肠道微生物组减少可防止酒精诱导的神经炎症，并改变肠道和大脑炎性体的表达

摘要

背景

酒精的终末器官效应贯穿全身，从胃肠道到中枢神经系统（CNS）。在肠道内，酒精的使用改变了微生物组分的组成，增加了肠道的通透性，使微生物组分转移到循环中。肠源性病原体相关信号在肝脏和身体其他部位引发炎症反应。因为之前的研究表明肠道微生物组会导致酒精诱导的肝病，我们假设服用抗生素以减少肠道微生物组将减轻酒精诱导的大脑和小肠炎症（SI）。

方法

6至8周龄C57BL/6J雌性小鼠在液体饮食或热量匹配的对照饮食中摄入酒精10天，最后一天摄入急性酒精或糖（急性或慢性酒精摄入）。一些小鼠每天口服抗生素以减少肠道微生物群。我们通过ELISA比较了血清TNFα、IL-6和IL-1β的水平；细胞因子的表达Tnfα,Mcp1基因,嗯1,伊尔-17,伊利-23,伊尔-6、和Cox2公司; 和炎症组分Il-1β,伊尔-18,案例1,抗坏血酸、和Nlrp3号机组通过qRT-PCR在CNS和SI中进行检测。用免疫组织化学IBA1染色法分析皮层和海马的小胶质细胞形态。

结果

抗生素显著降低了酒精喂养和配对喂养小鼠的肠道微生物负荷。在抗生素治疗的小鼠中，酒精诱导的神经炎症和SI细胞因子表达的增加被减弱。Acute-on-chronic乙醇未诱导血清TNFα、IL-6和IL-1β。酒精喂养显著增加促炎细胞因子的表达，如Tnfα,Mcp1基因,嗯1,伊尔-17、和伊利-23在大脑和肠道中。抗生素治疗导致肠道细菌负荷减少，减弱了大脑和SI中所有这些酒精诱导的促炎细胞因子的表达。酒精喂养导致小胶质细胞活化，大脑皮层和海马的形态学改变，表现为反应性表型。在抗生素诱导肠道微生物群减少后，这些酒精诱导的变化被消除。出乎意料的是，抗生素治疗增加了大脑和肠道中一些炎症组分的mRNA表达。

结论

我们的数据首次表明，小鼠急性和慢性酒精摄入可诱发神经炎症和肠道炎症，肠道细菌负荷减少可减轻酒精相关的中枢神经系统和肠道炎症。肠道微生物源性信号在急性或慢性酒精暴露中有助于神经炎症。

背景

长期饮酒会导致肠道细菌成分（如内毒素）从肠腔转移到循环中[1,2,三]. 一旦被吸收，酒精和肠道来源的内毒素通过门静脉循环输送到肝脏，在那里开始新陈代谢，并引发炎症级联反应。然而，内毒素、未代谢酒精和酒精代谢物也会通过肝脏到达全身循环和其他器官，包括外周免疫系统和中枢神经系统（CNS）。虽然之前的研究已经调查了酒精对大脑的直接影响[4,5,6]目前，人们对肠道衍生微生物产物的作用及其对神经系统和神经炎症的影响知之甚少。

小胶质细胞在感知和响应酒精摄入方面起着关键作用，并参与多种免疫信号通路[7,8,9,10]. 小胶质细胞表达Toll样受体4（TLR4），这是一种在酒精诱导的神经炎症中起关键作用的模式识别受体[11,12,13]以及含有NLR家族pyrin结构域的3（NLRP3）炎症小体[9]. 先前的研究表明，TLR4敲除小鼠可以免受大脑不同区域细胞因子表达增加和小胶质细胞活化增加的影响[14,15,16]. TLR4识别内源性危险信号，如HMGB1[17,18]是细菌内毒素（也称为脂多糖（LPS））的主要模式识别受体[19]. 虽然内毒素一般不被认为会穿过血脑屏障[20]来自TLR4基因敲除小鼠的数据表明，通过TLR4的信号传递是影响酒精诱导的神经炎症的重要成分。神经炎症由炎症小体复合物介导，炎症小体复合体是一种多蛋白复合物，可感知病原体和危险信号，导致前炎性IL-1β和IL-18的分解和释放[9].

LPS信号也是与饮酒相关的肝脏病理学的重要组成部分。酒精代谢导致细胞应激、肝细胞损伤和肝脏中无菌危险信号的释放[21,22]. 从肠道微生物组中提取的内毒素进入门脉循环，被TLR4等模式识别受体识别，并引发继发于肝细胞应激和酒精代谢引起的活性氧释放和其他细胞应激所造成的损伤的炎症反应。有趣的是，我们和其他人已经证明，用抗生素治疗小鼠可以减少胃肠道的细菌负荷（从而降低内毒素水平），从而减轻饮酒后的肝脏炎症和脂肪变性[23,24,25]. 肠道细菌负荷的减少可以改善酒精引起的大脑变化。

为了进一步探讨肠道微生物组在肠-脑轴中的关键作用，我们使用抗生素来减少小鼠的肠道细菌负荷。在小鼠急性或慢性饮酒后（10天饮酒后急性饮酒狂欢），我们发现酒精会导致中枢神经系统的神经炎症，也会增加小肠中细胞因子的表达。抗生素诱导的微生物群减少减轻了两个器官的炎症。有趣的是，虽然细胞因子表达降低，但抗生素治疗诱导了炎症小体成分的mRNA表达以及炎症小体在中枢神经系统和肠道中处理的细胞因子。这些结果首次表明，通过减少微生物负荷来操纵肠道微生物组可以防止酒精诱导的中枢神经系统和肠道炎症。我们的研究为酒精诱导的肠-脑轴中肠道微生物组和大脑的相互作用提供了重要的见解。

方法

小鼠酒精喂养

所有动物研究均由马萨诸塞大学医学院（UMMS）动物护理和使用委员会批准。野生型C57BL/6J 6至8周龄雌性小鼠从Jackson Laboratories购买，并共同安置在UMMS动物医药设施内。选择雌性小鼠是因为它们比雄性小鼠更容易受到酒精诱导的肝损伤[26,27,28]. 酒精喂养遵循Bertola等人之前描述的急性-慢性模型[29]. 简单地说，所有小鼠都接受了5天的双喂Lieber-DeCarli（Bio-Serv）液体饮食。然后，一些小鼠在液体饮食中摄入5%的酒精和麦芽糖右旋糖酐，而成对喂食的小鼠则保持在对照液体饮食中。配对喂养的小鼠与酒精喂养的小鼠热量匹配。在献祭前9小时，喂食酒精的小鼠通过口服灌胃方式摄入酒精（5 g kg⁻¹体重）和配对喂养的小鼠接受等热量麦芽糖右旋糖酐。

抗生素治疗

小鼠每天两次，口服灌胃灌胃水或含有氨苄青霉素（100mg/kg体重（BW）；西格玛）、新霉素（100 mg/kg BW；吉百科）、甲硝唑（100 mg/kgBW；Sigma）和万古霉素（50 mg/kg BW；Sigma-）。喂食从液体饮食的第一天开始，每天持续喂食，直到完成酒精喂养。与之前的报告类似，细菌培养（如下所述）证实了细菌负荷的显著减少[23].

细菌培养

小鼠粪便直接从肛门收集并悬浮在巯基乙酸盐培养基中。将悬浮液涂布在非选择性LB琼脂平板（EMD Millipore）上，并在37°C下培养24小时，以评估细菌负荷减少情况。

qPCR分析

根据制造商的说明，使用miRNeasy提取试剂盒（Qiagen）从小肠和大脑皮层组织提取RNA，包括柱上DNA酶消化（Zymo Research）。cDNA的逆转录从1μg RNA开始，然后在无核水中1:5稀释完成。根据制造商的说明，使用SYBR Green（BioRad）进行实时qPCR。表中列出了RT-qPCR引物1、和18秒mRNA表达被用作2^{−ΔΔ计算机断层扫描}RNA表达分析方法。为了对经抗生素治疗和未经抗生素治疗的动物进行16S比较，根据制造商的方案，使用QIAamp DNA粪便迷你试剂盒（Qiagen）提取粪便细菌DNA。使用与上述类似的16S引物进行qPCR反应后，aΔ计算机断层扫描使用平均值计算计算机断层扫描每个重复样本的值，减去平均值Δ计算机断层扫描未经处理的配对喂养小鼠。细菌16S PCR产物在1%琼脂糖凝胶上运行，以观察细菌负荷的相对减少。

表1实时PCR引物

血清细胞因子测定

在处死之前，对小鼠进行面部出血，并分离血清。采用ELISA法测定TNFα和IL-6（Biolegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥）和IL-1β（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）。

免疫组织化学

牺牲后，在石蜡包埋前隔夜将脑组织解剖并固定在10%福尔马林中。使用抗电离钙结合适配器分子（IBA1）抗体（Wako；1:1000）在UMMS形态学核心完成免疫组织化学染色，然后用链霉亲和素-生物素免疫酶抗原标记，用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）检测（UltraVision Mouse Tissue detection System anti-Mouse HRP/DAB；实验室愿景）。通过光学显微镜（皮层；海马CA1、CA3和DG）在×40倍放大率下从所述CNS区域获取图像，以使用ImageJ测量小胶质细胞的突起长度和细胞体大小。使用ImageJ的徒手测量工具，通过追踪体细胞到其远端末端的所有延伸，测量每个小胶质细胞的细胞突起长度。对于每个小胶质细胞，将所有过程的长度相加，以获得总的细胞过程长度。通过追踪细胞体的周长并使用ImageJ的徒手示踪剂和面积测量功能测量包含的面积来测量体面积。从每只小鼠的每个中枢神经系统区域随机采集五到九张图像，对小胶质细胞进行分析。在染色、图像采集和ImageJ分析过程中，研究人员对样本组不了解。IBA1阳性使用颜色反卷积ImageJ中的插件。

统计分析

使用GraphPad Prism 7.0版，使用Mann-Whitney测试进行统计分析。第页 < 0.05被认为具有统计学意义。使用Grubbs的离群值检验（alpha设置为0.05）计算离群值排除。

结果

抗生素治疗可显著净化肠道细菌负荷

虽然已经研究了慢性饮酒对肠道微生物组、酒精性肝病和神经炎症的调节作用，但尚不清楚短时间饮酒和/或酗酒如何影响中枢神经系统的炎症信号，以及肠道微生物组在这一过程中起到什么作用。在这项研究中，小鼠在液体饮食中摄入5%酒精（EtOH）10天（经过5天的液体饮食适应期），然后进行一次性酗酒或热量匹配的双喂（PF）饮食[29]. 之所以选择雌性小鼠，是因为它们对酒精更敏感，而之前的研究主要针对雌性动物[26,27,28]. 为了阐明肠道微生物组在从肠道向肠外器官转移病原相关分子模式（PAMP）中的重要性，我们采用口服抗生素混合物（氨苄西林、新霉素、万古霉素和甲硝唑）来大幅减少肠道中的细菌负荷（图1a个). 在成对喂养和酒精喂养的小鼠中，口服抗生素治疗（Abx）导致处死时循环中的内毒素显著减少（图1亿). 16S细菌DNA的表达通过抗生素治疗显著降低（图1c、d). 在非选择性琼脂平板上培养的粪便细菌在抗生素治疗5天后也几乎完全消除了可培养菌落（图第1页). 15天研究的结论表明，粪便中的细菌有所恢复，可能是由于抗生素耐药性的发展（图。第1页). 然而，与未经治疗的小鼠相比，经抗生素治疗的动物在牺牲当天获得的粪便中的细菌集落形成单位（CFU）显著减少（图。第1页). 总之，这些数据表明，抗生素治疗成功地抑制了配对和酗酒小鼠的肠道细菌负荷并降低了循环内毒素。

图1

口服抗生素可显著降低肠道细菌负荷。一对四组野生型C57BL/6J雌性小鼠进行配对饮食（PF；n个 = 5） 5%酒精饮食（EtOH；n个 = 10） ，含PF的口服抗生素（Abx）(n个 = 6） 或Abx with EtOH(n个 = 9). 在献祭前9小时进行剧烈的糖或酒精狂饮。b条在牺牲时测量血清内毒素，以确定肠道细菌产物向体循环的移位。c（c）处死前从PF和EtOH小鼠粪便中分离出DNA，并用通用16S引物进行qPCR检测16S DNA。d日PCR产物来自c（c）用琼脂糖凝胶对四组进行总体比较。e（电子）将粪便重新悬浮在巯基乙酸盐中，并放置在非选择性琼脂上，以测量抗生素治疗前（未经治疗）、Abx治疗5天后（Abx第5天）和实验结束时（Abx第一天）的肠道细菌负荷。（f）从第15天牺牲时提取的粪便中对集落形成单位（CFU）进行量化。数据为平均值±SEM，n个 = 5-10只小鼠/组*第页 < 0.05; 不另作说明，不重要

肠道去污消除大脑皮层中酒精诱导的促炎细胞因子表达

慢性酒精在动物模型和人类患者中诱导循环促炎细胞因子[30,31]. 为了确定这种系统性细胞因子诱导是否也发生在小鼠的急慢性模型中，我们测量了血清中循环的TNFα和IL-6（图2a个). 虽然酒精并没有引起两种细胞因子的统计显著性增加，但抗生素治疗显著降低了配对喂养和酒精喂养小鼠的循环TNFα（图2a个).

图2

抗生素治疗可保护大脑皮层免受酒精诱导的炎症细胞因子表达。一ELISA法检测血清TNFα和IL-6。b条促炎细胞因子的表达水平Tnfα,Mcp1基因,嗯1,伊尔-17,伊利-23,伊尔-6、和Cox2公司从配对喂养（PF）或酒精喂养（EtOH）小鼠的皮层中测量，无论是否进行每日抗生素治疗（Abx）。数据为平均值±SEM，n个 = 5-10只小鼠/组*第页 < 0.05; 不另作说明，不重要

长期饮酒会导致人类和小鼠的神经炎症[7,12]. 我们发现，10天的慢性酒精摄入后，小鼠一次性狂饮，这是一种以前没有用于研究神经炎症的急性或慢性酒精摄入模型，诱导了炎症因子基因的显著高表达，包括Mcp-1型,嗯1、和伊尔-17和表达增加的无显著趋势Tnfα和伊利-23在大脑皮层（图2亿).Tnfα,Mcp-1型,嗯1,伊尔-17、和伊利-23是可由多种细胞类型释放的促炎细胞因子，每种细胞因子以前都与酒精诱导的神经炎症有关[9,14,32,33]. 酒精不会诱导伊尔-6或Cox2公司。有趣的是，伊尔-6与未经处理的小鼠相比，经抗生素处理的小鼠在配对喂养的小鼠中被诱导，而酒精喂养降低了这种诱导（图2亿).

以前的研究表明，减少肠道细菌负荷的抗生素治疗也可以减少酒精引起的肝脏炎症[23]. 在这里，我们假设肠道细菌产物转移到中枢神经系统有助于酒精诱导的神经炎症，并且该过程受肠道微生物负荷的调节。因此，我们试图研究肠道净化是否可以防止与饮酒相关的神经炎症。我们观察到，与PF对照组相比，服用Abx的小鼠大脑皮层中促炎细胞因子表达的增加明显减少（图2亿). 抗生素治疗完全阻止了酒精诱导的Mcp1基因,伊尔-17、和伊利-23皮层mRNA表达。Tnfα在抗生素治疗的酒精喂养小鼠中诱导表达，与抗生素治疗的配对喂养小鼠相比，但其表达仍显著低于未经抗生素治疗的乙醇喂养小鼠。的表达式Tnfα,Mcp1基因,伊尔-17、和伊利-23与未经抗生素治疗的小鼠相比，经抗生素处理的配对喂养小鼠的皮层也减少了。这些结果表明，小鼠急性或慢性酒精摄入增加了促炎细胞因子诱导，而肠源性PAMP和肠道微生物组的减少阻止了这种诱导。

随着细菌净化，炎症组分的皮层表达增加

因为我们发现经抗生素治疗的小鼠皮层中多种促炎细胞因子减少（图2)接下来，我们测量炎症小体相关转录物，以阐明酒精或抗生素是否影响炎症小体介导的细胞因子表达。炎症小体是一种含有NOD-like受体（NLRs，包括NLRP3）的多蛋白复合物，可以感知病原体和危险信号、衔接分子ASC和效应分子caspase-1。炎症激活导致前IL-1β和前IL-18裂解为各自的生物活性形式，即IL-1β与IL-18[9]. 我们发现，虽然酒精不会诱导IL-1β，但抗生素治疗会增加配对喂养小鼠的循环血清IL-1β(第页 < 0.05），并有增加酒精喂养小鼠的趋势(第页 = 0.055）（图3a年). 有趣的是，尽管慢性饮酒模型导致炎症组分和Il-1β[9]，我们发现酒精诱导的Il-1βmRNA在急性-慢性酒精模型中的表达（图3亿). 然而，皮质Il-1β经抗生素治疗的配对喂养小鼠的mRNA表达显著增加，我们观察到Il-1β与未经处理的小鼠相比，经抗生素处理的酒精喂养小鼠。有趣的是，在抗生素治疗的小鼠中，酒精摄入显著增加Il-1βmRNA表达与配对喂养小鼠相比。的表达式伊尔-18在酒精喂养的小鼠大脑皮层中诱导，类似于成对喂养的小鼠的增加Il-1β，我们还发现伊尔-18和抗坏血酸与未经抗生素治疗的PF小鼠相比，经抗生素治疗后的PF鼠的血糖水平升高（图3亿). Acute-on-chronic酒精注射降低了Nlrp3号机组和抗坏血酸并增加了伊尔-18与未经治疗的PF对照组相比，未经处理的酒精喂养小鼠。抗坏血酸和伊尔-18与未经治疗的酒精喂养小鼠相比，经抗生素治疗的小鼠的mRNA表达降低（图3亿).半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1mRNA水平在任何治疗组中都没有显著变化（图3亿). 这些观察结果表明，炎症组和IL-1β的调节依赖于肠道微生物组，在小鼠急慢性酒精模型中受影响最小。

图3

炎症组分和Il-1β在抗生素净化后皮质中的含量增加。一ELISA法检测血清IL-1β。b条炎症组分的皮层表达Nlrp3号机组,抗坏血酸、和案例1以及细胞因子Il-1β和伊尔-18从配对喂养（PF）或酒精喂养（EtOH）小鼠的大脑中测量，无论是否进行日常抗生素治疗（Abx）。数据为平均值±SEM，n个 = 5-10只小鼠/组*第页 < 0.05

肠道净化改变皮层和海马小胶质细胞

为了描述急性-慢性酒精模型对中枢神经系统的影响，我们接下来检查了小胶质细胞的激活。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，能够表达促炎细胞因子，以应对诸如酒精之类的侮辱[34]. 活化的小胶质细胞的特征是细胞形态改变，呈变形虫形状，胞体增大，外周突起缩短[35]. 我们使用免疫组织化学方法鉴定IBA1阳性小胶质细胞（图4a、b). 测量所有治疗组皮质和海马小胶质细胞的胞体大小和胞体外细胞延伸长度，并将其归一化为PF小鼠。在皮层中没有观察到躯体大小的显著差异（图4c类). 对海马的亚区，如CA1、CA3和齿状回（DG）区域的研究表明，酒精只会增加CA3区小胶质细胞的胞体面积。与同时使用抗生素治疗的PF对照组相比，EtOH-fed小鼠CA3小胶质细胞的胞体面积没有变化（图第4天). 重要的是，我们发现与成对喂食的小鼠相比，酒精减少了大脑皮层的总加工长度（图第四版)与小胶质细胞活化的浓缩细胞形态特征一致[35]. 抗生素治疗消除了酒精诱导的皮质小胶质细胞突起长度的缩短。与配对喂养的对照组相比，在所有研究区域，酒精喂养小鼠的海马小胶质细胞突起长度均显著缩短，并且与大脑皮层一样，抗生素治疗消除了这种形态学变化（图第4页). 与两个治疗组的PF小鼠相比，EtOH-fed小鼠皮层中的小胶质细胞数量没有改变，尽管与未治疗的PF鼠相比，PF小鼠的抗生素治疗适度减少了皮层小胶质细胞的数量（图4克). 海马体中的小胶质细胞数量没有变化（图4小时).

图4

抗生素治疗可防止酒精诱导的皮层和海马小胶质细胞形态学改变。一采用免疫组织化学方法对喂食（PF）或酒精喂养（EtOH）小鼠大脑皮层的小胶质细胞进行IBA1染色，并放大40倍观察。插图中具有代表性的小胶质细胞如所示b条.c（c）–d日对于皮层和海马体，通过追踪细胞体的周长并计算面积来测量小胶质细胞体的面积。e（电子）–（f）皮层和海马小胶质细胞的细胞过程长度是通过将胞体到其远端终止的所有延伸的长度相加来测量的，并将其标准化为各自的PF对照。大脑皮层中IBA1阳性染色小胶质细胞定量(克)和海马(小时). 数据为平均值±SEM，n个 = 3只小鼠/组和5-9张图像/区域*第页 < 0.05

服用抗生素可减弱酒精诱导的小肠细胞因子表达

我们在大脑中观察到的酒精诱导的变化可能是由于肠道屏障的完整性丧失所致。先前的研究表明，肠道细胞因子的表达会降低肠道屏障的完整性，并可能使病原相关分子从肠腔泄漏到体循环中[36]. 因此，我们测量了各种促炎细胞因子在肠道的表达，发现与热量匹配的配对喂养小鼠相比，急慢性酒精摄入后，它们的表达增加（图5a级). 的表达式Tnfα,Mcp1基因、和嗯1饮酒后小肠中的mRNA显著增加，并且伊尔-17和伊利-23EtOH小鼠的表达也呈增加趋势。使用抗生素鸡尾酒治疗可减少肠道中的细菌负荷（图1)并导致酒精诱导的Mcp1基因和嗯1mRNA水平。抗生素治疗降低了炎症细胞因子的基线表达，包括Tnfα,伊尔-17、和伊利-23PF小鼠与未经治疗的PF小鼠的比较（图5a级). 有趣的是，即使使用抗生素治疗，饮酒仍会增加Tnfα,伊尔-17、和伊利-23在抗生素治疗的酒精喂养小鼠的小肠中，与抗生素处理的配对喂养小鼠进行比较（图5a级).

图5

酒精引起的小肠炎症随着肠道细菌负荷的减少而减少。一促炎细胞因子的表达Tnfα,Mcp1基因,嗯1,伊尔-17、和伊利-23从具有或不具有每日抗生素治疗（Abx）的成对喂养（PF）或酒精喂养（EtOH）小鼠的小肠中测量。b条炎症小体成分的表达Nlrp3号机组,抗坏血酸、和案例1以及细胞因子Il-1β和伊尔-18用qPCR检测。数据为平均值±SEM，n个 = 5-10只小鼠/组*第页 < 0.05

最近的研究强调了肠道微生物组和炎症小体之间的重要联系[37]尤其是NLRP3炎症组[38]. 因此，我们研究了肠道抗生素去污是否会影响小肠炎症组分的表达。酒精诱导表达Il-1β,Nlrp3号机组、和抗坏血酸与双馈控制相比（图5亿). 抗生素治疗消除了酒精诱导的Il-1β,Nlrp3号机组、和抗坏血酸，抗生素也增加了配对喂养小鼠的基线表达Il-1β,伊尔-18,抗坏血酸、和案例1（图5亿).

讨论

在这项研究中，我们表明，急性和慢性酒精摄入会导致中枢神经系统和小肠炎症，而使用抗生素减少肠道微生物负荷可以防止酒精诱导的神经炎症。口服抗生素的混合物显著降低了肠道细菌负荷和循环内毒素水平。在口服抗生素治疗的小鼠中，酒精诱导的神经炎症，包括小胶质细胞形态变化和促炎基因表达，显著减弱，为饮酒时肠道细菌负荷和肠脑轴中PAMP的重要性提供了新的证据。我们还描述了饮酒后小肠中促炎细胞因子表达增加，而经胃内抗生素治疗可显著减少肠道中的细菌负荷。有趣的是，肠道微生物组的减少与CNS和肠道中炎性体成分的表达增加有关。

此前，我们已经证明，在急性-慢性酒精模型中，抗生素治疗可以保护肝脏免受酒精诱导的炎症（包括细胞因子表达）、免疫细胞浸润和脂肪变性的影响[23]. 在本研究中，我们发现了小鼠急性和慢性酒精给药后小胶质细胞活化的证据。在EtOH小鼠中，CNS前炎症细胞因子表达增加，平均细胞进程长度减少，表明小胶质细胞激活。活化的小胶质细胞呈现变形虫样形态，突起长度缩短，通常胞体增大[35]. Acute-on-chronic酒精减少了皮层和海马的细胞进程长度，并显著增加了海马部分的胞体大小。有趣的是，尽管急性或慢性酒精诱导的炎症细胞因子在中枢神经系统中表达，但酒精喂养并没有增加循环中TNFα、IL-6和IL-1β的水平。这表明酒精诱导的神经炎症可能独立于全身炎症而发生，尽管需要进一步研究其他外周信号以排除循环因素的影响。

与肝脏中的观察结果相似[23]抗生素肠道净化保护CNS免受致炎基因表达和常驻巨噬细胞群变化的影响。有趣的是，无菌小鼠对酒精诱导的肝损伤的保护作用与我们之前描述的抗生素去污法不同[39]. 对这些不同观察结果的一个可能解释是，一些基线细菌负荷和/或发育过程中的细菌存在对于酒精诱导的免疫系统反应以及器官特异性免疫至关重要。事实上，以前的研究已经强调了抗生素治疗在发育过程中影响适应性免疫细胞功能的作用[40]. 尽管多项研究表明，小鼠和大鼠长期长期饮酒后会导致酒精诱导的神经炎症，但在此，我们表明，10天的酒精喂养和急性狂饮也会导致酒精相关的神经炎症。此外，这种NIAAA酒精给药模型会导致大脑、小肠和肝脏常见的炎症终末器官效应。

我们的数据与之前研究TLR4信号在酒精相关器官病理学中的作用一致。虽然有人认为酒精可能直接与TLR4相互作用或影响TLR4信号转导所需的脂质膜相互作用[41,42]，TLR4还识别内源性（包括HMGB1）[17,18]和外源性（即细菌成分，如LPS）[19]危险信号。研究表明，TLR4敲除和敲除小鼠可以免受肝脏中酒精暴露引起的许多炎症相关后遗症的影响[43]在大脑中[14,15,16]. 我们没有将重点放在TLR4及其信号通路上，而是使用抗生素来减少细菌脂多糖（TLR4的主要配体之一），并揭示了从肠道到大脑的组织炎症的类似减少。我们的研究为理解慢性酒精暴露后体内多灶性病理学相关的肠-脑轴提供了重要证据。

剩下的一个重要问题是肠道细菌或其产物是否是器官损伤的主要原因。脂多糖与器官炎症之间可能存在直接联系；在各种酒精管理设置中，记录了活的或死的细菌或细菌衍生产品泄漏到全身循环中[1,2,44,45]. 这些细菌信号可能直接导致肠道和大脑的炎症以及相关的器官损伤。虽然脂多糖没有在显著水平上穿过血脑屏障[20]，它可能与相邻的脑血管细胞相互作用，通过屏障传递免疫信号。酒精模型和人类患者血脑屏障破坏的证据为脂多糖诱导神经炎症的可能直接机制提供了另一种解释[46]. 或者，肠道衍生信号，如LPS、细菌代谢物或其他未描述的肠道信号，可能会导致全身反应。这种反应可能包括肝脏或循环中的炎症细胞因子或激活的免疫细胞，然后在中枢神经系统和身体其他部位诱发器官特异性炎症。在本研究中，我们没有检测到酒精诱导的循环TNFα、IL-6或IL-1β增加，这表明在没有系统细胞因子增加的情况下，酒精可以诱导酒精诱导的神经炎症。开发模型以研究可能导致神经炎症的中枢神经系统外周信号，将是进一步研究解释饮酒后机体间交流的关键领域。

我们的数据支持了先前的研究，这些研究表明酒精可以诱导肠道炎症信号。这种炎症可能是肠屏障完整性破坏以及随后与酒精相关的细菌产物泄漏到循环中的关键因素。Al-Sadi等人利用体外和体内模型表明，促炎细胞因子能够减少紧密连接和肠道屏障的完整性，导致胃肠道的破裂和分子移位[47,48,49]. 酒精导致肠屏障完整性丧失的其他机制也已被探索，包括细菌失调[50,51]，管腔内稳态[45,52]，肠细胞细胞应激和结构蛋白失调[53]. 此外，促炎基因表达与肠道屏障功能障碍之间的关系似乎至关重要[36,54]我们的数据进一步强调了酒精和肠道细菌在调节肠道细胞因子水平方面的作用。

结论

我们的研究首次表明，急慢性酒精可诱导神经炎症和小肠促炎细胞因子的表达。口服抗生素减少肠道细菌负荷可保护小鼠免受中枢神经系统和小肠中促炎细胞因子的表达，并突出了饮酒后肠道微生物组与肠-脑轴之间的关键联系。