用两种不同方法从混合培养物中分离原代大鼠小胶质细胞的特性

摘要

背景

小胶质细胞培养是研究几乎所有中枢神经系统疾病炎症机制的一个至关重要的模型系统。轻度胰蛋白酶化和摇晃是从混合胶质培养物中分离原代小胶质细胞最常用的两种方法。在本研究中，我们对使用这两种方法获得的小胶质细胞进行了表征和比较。

方法

从1-2天龄新生Sprague-Dawley大鼠的大脑皮层制备原代大鼠小胶质细胞培养物。在体外约14天达到融合后，通过轻度胰蛋白酶化或摇晃从混合胶质培养物中分离出小胶质细胞。流式细胞术检测小胶质细胞纯度。定量实时PCR检测mRNA表达。使用ELISA试剂盒测量细胞培养上清液中的TNFα、IL-1β、IL-10和IGF-1。使用荧光标记法评估吞噬功能大肠杆菌K-12生物颗粒。

结果

温和的胰蛋白酶化比摇动产生更高的产率和纯度。轻度胰蛋白酶化分离的小胶质细胞呈静态分支形态。通过摇晃分离的小胶质细胞显示出更为异质的形态，包括圆形细胞，暗示着活化。与摇晃相比，胰蛋白酶分离的小胶质细胞基线表型标记物（iNOS、CD86、CD206和精氨酸酶1）较低，细胞因子（TNFα、IL-1β、IL-10和IGF-1）水平较低，吞噬能力降低。这两种方法都能产生对各种刺激如IL-4、脂多糖（LPS）或干扰素-γ（IFNγ）有反应的小胶质细胞。虽然基因表达和细胞因子释放的刺激模式大体相似，但在绝对反应方面也存在显著差异。与摇晃相比，LPS处理诱导轻度胰蛋白酶化分离的小胶质细胞中TNFα和IL-10水平显著升高。与摇晃相比，IFNγ在轻度胰蛋白酶化的小胶质细胞中诱导了较低的TNFα反应。

结论

我们的结果表明，用摇动法分离小胶质细胞，即使在基线时也可能会引起轻微的激活，这可能会影响后续实验中的刺激反应。在为原代小胶质细胞培养选择分离方案时，应谨慎和注意。

背景

小胶质细胞是大脑的常驻免疫细胞，不断监测微环境并对任何病理变化作出反应。小胶质细胞的一个显著特征是其高度动态的特性[1]. 小胶质细胞可被大量刺激激活，并改变其形态、细胞因子/趋化因子表达谱和功能。根据刺激和环境，活化的小胶质细胞表现出一系列表型和功能多样性，从所谓的经典活化（类M1）到交替活化（M2a、M2b和M2c）[2,三,4,5,6,7,8,9]. M1样小胶质细胞促进各种促炎细胞因子的释放，从而诱导旁观者组织损伤[9,10,11,12,13,14,15]. 相反，M2样巨噬细胞可积极促进组织重塑和修复[9,12,13,14,15,16,17].

原代小胶质细胞培养物是一种有用的体外工具，可用于探索中枢神经系统（CNS）疾病的广泛炎症机制，并研究可能针对小胶质细胞的治疗策略。在体外，通过将细胞暴露于脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFNγ）可获得M1样表型，而白细胞介素（IL）-4和IL-13通常用于诱导M2样表型[18]. 然而，有很多方法可以制备原代小胶质细胞，因此需要谨慎，因为这些高反应性细胞在不同的分离条件下可能会有不同的反应。在本研究中，我们使用两种常用方法（摇晃法和轻度胰蛋白酶法）从大鼠脑中分离出小胶质细胞，并评估和比较了它们在基线和刺激条件下的形态、基因表达谱和细胞因子释放。

方法

试剂

用于细胞培养的DMEM/F12、0.25%胰蛋白酶-EDTA和胎牛血清（FBS）来自Gibco。

抗Iba-1和Alexa Fluor 555结合二级抗体的一级抗体分别来自Abcam和Molecular Probe。用于流式细胞术检测的CD11b、CD45和CD68抗体分别从BD、eBioscience和Bio-Read购买，并按照制造商的说明进行稀释。重组大鼠IL-4来自Amsbio。LPS来自Sigma-Aldrich。重组大鼠IFNγ来自R&D。使用无菌ddH制备IL-4、LPS和IFNγ储备溶液₂O、 和ddH₂O用作对照。

大鼠原代小胶质细胞培养

2006年至2016年，PubMed使用术语“小胶质细胞和（大鼠或小鼠）以及原代和培养物未审查[出版类型]”进行了搜索。这项搜索产生了392篇文章。125篇文章被排除在外（81篇未使用小胶质细胞培养，25篇使用细胞系，19篇无法全文访问），导致267篇文章使用啮齿动物小胶质细胞原代培养。对文献的快速调查表明，纯化小胶质细胞最常用的两种方法包括摇动法和轻度胰蛋白酶化法（204种使用摇动法，其中26种使用温和胰蛋白酶化）（图1). 基于这一初步分析，我们比较了摇动法和胰蛋白酶法获得的小胶质细胞。从1-2天龄新生Sprague-Dawley大鼠的大脑皮层制备原代大鼠小胶质细胞培养物。去除脑膜后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37°C下消化皮层组织30分钟，然后用10%胎牛血清在DMEM/F12中进行机械研磨。将混合的皮层细胞通过70μm尼龙网细胞过滤器，并用含有10%FBS的DMEM/F12在无涂层塑料皿或板上进行电镀，每3-4天彻底更换培养基。在体外约14天达到融合后，通过温和的胰蛋白酶作用（酶，E）或摇动（S）从混合的神经胶质培养物中分离小胶质细胞。根据上述方法进行轻度胰蛋白酶化[19,20]. 将混合胶质细胞培养物与胰蛋白酶溶液（0.25%胰蛋白酶-EDTA在DMEM/F12中以1:4的比例稀释）培养15–25分钟，导致完整的细胞层在一片中脱落。小胶质细胞仍然附着在井底。对于振动法[21,22]将融合的混合胶质细胞培养物置于220rpm的摇床上1h。收集含有分离的小胶质细胞的上清液，并重新培养1小时，以允许小胶质附着。1小时后，去除非粘附细胞。从两种方法中分离出的小胶质细胞在治疗前可以休息一夜。为了比较产量，我们将新生幼崽大脑中的细胞接种到一个6孔板中。产量以每个培养场的细胞数计算（每个培养场放大×200倍的六个随机场，n个 = 5种培养基）。细胞在4%多聚甲醛中固定30分钟，用5%正常马血清封闭1小时，并在4°C下与抗Iba-1（1:100）的一级抗体孵育过夜。清洗后，在室温下用Alexa Fluor 555结合二级抗体（1:200）培养细胞1小时。阴性对照组在没有初级抗体的情况下孵育，在这些对照组中未观察到免疫反应。

图1

通过使用术语“小胶质细胞AND（大鼠或小鼠）AND primary AND culture NOT review[出版类型]”搜索PubMed，可用于初级啮齿动物小胶质细胞培养的各种方法的比例

流式细胞术

通过流式细胞术评估轻度胰蛋白酶化或摇动获得的小胶质细胞的纯度。收集细胞并在4°C下用识别抗原（CD11b、CD45和CD68）的荧光结合单克隆抗体标记15分钟。标记后，将细胞在PBS中清洗两次，并以最终400μl的体积再次悬浮。在BD-LSDII上进行流式细胞术，并使用FlowJo软件分析数据。

实时PCR

定量实时PCR检测mRNA表达。用IL-4（20 ng/ml）、LPS（50 ng/ml。使用miRNeasy试剂盒（Qiagen）从原代培养的小胶质细胞中提取总RNA，并对其进行处理或不进行处理。使用M-MLV逆转录酶（Invitrogen）将100纳克总RNA逆转录成cDNA。使用基因特异性TaqMan基因表达分析（ABI 7500HT，Applied Biosystems）测量诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、CD86、CD206、精氨酸酶1、CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）、toll样受体2（TLR2）和C-C趋化素受体2（CCR2）的定量表达。通过从检测基因的Ct值中减去β2-微球蛋白（B2M）的Ct价值来计算相对基线基因水平。使用2^-ΔΔCt所有实时PCR均进行三次。所有实验均独立重复三到六次。激活的小胶质细胞包括各种状态的光谱。我们选择的代表性基因，包括iNOS、CD86、CD206、精氨酸酶1、CX3CR1、TLR2和CCR2，与小胶质细胞的不同激活状态密切相关。为了比较培养的小胶质细胞的“平均指纹”，使用双向方差分析对定量数据进行分析(第页 < 显著性为0.05，SPSS 21）。

酶联免疫吸附试验

用IL-4（20 ng/ml）、LPS（50 ng/ml。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒测量细胞培养上清液中的肿瘤坏死因子α（TNFα）（eBioscience）、IL-1β（R&D）、IL-10（eBioscience。

小胶质细胞吞噬功能测定

为了评估吞噬作用，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化培养在6孔板中的小胶质细胞，并将其重新置于浓度为3.0×10的96孔板中⁴细胞/孔。然后，用荧光标记的细胞孵育大肠杆菌K-12生物颗粒（Invitrogen）在37°C下放置2小时。用0.25 mg/ml台盼蓝冲洗细胞，以熄灭细胞外荧光。使用荧光微孔板阅读器装置读取细胞内荧光，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。每个条件下重复五次，重复四次。

统计分析

数据表示为平均值±SE。进行了三到六个单独的实验。实时PCR数据采用双向方差分析进行分析。采用单因素方差分析法分析ELISA测定不同处理后细胞因子释放的数据。其他数据使用t吨在两种隔离方法之间进行测试。统计显著性设置为第页 < 0.05.

结果

形态、产量和纯度

相位对比显微镜显示了使用两种不同方法分离的小胶质细胞的不同形态。轻度胰蛋白酶化分离的小胶质细胞具有均匀的分支形态，突起短，胞体小（图2a个). 摇晃法分离的小胶质细胞形态更为异质。大多数细胞呈圆形，胞体增大，突起减少（图2亿). 两种方法的细胞均为Iba-1阳性（图2厘米,d日). 轻度胰蛋白酶化法（76.18±13.08个细胞/场）培养小胶质细胞的产量高于摇动法（54.27±9.19个细胞/场地）(第页 = 0.015,t吨测试）（图第二版).

图2

轻度胰蛋白酶化法获得的原代培养小胶质细胞的形态、产量和纯度(E类)或摇晃(S公司).一,b条轻度胰蛋白酶化法分离的原发性小胶质细胞的形态学(一)或摇晃(b条).比例尺 = 50微米。c（c）,d日轻度胰蛋白酶法分离的原发性小胶质细胞的Iba-1免疫染色(c（c）)或摇晃(d日).比例尺 = 50微米。e（电子）小胶质细胞培养物的产量。n个 = 5（f）–小时轻度胰蛋白酶化法分离的原发性小胶质细胞大小(（f）)或摇晃(克).n个 = 5我–n个轻度胰蛋白酶法分离的原代小胶质细胞的纯度(我,我)或摇晃(j个,米)用CD11b流式细胞术测定(我–k个)或CD45(我–n个)染色。n个 = 5. *第页 < 0.05

除形态学外，两种方法获得的小胶质细胞大小也不同。用流式细胞术前向散射法（FSC）测量，摇晃法分离的小胶质细胞的平均大小是轻度胰蛋白酶法分离的大1.17倍(第页 = 0.030,t吨测试）（图第2页–小时). 用流式细胞术检测培养的小胶质细胞的纯度，CD11b和CD45染色。CD11b阳性细胞的比例（图第2页–k个)和CD45阳性细胞（图2升–n个)轻度胰蛋白酶组（93.68±2.54%和94.92±3.64%）显著高于摇晃组（82.9±7.61%和88.08±3.32%）(第页 = CD11b为0.028，第页 = CD45为0.024，t吨测试）。

基线基因表达、细胞因子产生和吞噬功能

由于两种制备方法中小胶质细胞的形态不同，我们接下来询问这些细胞是否也表现出不同的表型。对一组具有代表性的基因进行了检测，以评估各种激活状态——iNOS、CD86、CD206、精氨酸酶1、CX3CR1、TLR2和CCR2。摇晃法和轻度胰蛋白酶法获得的小胶质细胞中，这些选定基因的基线表达存在显著差异(第页 = 方法、基因和方法*基因分别为0.003、0.000和0.036，双向方差分析）（图3a年).

图3

轻度胰蛋白酶化分离的原代培养小胶质细胞的基因表达、细胞因子释放和吞噬作用的基线水平(E类)或摇晃(S公司).一基因表达的基线水平。n个 = 3–6.b条小胶质细胞条件培养基中TNFα、IL-1β、IL-10和IGF-1的基线水平。n个 = 4c（c）–e（电子）流式细胞术显示轻度胰蛋白酶化分离的原代小胶质细胞CD68阳性细胞(c（c）)或摇晃(d日).n个 = 5（f）–小时轻度胰蛋白酶化法分离的原发性小胶质细胞吞噬作用(（f）)或摇晃(克).n个 = 4. *第页 < 0.05

已知小胶质细胞通过释放细胞外信号影响邻近细胞。因此，我们使用ELISA评估关键细胞因子（TNFα、IL-1β和IL-10）和主要小胶质细胞生长因子IGF-1（图3亿). IL-1β的基线水平(第页 = 0.122,t吨测试）和IGF-1(第页 = 0.032,t吨试验）在通过摇动分离的培养的小胶质细胞的条件培养基中比轻度胰蛋白酶作用高约2倍。IL-10的差异甚至更大（9倍，第页 = 0.048,t吨试验）和TNFα（24倍，第页 = 0.020,t吨试验），与轻度胰蛋白酶化相比，摇晃法分离的小胶质细胞中的水平明显更高。

总的来说，这些基因表达和细胞因子释放的差异表明，与轻度胰蛋白酶化分离的小胶质细胞相比，摇晃分离的小神经胶质细胞可能“更活跃”。CD68被认为是活化小胶质细胞的一般标志物。流式细胞术显示，摇瓶法分离的小胶质细胞中CD68阳性细胞百分比（39.14±6.94%）略高于轻度胰蛋白酶法（31.58±7.80%），但两种方法之间无显著差异(第页 = 0.185,t吨测试）（图3立方厘米–e（电子）). 然而，一项体外试验表明，与轻度胰蛋白酶消化相比，摇晃使小胶质细胞的吞噬能力显著增强约2.5倍(第页 = 0.018,t吨测试）（图第3页–小时).

对刺激的比较反应

接下来，我们测试了通过这两种方法分离的小胶质细胞对三种典型刺激的反应，这三种典型刺激通常用于将小胶质细胞激活为不同的表型，即IL-4、LPS和IFNγ。用IL-4治疗后（图4a类)或LPS（图4b个)在8小时内，基因表达反应模式（iNOS、CD86、CD206、精氨酸酶1、CX3CR1、TLR2和CCR2）似乎大体相似（对于IL-4治疗，第页 = 方法、基因和方法*基因分别为0.881、0.000和0.408；用于LPS治疗，第页 = 方法、基因和方法*基因分别为0.962、0.000和0.430，双向方差分析）。例如，IL-4和LPS治疗都降低了CX3CR1的表达。IL-4治疗上调M2样表型标记CD206的表达，而LPS治疗上调M1样表型标志iNOS的表达，下调CD206。8小时干扰素γ治疗的反应略有不同，但总体模式相似(第页 = 方法、基因和方法*基因分别为0.333、0.023和0.916，双向方差分析）。IFNγ增加了iNOS的表达水平，降低了摇瓶组和胰蛋白酶组小胶质细胞中CD206的水平（图4c类). 与这些基因表达结果一致，在不同的治疗24小时后，两组的形态学变化也大致相同（20 ng/ml IL-4、50 ng/ml LPS或20 ng/ml IFNγ）（图5a级–小时).

图4

轻度胰蛋白酶化原代培养小胶质细胞基因表达的变化(E类)或摇晃(S公司)用20 ng/ml的IL-4治疗后(一)，50 ng/ml LPS(b条)，或20 ng/ml干扰素γ(c（c）)持续8小时。n个 = 3–6

图5

形态变化(一–小时)和细胞因子释放(我–我)轻度胰蛋白酶化法分离的原代培养小胶质细胞(E类)或摇晃(S公司)用20 ng/ml IL-4、50 ng/ml LPS或20 ng/ml IFNγ治疗24小时后。n个 = 4比例尺 = 50微米。米–o个轻度胰蛋白酶化法分离的原代培养小胶质细胞释放细胞因子数据的再分析(E类)或摇晃(S公司)用20 ng/ml的IL-4治疗后(米)，50 ng/ml LPS(n个)，或20 ng/ml干扰素γ(o个)持续24小时。数据显示为与对照组相比的折叠变化*第页 < 0.05; **第页 < 0.01

为了进行进一步的比较，收集经IL-4、LPS或IFNγ刺激处理24小时后的条件培养基，以测量分泌细胞因子和生长因子的水平。与上述基线数据一致，与胰蛋白酶化法相比，摇晃法分离的小胶质细胞条件培养液中预先刺激的TNFα、IL-1β、IL-10和IGF-1水平显著升高。用IL-4、LPS或IFNγ刺激可诱导不同的反应（图第5页–我，单向方差分析）。LPS显著影响TNFα、IL-1β和IL-10。IL-4显著增加IGF-1的生成，但对IL-10、TNFα和IL-1β无影响。干扰素γ的影响很小。两种方法分离的小胶质细胞的反应方向（增加或减少）基本相似（图第5页–我). 例如，在轻度胰蛋白酶化或摇晃分离的小胶质细胞中，IL-4治疗增加IGF-1的释放，LPS治疗增加TNFα和IL-1β的生成。然而，在某些情况下，回应程度存在一些关键差异。为了评估响应程度的差异，我们重新计算了图中折叠变化与控制的数据500万–o个与基线释放相比，LPS治疗诱导轻度胰蛋白酶消化法获得的小胶质细胞中TNFα和IL-10水平显著高于摇动法（图5个). 对于IFNγ刺激，使用摇晃法分离的小胶质细胞中TNFα的释放显著增加，而使用轻度胰蛋白酶化法分离的大胶质细胞中则没有（图5个).

讨论

小胶质细胞在发育、健康和疾病中充当中枢神经系统稳态的关键传感器、效应器和调节器[23,24,25]. 即使在健康的大脑中，小胶质细胞也不是功能上沉默的细胞。它们是高度活跃、伸展和收缩的运动过程，通过这些过程，它们可以观察其微环境并与周围细胞动态互动[24,26,27,28]. 现在积累的知识表明，小胶质细胞的多因素作用远远超出了其在免疫中的传统作用[29]. 小胶质细胞在中枢神经系统发育和成人大脑中清除凋亡神经元[30,31,32,33,34]. 小胶质细胞在胚胎发育和成年期调节神经发生并促进布线[35,36,37,38]. 小胶质细胞参与大脑中的突触修剪和重塑[39,40,41,42]. 对中枢神经系统的任何损伤，包括感染、创伤或代谢功能障碍，都会导致小胶质细胞活化。激活后，小胶质细胞发生形态和功能变化[2,43]. 小胶质细胞可以产生多种介质，包括细胞因子（促炎和抗炎）、趋化因子、生长因子和神经营养因子。小胶质细胞也可以吞噬并产生活性氧和氮物种。因此，对小胶质细胞机制的研究对于广泛的神经科学来说至关重要。

原代培养物是研究小胶质细胞的重要体外工具。有许多方案可用于培养新生啮齿动物大脑的初级小胶质细胞。历史上，啮齿动物的小胶质细胞是用摇晃法分离出来的[21,22]. 2003年，引入了另一种涉及轻度胰蛋白酶化的方法[19]. 尽管已经证明了一些新方法可以从出生后和成年大脑中高效分离小胶质细胞[44,45]，摇晃仍然是迄今为止最常用的方法（见图1). 由于小胶质细胞是高度敏感和反应性细胞，不同的制备方案可能会导致小胶质细胞的表型略有不同，这反过来可能会影响实验结果。因此，本研究的目的是直接比较使用这两种方法分离的小胶质细胞的关键特征。与摇瓶法相比，温和胰蛋白酶法从混合培养的胶质细胞中分离小胶质细胞可获得更高的产量和纯度。更重要的是，即使在正常情况下，摇晃法也会轻微激活小胶质细胞。小胶质细胞的活化不是一价或二价的。经典活化（类M1）到交替活化（类M2）的概念来源于对巨噬细胞的研究。小胶质细胞与其他组织中的巨噬细胞的区别在于它们的细胞特异性基因表达特征、不同的个体发育和不同的功能[23,46,47,48]. 根据刺激和环境，激活的小胶质细胞表现出广泛的表型和功能多样性，而不仅仅是M1或M2类。所谓的M1或M2样标记也并非总是绝对局限于一个小胶质细胞表型。摇瓶分离的小胶质细胞呈“阿米巴样”形态。与轻度胰蛋白酶化相比，摇晃分离的小胶质细胞中小胶质细胞活化标记物（iNOS、CD86、CD206和精氨酸酶1）的基线表达和细胞因子（TNFα、IL-1β、IL-10和IGF-1）的基准释放显著高于轻度胰蛋白酶解。与轻度胰蛋白酶化分离的小胶质细胞相比，摇动分离的小神经胶质细胞也表现出更强的吞噬作用。这些发现进一步证实，原代培养的小胶质细胞对刺激极为敏感，其反应有时依赖于分离方案。因此，在选择方法和解释数据时可能需要谨慎。对于关注基线小胶质生理学的研究，最好选择尽量减少无意激活的方法。当用重组蛋白进行探测来研究途径时，特别是当纯度较低且重组蛋白中内毒素水平较高时，也必须注意。

在我们的研究中，我们记录了通过这两种方法获得的小胶质细胞中的基因表达（iNOS、CD86、CD206、精氨酸酶1、CX3CR1、TLR2和CCR2）和细胞因子释放（TNFα、IL-1β、IL-10和IGF-1）的变化，以响应可能诱导M1样（LPS或IFNγ）或M2样（IL-4）表型的各种典型刺激。通过温和的胰蛋白酶消化或摇动获得的小胶质细胞具有完全的功能，并且通常对不同的处理产生预期的反应。然而，在某些情况下，回应的程度似乎有所不同。尽管这两种方法在体外评估小胶质细胞的功能反应是可行的，但如果反应程度对特定研究至关重要，则可能会得出相反的结论。例如，要评估激活的小胶质细胞的有益或有害影响，激活的小神经胶质细胞释放的TNFα水平可能是一个关键。不同浓度的TNFα具有不同的受体选择性[49]. 较高水平的TNFα可能导致神经元死亡并增加谷氨酸的释放，但较低水平的TNF-α可能不会[50,51]. 在这种情况下，通过摇动或胰蛋白酶化分离的小胶质细胞中TNFα对LPS或IL-4刺激的不同反应可能会影响结果和结论。

这里有一些警告。首先，培养细胞的纯度是影响实验结果的关键因素之一。不幸的是，几乎不可能在任何原代培养中获得100%纯细胞。在我们的初级小胶质细胞培养中，可能存在其他类型的脑细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。然而，纯度的差异可能不是本研究中不同炎症反应或基线免疫介质表达的主要原因，因为我们测量的基因和细胞因子主要由小胶质细胞表达，而不是神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。实际上，使用温和胰蛋白酶培养小胶质细胞的一个潜在优势可能是因为这种方法提供了大约95%的纯小胶质细胞。然而，如果这些培养物进一步传代，其他细胞可能仍然存在，各种细胞类型的比例可能会改变。这是一个重要的警告。其次，摇晃的速度和持续时间可能对通过摇晃分离的小胶质细胞的特性产生重要影响。从混合培养物中分离小胶质细胞的振荡速度和持续时间在文献中是可变的。在本研究中，我们使用了实验室中常用的摇晃速度和持续时间。与文献相比，220 rpm是一种常用的速度[52,53]. 第三，由于小胶质细胞对哪怕是微小的刺激都非常敏感，如果小胶质细胞从混合培养物中分离出来后能够恢复更长时间，例如48小时而不是过夜，那么小胶质细胞的表型可能会发生改变。未来的研究将有助于评估摇晃法之后的各个时间点。第四，尽管我们在本研究中表明，温和胰蛋白酶法的产率高于摇动法，但我们承认，我们不知道是什么导致了两种方法的产率差异。我们将一个新生儿大脑中的细胞放入一个6孔板中，以确保两种方法的初始培养条件相同。在拍摄照片以比较产量之前，我们用摇动或温和胰蛋白酶法从混合培养物中分离小胶质细胞后，再培养24小时。然而，小胶质细胞对酶和机械操作反应机制的潜在差异仍有待阐明。

最近，其他研究也提出了摇晃法可能会无意中激活小胶质细胞的可能性，免疫磁珠法被提议作为体外分离的替代方法[52,54,55]. 在这里，我们表明，温和的胰蛋白酶化方法产生了与磁性微球法类似的纯度。本研究中使用的温和胰蛋白酶法的纯度约为95%。根据文献，磁性微球法的纯度约为95–97%[52,54,55]. 与磁分选相比，温和的胰蛋白酶化可能更便宜（不需要额外的试剂和设备），也更简单（无需额外的程序）。

结论

总之，轻度胰蛋白酶化可能是从混合胶质培养物中分离小胶质细胞的可靠方法，可以提高产量和纯度，并且通过轻度胰蛋白酶纯化的小胶质细胞可能更接近其“静止”状态。纯化方法影响小胶质细胞的免疫状态，体外研究应慎重考虑培养方法。