制剂GW4869在体外显著减轻了CAF介导的HNC细胞顺铂耐药性，并抑制了体内肿瘤生长。然而，应进一步进行体内实验，以充分探索使用GW4869提高联合治疗效果的潜在益处。

外泌体可通过多种机制促进肿瘤细胞对化疗产生耐药性。肿瘤来源的外泌体可以将多药耐药性相关蛋白、miRNA和lncRNA转移到受体细胞[34,35]. 最近的证据表明，外泌体介导的miR-21和miR-146a从CAF向肿瘤细胞的传递在受体肿瘤细胞中产生了化疗耐药性[14,15,20]. miRNAs是短的（19-25个核苷酸）非编码RNA，对靶基因表达起负调控作用，参与多种生物过程[33,36]. 重要的是，miRNA放松调控可以提高不同来源肿瘤的耐药性[19,33]. 毫不奇怪，外体miRNAs可能在介导CAF向肿瘤细胞的耐药性转移中发挥作用。在本研究中，我们确定CAF衍生的外体miR-196a是赋予顺铂对HNC细胞耐药性的功能分子。此外，我们还发现miR-196a在顺铂治疗HNC后可以促进细胞生长并抑制细胞凋亡。据报道，miR-196a上调与其他癌症（如宫颈癌、胃癌和膀胱癌）的增殖和化疗耐药性增加相关[37,38,39,40]，这与我们的数据相符。重要的是，我们进一步研究了miR-196a是如何被包装成外显子的。在外显体中，RBP如hnRNPQ和hnRNPA2B1已被证明通过结合特定模体参与外显体miRNA的输出[41,42]. 除hnRNP外，Ago2和Y-box蛋白1在miRNA贩运中也有相关功能[43,44]. 有趣的是，外体miRNA输出的第三种调节机制被确定为lncRNA-miRNA相互作用[35]类似于miRNA海绵。在本研究中，我们发现hnRNPA1通过miR-196a 5′端的一个特定序列（UAGGUA）特异性结合miR-196α，将miR-196a包装入外泌体，这可能为肿瘤治疗过程中消除HNC基质生态位中的miR-196b提供了一种机制。然而，存在于外泌体中的一些其他功能因子也可能有助于HNC细胞中的顺铂耐药性，并且miR-196a如何被包装到外泌体中尚未完全阐明。因此，今后应进行进一步研究，以更好地说明这些问题。

外显子转运被认为是调节受体细胞信号传递和生物功能的有效手段。外体miR-196a从CAF传递到HNC细胞后，通过靶向CDKN1B和ING5，在功能上调节增殖和凋亡能力。CDKN1B蛋白，也称为p27，是驱动G1/S转换的细胞周期素依赖性激酶的有效抑制剂。p27蛋白被认为是一种具有单倍体不足表型的肿瘤抑制因子，在缺乏p27的情况下，CDK2活性增加[45]. p27表达降低在多种人类肿瘤中普遍存在，这与预后不良和耐药性有关[46]. ING5是一种II类肿瘤抑制剂，在许多癌症中下调，能够抑制细胞生长和增殖，诱导凋亡，并通过调节多种信号通路负向调节耐药性[47,48]. ING5蛋白参与基因的转录调控，如p53诱导基因p21和Bax[48]. ING5还被发现影响翻译后修饰，并有助于在放疗或化疗时保持基因组稳定性[49]. 与这些结果一致，我们的结果显示，在HNC中CDKN1B和ING5水平下调，这与肿瘤生长、淋巴结转移、肿瘤晚期和化疗耐药相关。此外，我们还证明miR-196a介导的G1/S细胞周期转换主要由p27调节，而ING5主要通过调节细胞凋亡发挥其功能。考虑到ING5的复杂功能，在未来的研究中，除了抑制细胞凋亡外，还应进一步努力阐明ING5介导的化疗耐药的确切机制。

液体活检是指基于体液中循环遗传物质对疾病遗传表型进行分子分析，已用于监测疾病反应和追踪实体肿瘤（包括HNC）的耐药机制[50,51,52]. 外泌体是细胞间通讯的关键介质，通过在相邻细胞之间运输功能性物质，或通过生物流体到达遥远的细胞，在那里外泌体能被检测到[52]. 血浆外体miRNAs是一种新的自由形式的液体活检来源，是许多疾病，尤其是癌症的有希望的诊断和预后生物标记物[51,52]. 在本研究中，我们证实了在HNC组织中miR-196a的过度表达导致HNC患者血浆中的外体miR-196 a上调。与HNC组织中的miR-196a水平类似，血浆外体miR-196 a水平的上调与HNC的恶性表型（包括化疗耐药）呈正相关。此外，血浆外体miR-196a在预后和预测化疗耐药方面也显示出良好的准确性。因此，我们得出结论，血浆外体miR-196a可能是一个有价值的预后因素和HNC患者化疗耐药性的独立预测因子。然而，血浆外体miR-196a的临床预后和预测效率需要在扩大的HNC队列中进一步验证，还需要进行进一步的研究，以调查血浆中的任何其他外体miRNAs是否也可以预测HNC的化疗耐药性。

结论

我们的结果表明，CAF天生对顺铂具有耐药性，而暴露于顺铂的CAF的外显子可以通过转移功能性miR-196a在HNC细胞中赋予化疗耐药性和侵袭性表型。重要的是，我们的数据还显示，hnRNPA1蛋白介导miR-196a包装进入CAF中的外显子。此外，我们的研究强调了CAF衍生的外体miR-196a通过靶向HNC微环境中的CDKN1B和ING5在促进细胞增殖和抑制细胞凋亡方面的作用。同时，CAF的外体或外体miR-196a缺失可以在功能上恢复HNC细胞的顺铂反应。此外，我们发现血浆外体miR-196a与临床上不良的总体生存率和药物敏感性相关。因此，miR-196a可能是HNC顺铂耐药的一个有希望的预测因子和潜在的治疗靶点。

方法

伦理学

上海交通大学伦理委员会批准了我们的研究。参与者在报名前提供书面知情同意书。所有实验方法都遵守赫尔辛基宣言。所有动物研究均按照NIH《实验动物护理和使用指南》进行，并获得上海交通大学研究所动物护理和利用委员会的批准，实验小鼠在上海交通大学医学院动物设施饲养。

患者和标本

所有临床样本均来自上海交通大学医学院（中国上海）第九人民医院口腔颌面头颈肿瘤科。更具体地说，从2011年9月至2015年6月期间被诊断为原发性HNC并接受首次手术的患者中获得80对肿瘤和邻近正常组织，并在2018年7月至2018年9月期间收集了另外28对肿瘤和相邻正常组织（无完整的预后信息）。这些患者在采样前未接受任何系统治疗。每个样品的一半在液氮中快速冷冻，直到提取出总RNA和蛋白质，另一半送去进行病理诊断。在2011年6月至2016年8月期间，我们招募了74名原发性HNC患者，在手术前收集了他们的血浆样本，并将其储存在−80°C下，直到进一步处理。在另外40名HNC患者中，分别于手术前1天和肿瘤切除后3天采集血浆样本。此外，从第九人民医院体检的30名献血者中选取血浆样本作为健康对照。在本研究中，这些HNC患者均未接受任何术前癌症治疗，术后组织学诊断为HNC。同时，从敏感的晚期HNC患者的活检或手术标本中收集肿瘤组织(n个 = 20） 或耐腐蚀(n个 = 20） 化疗。我们还回顾了这些HNC患者的病历和随访数据。此外，根据世界卫生组织肿瘤分类和国际癌症控制联盟（UICC）的肿瘤淋巴结转移（TNM）分期系统（2010）分别确定病理分化和临床分期。

细胞培养

SCC-4、SCC-9、SCC-25、CAL 27和293T细胞购自美国类型培养库（ATCC，USA），人类HNC细胞系HN4、HN6和HN30由美国马里兰大学牙科学院善意提供。通过与顺铂浓度梯度孵育1年，从HN4细胞建立顺铂耐药细胞系HN4-res，并将其保存在含有15μM顺铂的培养基中（Sigma-Aldrich，美国）。如前所述[9]通过原代培养从HNC组织中分离出CAF和原代癌细胞，而NF则来自配对的相邻正常组织。通过CAF特异性标记物（α-SMA、FAP和FSP1）的存在进一步鉴定配对NF和CAF。将SCC-4、SCC-9和SCC-25细胞培养在37°C的Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F-12；GIBCO-BRL，美国）中，该混合物补充有10%的胎牛血清（FBS；GIBCO-BRL，美国）、青霉素（100单位/mL）和链霉素（100μg/mL），并在湿润的5%CO中培养₂而其他细胞则保存在含有相同添加剂的DMEM培养基中。此外，在含有0.2 ng/mL重组表皮生长因子（rEGF；Invitrogen，美国）的无血清角质形成细胞培养基（KSF；GIBCO-BRL，美国）中培养正常初级口腔上皮细胞。

免疫荧光

电池（3×10⁴盖片上生长的每孔细胞）用4%多聚甲醛固定，用0.1%Triton X-100渗透，用3%BSA封闭，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。此后，在室温下将样品与Alexa Fluor 488-共轭抗鼠IgG F（ab′）2片段（Invitrogen，美国；1:200）、Alexa Fluor 549-共轭抗兔IgG G F（lb′）2片断（Invitrougen，美国；1:200通过用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Invitrogen，美国；1:300）处理进一步发展，以检测细胞核。使用TCS SP2激光扫描共焦显微镜（德国莱卡微系统公司）观察和成像细胞，参见附加文件6：表S7所用抗体。

蛋白质印迹分析

在指定时间采集细胞或外泌体，用SDS裂解缓冲液（中国Beyotime）制备，并在14000×克在4°C下保持10分钟。使用10%或15%的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质（30μg），并将其转移到0.22μm PVDF膜上（美国默克密理博公司）。在室温下用5%BSA封闭斑点1小时，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。β-肌动蛋白蛋白被用作负载对照。此后，用红外染料标记的二级抗体探测膜，并使用奥德赛红外成像系统（美国生物科学公司）观察信号，参见附加文件6：表S7所用抗体。

MTT分析

MTT法检测细胞活力。对于HNC细胞的药物反应，按照指示对肿瘤细胞进行预处理，然后将其接种在96 well板中，每个孔中的细胞密度为3000个，一式六份。12小时后，将细胞与梯度浓度的治疗药物孵育72小时。将细胞与100μL的0.5 mg/mL 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT；Sigma-Aldrich，USA）在DMEM培养基中孵育4小时。然后通过添加150溶解形成的甲氧嗪mL二甲基亚砜（DMSO）。在多孔板读取器（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）中在490nm处读取吸光度。通过除以一半最大抑制浓度（IC50）来评估肿瘤细胞的药物反应程度。

为了研究HNC细胞的细胞增殖能力，在预处理后，将肿瘤细胞以每孔1000个细胞的密度接种在96 well板中，一式三份。在共培养期间，每天通过读取490 nm处的吸光度来监测肿瘤细胞的生长。

CM准备

约2×10⁶将供体细胞接种在直径为10cm的培养皿中。24小时后，用无血清DMEM代替培养基并孵育48小时。对于来自顺铂处理的细胞的cm，将细胞与含有10μM顺铂的无血清DMEM孵育。供体培养基以3000×克保存10分钟，并在4°C下保存。对于细胞的长期治疗，制备的CM补充有2%的无外泌体FBS（SBI，美国）。为了获得无外显体的CM，CM在300×克20分钟，2000×克20分钟，12000×克持续70分钟以耗尽培养基中的外泌体。

外显子分离

对于胞外体纯化，CM通过0.22μm PVDF过滤器（美国密理博）过滤进行预清除。如前所述，通过差速离心步骤从CM中分离出外显子[53]. 使用配备NTA 3.0分析软件（英国Malvern Instruments Ltd.）的NanoSight NS300仪器（英国Malvern Instrumentals Ltd.）定量外显体的大小和浓度。此外，使用ExoQuick血浆制剂和Exosome沉淀试剂盒（SBI，美国）分离血浆外泌体。对于外体RNA和蛋白质提取，外体分别用核糖核酸酶或蛋白酶K预处理。外体部分蛋白质含量由Pierce®BCA蛋白质检测试剂盒（美国Thermo Scientific）进行评估。

透射电子显微镜

为了进行电子显微镜分析，将外显体放在铜网格上，用2%磷钨酸负染2分钟。空气干燥15分钟后，在80 kV的透射电子显微镜下观察样品（FEI Tecnai G2 Spirit，Thermo Scientific，USA）。

外泌体的荧光标记和转移

分离出的外泌体用亲脂染料DiO（美国Thermo Scientific公司）以10μM的工作浓度进行标记，并在37°C下培养20分钟。标记的外泌体用PBS洗涤，然后在12000×克在4°C下保持70分钟。HNC细胞（3×10⁴每个孔的细胞）以24孔的形式与DiO标记的外泌体以25μg/mL的浓度孵育24小时。为了鉴定外体miR-196a的转移，将Cy3标记的miR-196 a转染到CAF。然后使用24孔格式的跨阱室将表达Cy3-miR-196a的CAF与HNC细胞共培养48小时。然后按照上述方法制备细胞进行免疫荧光。此外，HNC细胞的细胞骨架用TRITC Phalloidin（中国YEASEN）或FITC Phalloid（中国YAESEN）选择性染色。最后，用共焦显微镜测量外显体或外显体miR-196a的内化。

对于流式细胞术，HNC细胞（2×10⁵每个孔的细胞）用浓度为25μg/mL的DiO标记的外泌体以6孔的形式处理。分别于0h、1h、2h、4h、6h、12h和24h采集细胞样本；在500μL PBS中再悬浮；并用DAPI染色。通过使用流式细胞仪捕获DiO信号来评估HNC细胞中是否存在外显体（FACS Calibur，BD Biosciences，美国）。

共培养分析

使用12孔形式的transwell膜（孔0.4μm，Merck Millipore，USA）建立共培养测定。CAF预先用GW4869（Selleck，USA；20μM）或DMSO预处理24小时。共培养3-6天，而CAF（5×10⁴细胞），然后用GW4869（20μM）或DMSO处理HNC细胞（5×10⁴细胞），准备进行RNA提取或进一步的细胞学实验。

质粒构建

用primeSTAR HS DNA聚合酶（日本Takara）扩增hnRNPA1、CDKN1B、CDKN1 B 3′UTR（带3′UTRs）、ING5和ING5 3′UTR-（带3’UTR）的cDNA，并亚克隆到PGMLV-6395载体（中国Genomeditech）的EcoR I和Xho I位点。为了获得荧光素酶报告子，将CDKN1B和ING5的3′UTR的PCR衍生片段插入PGL3-CMV-LUC-MCS载体（Genomeditech，中国）的Xba I和BglI I位点。进行基于PCR的定点突变以生成突变荧光素酶报告子。此外，miR-196a、抗-miR-196a和hnRNPA1 shRNA质粒购自Genomeditech（中国）。附加文件中列出了本研究中用于质粒构建的引物序列7：表S8。

细胞转染

根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000试剂（Invitrogen，美国）进行质粒转染。使用最终浓度为100 nM的Lipofectamine RNAiMAX（美国Invitrogen）进行siRNA（中国Genomeditech）或miRNA模拟物或抑制剂（中国Ribobio）的转染。本研究中针对特定靶点的siRNA序列列于附加文件中7：表S9。

生物素miRNA下拉分析

先前的研究中描述了详细的方案[42]. NE-PERTM核和细胞质提取试剂（美国Thermo Scientific）用于分离和制备CAF的细胞质和核提取物。简言之，CAF的核、细胞质或外体裂解物在4°C下与100 pmol的合成单链miR-196a或突变的miR-196寡核苷酸孵育过夜，其中包含通过间隔臂连接到5′端的生物素修饰物（Sigma-Aldrich，美国）。将洗涤过的链霉亲和素琼脂糖珠（Invitrogen，美国）添加到每个结合反应中，然后在4°C下进一步培养4 h。将沉淀洗涤五次并在SDS缓冲液中煮沸，然后进行蛋白质印迹分析。生物素化聚（G）（5′-GGGGGG-GGGG GGGGTGG-3′）作为阴性对照。

RNA提取和实时PCR分析

用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）提取细胞或组织的总RNA，并使用Prime Script RT试剂盒（Takara，日本）将其反转录成cDNA。使用miRcute Plus miRNA第一链cDNA合成试剂盒（中国天根）从细胞和组织的总RNA中合成miRNA cDNA。合成的外源参考cel-miR-39（每个样品1 pmol；提前将中国天津）添加到培养基（350μL）或外显子（100μg）中，并使用mirVana™PARIS™Kit（美国Ambion）提取这些样品中的miRNA。mRNA的实时PCR使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒（日本塔卡拉）和ABI StepOne实时PCR系统（美国应用生物系统公司）进行，而miRNA的实时PCR使用miRcute Plus miRNA qPCR检测试剂盒（中国天津）进行。在细胞和组织裂解物中，mRNA水平根据β-肌动蛋白标准化，miRNA水平根据U6标准化。此外，培养基和外泌体中的miRNA水平根据外源参考cel-miR-39进行了标准化。本研究中用于实时PCR的引物序列列于附加文件中7：表S10。

RIP分析

使用EZ-Magna RIP RNA-结合蛋白免疫沉淀试剂盒（美国密理博）进行RIP分析。简单地说，收集细胞并在补充有蛋白酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂和1 mM PMSF的冰镇裂解缓冲液中进行裂解。在14000×克15分钟，保存50μL裂解液作为输入。将蛋白质提取物（1 mg）与3μg兔抗hnRNPA1抗体（Cell Signaling Technology，USA）或兔IgG（Proteintech，USA）在4°C下孵育过夜，并进行端对端旋转。然后添加大约30μL A/G蛋白磁珠，并在4°C下孵育4小时。然后，将磁珠清洗五次，并使用mirVana™PARIS™Kit（美国安比昂）提取免疫沉淀miRNAs。对分离的miRNA进行逆转录，然后进行实时PCR分析。此外，免疫沉淀样品中的miRNA折叠富集以输入百分比表示，并与IgG等型对照进行比较。

荧光素酶分析

简单地说，293T或肿瘤细胞（3×10⁴使用Lipofectamine™3000（美国Invitrogen）将24孔板中生长的每孔细胞与荧光素酶报告子（每孔200 ng）、miR-196a或抗miR-196 a质粒（每孔200ng）和10 ng Renilla荧光素酶载体（pRL-CMV；Genomeditech，中国）共转染。大约48小时后，根据制造商的说明，使用双荧光素酶报告试剂盒（美国Promega）测量这些样品的荧光素素酶和肾素活性。

miRNA靶点的免疫沉淀

如前所述，使用靶mRNA进行生物素化miR-196a（Genomeditech，中国）下拉分析[28]. 简言之，5×10⁶用3′生物素标记的miR-NC或miR-196a转染10-cm培养板中培养的癌细胞48 h。用裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100 mM KCl、5 mM MgCl）对转染细胞进行裂解₂，0.3%IGEPAL CA-630，60 U/mL Superase，1×蛋白酶抑制剂）并收获。取50μl等分上清液作为输入。样品裂解物与链霉亲和素-Dyna珠培养（每个样品50μl；Invitrogen，美国）在旋转器上4°C过夜。然后，收集珠子并用冰镇裂解缓冲液清洗五次。使用mirVana™PARIS™试剂盒（美国Ambion）分离输入和下拉样本中的RNA，进行逆转录，然后进行qRT-PCR。分析如下：A=miRNA下拉/控制下拉，B=miRNA输入/控制输入，折叠富集=A/B。

体内致瘤性试验

进行异种移植试验以确定hnRNPA1在CAF介导的HNC体内生长中的有效作用。通过皮下注射CAL 27细胞与表达hnRNPA1或沉默hnRNPA1-的CAF（5×10⁵肿瘤细胞加3×10⁵每次注射的CAF）注入小鼠左右臀部（每组5只小鼠）。每3天测量肿瘤体积和体重。大约24天后，处死小鼠，取出移植的肿瘤进行后续分析。利用垂直轴上的肿瘤体积和水平轴上的接种日绘制肿瘤生长曲线。

为了评估CAF衍生的外体miR-196a在体内的功能作用，将实验小鼠分为九组(n个 = 5） ：CAL 27组、CAL 27+CAFs+DMSO组、CAL27+CAF+GW4869组、CAL-27-miR-NC组、CAL27-miR-196a组、CAL17+CAF-miR-NC组，CAL 27+CAF-miR-196a组，CAL27+CAF-anti-miR-NC组别，以及CAL27+CAF anti-miR-196a组。此后，肿瘤细胞（1×10⁶每点细胞数）或混合细胞数（5×10⁵肿瘤细胞加3×10⁵将无血清DMEM中每点的CAFs皮下注射到小鼠的左右臀部。对于CAL 27+CAFs+GW4869组，注射前用GW4869（20μM）预处理CAF 24 h，每2天腹腔注射GW4869。注射12天后，小鼠每隔4天接受5次腹腔注射4mg/kg顺铂，并在第32天处死小鼠进行进一步分析。

统计分析

本研究采用SPSS 19.0软件进行统计分析。Student’s有选择地分析了两个或多个组之间的重要性t吨测试或单向方差分析。曼·希特尼U型试验和Kruskal-Wallis试验用于分析基因（miR-196a、hnRNPA1、CDKN1B和ING5）水平与临床参数之间的相关性。进行皮尔逊相关分析以确定两个变量之间的相关性。根据基因表达中位数（miR-196a、hnRNPA1、CDKN1B和ING5）将患者分为高表达组和低表达组，并通过log-rank检验对基于二分法基因表达的HNC患者进行Kaplan-Meier生存分析，以比较HNC患者的生存率。Cox比例风险回归分析用于评估临床变量对患者生存的影响。构建了一个通用线性模型来评估不同miRNA的协同效应。通常，数据显示为三个独立体外实验的平均值±SD，以及第页 < 0.05被认为具有统计学意义。

有关免疫组织化学分析、慢病毒包装、miRNA阵列分析、EdU标记分析、平板集落形成分析、细胞周期分析、细胞凋亡分析、CHIP分析、FISH分析和TUNEL分析的详细方法，请参见附加文件8：补充方法。