加拿大健康女性月经周期阴道微生物群特征

摘要

背景

阴道微生物群落在维持女性健康方面起着至关重要的作用。由于许多细菌成分的多样性和培养困难性，理解准确的细菌成分具有挑战性，因此必须采用非培养方法。在自然月经周期中，生理变化可能会对细菌的生长、定植和群落结构产生影响。本研究的目的是通过使用氯化聚乙烯基于60的微生物群分析。从27名自然循环生育年龄女性的阴道拭子中每周采集一次月经周期。聚合酶链反应（PCR）用于扩增氯化聚乙烯60个基因和产生代表微生物群落的扩增子。扩增子被热测序，组装成可操作的分类学单元，并进行分析。还对样品进行了16S rRNA基因总含量和阴道加德纳菌通过定量PCR，并使用家族和属特异性PCR筛选是否存在软体动物。

结果

总的来说，大多数女性的阴道微生物群在整个月经周期中保持相对稳定，多样性变化不大，物种丰富度波动不大。女性之间的微生物组比从女性个体连续采集的微生物组差异更大。微生物特征的聚类显示，预期的分组主要由crispatus乳杆菌、iners乳杆菌、，和詹森乳杆菌有趣的是，另外两个集群由其中一个主导短双歧杆菌或非乳杆菌的异质混合物。直接阴道毛滴虫数量与火成序列读取丰度密切相关，软体动物包括人型支原体、微小脲原体、，和解脲支原体，在大多数样本中检测到。

结论

我们的氯化聚乙烯对阴道微生物组的60项调查表明，在健康女性中，大多数阴道微生物组在月经周期中保持稳定。对这些发现感兴趣的是双歧杆菌的存在加德内雷拉物种。双歧杆菌在基于16S rRNA基因的研究中经常被低估，其检测方法为氯化聚乙烯基于60人的调查表明，他们在阴道社区中的重要性可能被低估了。

背景

长期以来，人们一直认为下生殖道微生物群落在维持女性生殖健康方面发挥着至关重要的作用[1]. 生育年龄妇女的阴道微生物群传统上以基于文化的技术为特征乳酸杆菌除其他作用外，产生乳酸、生物表面活性剂、过氧化氢和其他为病原菌创造不适宜环境的因素的物种[2–7]. 利用非培养技术进行详细的群落分析表明，“健康”微生物群落通常由crispatus乳杆菌、iners乳杆菌、gasseri乳杆菌、jensenii乳杆菌、，或这些物种的组合，在一小部分女性中，“混合”型乳酸杆菌被耗尽，并由以下细菌组成加德纳菌、普雷沃菌、Atopobium、Megasphaera、，和链球菌[8–14]. 后者挑战了我们对“健康阴道微生物组”的传统理解，并对该群落的结构和功能以及宿主对其的反应提出了疑问。

鉴于宿主生态系统中与月经周期、性接触以及皮肤和外部环境中细菌的引入相关的变异性，阴道微生物组的相对组成稳定性非常显著。特别是，月经周期创造了一个不断变化的阴道环境，排卵、月经和相应的雌激素和孕酮水平波动影响细菌对阴道上皮的附着[15]，宫颈粘液生成[16]pH和氧化还原电位[17]和糖原水平[18]. 在以培养为基础的研究中，微生物群落在周期内的几个时间点表现出特征，这项研究报告了一系列发现，从群落组成没有变化，到月经周期内需氧与厌氧群落的一些变化，以及更大比例的非需氧微生物群落-乳酸杆菌月经期间出现的物种[19–23]. 这种个体间的差异反映在非培养研究中，一些女性在多周期采样过程中保持了一致的微生物群落，其他女性随着月经周期而波动，一些女性无明显原因的随机波动[13,24,25]. 有趣的是，至少在某些情况下，尽管细菌组成有所波动，但预计群落的整体功能特征仍将保持，因为相对优势度的变化可能仅限于不同的乳酸菌种类[13].

迄今为止，我们对阴道微生物群的了解主要是通过基于培养或16S rRNA基因的培养无关研究形成的。尽管这两种方法都提供了丰富的微生物群落组成信息，但它们都有局限性。与细菌培养相关的劳动密集型方法学（对于大型研究来说不切实际）、培养现有生物多样性的能力有限以及准确测定相对丰度的巨大困难，推动了向非培养研究的转变。基于16S rRNA基因的方法克服了培养的一些限制，但已知存在扩增偏差，对某些分类群的分辨率有限[26]. 替代分子靶点，如通用氯化聚乙烯60基因[27]已被用于以一种与培养无关的方式获得微生物群落的不同视角。

与基于16S rRNA基因的研究类似，氯化聚乙烯对阴道微生物群的60项调查揭示了许多主要以乳酸杆菌为主的特征，以及对一些非乳酸菌群（如加德内雷拉和普雷沃菌属[28–31]. 对于阴道微生物组的未来研究，了解月经周期中取样的时间是否会导致显著的变异性非常重要，这必须在人群阴道微生物组横断面研究中加以说明。

本研究的主要目的是通过使用氯化聚乙烯60个基因靶点。其次，我们旨在探索其他高通量测序方法未能很好检测到的软体动物和双歧杆菌，并更好地了解女性个体阴道微生物群的时间稳定性和/或变异性。

方法

参与者和研究设计

这项纵向研究的目的是在一个月经周期内每周从健康女性队列中收集阴道水样。如果女性对英语的理解达到了提供知情同意书所需的水平，年龄至少为18岁，月经周期正常，则有资格参加。如果患者在研究期间怀孕或计划怀孕、患有慢性自身免疫或炎症疾病、有宫内节育器，则被排除在外就地，使用激素类避孕药，或在登记后4周内正在服用或已经服用抗菌药物（例如抗生素或抗真菌治疗）。本研究获得了不列颠哥伦比亚大学机构审查委员会的伦理批准（证书编号H09-00860）。样本量基于之前对阴道微生物组的纵向研究，其中7至49名受试者为微生物组研究提供了足够的数量[13,25,32–34].

数据和样本收集

健康的育龄妇女从两组参与人乳头瘤病毒（HPV）疫苗第三阶段临床试验的参与者中招募，这是一家私人妇产科诊所，并通过加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市的在线和印刷广告招募。在获得知情同意后，根据病史和临床记录收集基本的人口统计学和临床数据。在进行常规窥镜检查（通常用于子宫颈抹片筛查）时，临床医生使用涤纶拭子（Copan Diagnostics Inc.，Murrieta，CA，USA）对后穹窿和阴道侧壁进行取样。这个样本代表了从图表中收集的四个月经周期样本中的第一个。向所有参与者提供日记，记录包括性活动和任何间歇症状在内的活动。他们还配备了自收集试剂盒，其中包含无菌植绒拭子，手柄上设计有断点（Puritan Medical Products Company LLC，Guilford，ME，USA），收集管包含200μl DNAzol-Direct试剂（MRCGENE，Cincinnati，OH，USA。洗手后，要求女性将拭子插入阴道至手柄的中点，旋转拭子3次，取出拭子并将其放入所提供的收集管中，折断手柄，将拭头留在试剂管中，然后关闭试管并标注日期。

样品在环境温度下保存，直到每1周采集一次所有三个自采集样品。这种自抽样方法与我们自己和同事以前使用的研究方法重复，在这些方法中，我们验证了自抽样与临床医生抽样相比的高质量[35,36].

在采集期结束时，参与者返回了样本，并与研究人员会面，审查了他们的日记并完成了最终采访，作为回报，他们获得了适度的酬金（20加元）。所有样本都被鉴定出来，并通过使用基于日历的方法，使用参与者分配到月经期的信息：月经，第1天（月经开始）到止血（第4-7天）；滤泡，到第12天停止出血；排卵期第13天至第16天；黄体期，第17天至第26天至第32天（开始出血）。如果在黄体期采集两个样品，则按顺序将其编号为黄体-I和黄体-II。在实验室中通过离心从拭子头中分离出含DNAzol的核酸，并直接用作PCR反应的模板。

定量PCR（qPCR）和常规PCR

通过量化人类细胞色素C氧化酶亚基1来评估样品的核酸完整性(考克斯1） 基因和细菌16S rRNA基因（V3区），如前所述[37].阴道加德纳菌用引物定量[38]和SYBR Green分析条件[39]之前已确定。软体动物的存在(支原体或脲原体)通过使用传统的半巢式PCR靶向16S rRNA基因来确定[40]、和脲原体用特异性PCR检测多带抗原基因[41].

cpn60通用靶点（UT）PCR和焦磷酸测序

PCR使用鸡尾酒进行氯化聚乙烯60个UT特异性引物，由引物H279/H280:H1612/H1613摩尔比为1:3的引物组成，如前所述[29,42,43]. 根据制造商的建议（美国康涅狄格州布兰德福德罗氏），在5’端用24个独特的十聚体多路识别（MID）序列中的一个修改引物集。此外，对来自12个样本的软体动物特异性16S rRNA基因PCR产物进行汇总和焦测序。扩增子以等摩尔浓度汇集，以创建文库，用于GS-FLX Titanium平台上的测序。乳化PCR和测序在加拿大萨斯卡通国家研究委员会进行。

操作分类单元（OTU）分析

采用454/Roche的默认钻机程序处理焦深测序数据。使用宏基因组组装（mPUMA）管道对MID分区序列进行微生物图谱处理(http://mpuma.sourceforge.net[44])使用默认设置使用gsAssembler（Roche）生成操作分类单元（OTU）。使用Chaban Chimera Checker（C3）对OTU进行嵌合体筛选和过滤，然后进行人工管理。通过在mPUMA中使用Bowtie 2，基于序列读数到OTU序列的映射来计算OTU丰度。OTU通过注水Blast比较确定[29]到氯化聚乙烯60参考数据库，cpnDB_nr（2013年3月21日下载，网址：网址：http://www.cpndb.ca[45])和具有相同最佳数据库参考的OTU被归为最近的“物种”，而与任何参考序列的同源性小于55%的OTU则被从数据集中删除为非-氯化聚乙烯60序列。原始序列数据文件保存在NCBI简短读取档案（BioProject PRJNA210319）中。处理后序列读取数少于100的样本被删除，剩下来自27名女性的76个样本供分析。

统计方法

我们使用描述性统计检查了研究队列的人口统计学和临床参数。

α和β多样性比较

微生物生态学（QIIME）管道的定量分析[46]利用Bray-Curtis距离矩阵计算Shannon多样性指数、Chao1估计物种数量和jackknifedβ多样性。在这些分析中，使用了分组到最近的“物种”级别的数据，并且在每个样本1000次读取或小于1000次的样本最大读取时，所有多样性测量值都被引导100次。生成了Chao1的稀疏图，以确保每个样本都有足够的采样深度。

样本的α多样性测量值在100个引导数据集中平均，每个样本读取1000次，并在四个月经期（月经期、卵泡期、排卵期和黄体期）之间进行比较通过使用Shannon多样性的线性嵌套混合效应模型和主题内嵌套Chao1的泊松嵌套混合效应模式。后hoc当需要时，使用R中的“multcomp”包进行Tukey比较[47,48].

贝塔多样性（生态距离）计算为每个样本1000次读取时100个引导数据集的平均成对距离。我们通过ANOVA比较受试者内所有样本的生态距离和受试者间所有样本的成对距离来比较受试对象内和受试对象间的生态距离。此外，我们通过ANOVA比较了合并的月经期内的所有配对距离（即所有月经期内、卵泡内、排卵期内和黄体内）和所有相间距离（再次合并）。这些分析没有考虑每个受试者的多个样本，因为它们基于样本之间的成对距离；因此，它们应该被视为是探索性的。

层次聚类

由于自举距离矩阵的平均值不包括读数<1000的样本，我们通过使用R中的纯素包，仅使用代表至少一个样本读数至少1%的分类群，根据每个样本的每个最近邻居“物种”的读数比例生成了另一个Bray-Curtis距离矩阵[49]. 利用该距离矩阵和ward链接实现了层次聚类。通过使用R中“fpc”包中clusterboot函数的平均Jaccard相似性来评估集群的引导支持[50].

如果改用读取数大于1000的所有样本的引导平均值，则聚类结果几乎相同。其他样本有助于形成某些聚类，但不会改变聚类结果的结构。

社区稳定性

除了α多样性的线性混合效应模型，以及女性生态距离内与女性生态距离间的比较外，我们还使用图解法评估了来自同一受试者的样本中微生物群落的“稳定性”。为了探索分类群的相对丰度如何随时间变化，我们使用至少占一个样本10%的分类群为每个女性绘制了分类组成的比例面积图。样本中优势类群比例变化<25%的女性被认为是稳定的。通过这一衡量指标的稳定性，以及作为衡量一名女性是否保持在先前定义的某一组群中或在组群之间切换的稳定性，被测试与BMI（体重不足、正常、超重、肥胖）、先前怀孕、婚姻状况（伴侣与单身）、饮酒、阴道性交、使用避孕套、，以及在研究期间通过Fisher Exact测试使用无味卫生棉条。

阴道加德纳菌序列阅读丰度与qPCR的相关性

每个样品获得的总焦磷酸测序读数的比例对应于阴道毛滴虫（最近的“物种”）与阴道毛滴虫使用Spearman等级相关测试（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国），通过qPCR检测每个样本中的DNA。

结果

研究队列

表中总结了27名研究参与者的人口统计学和临床特征1所有女性在登记时均无阴道感染的迹象或症状。据报道，所有患者的正常月经周期约为28天（范围为26至31天）。大多数女性（81.5%）报告说，她们在一生中的某个时候曾被诊断出阴道感染（例如，酵母性阴道炎、细菌性阴道病（BV））或性传播感染（STI）。只有两名女性（7.4%）报告其一生中被诊断出BV，只有一名女性（3.7%）报告在过去一年内发生过BV。在研究期间，没有一名女性报告使用了冲洗产品。

表1研究参与者的人口统计和临床数据( N个 = 27)

样品完整性评估

为了证实DNAzol样品中存在可扩增核酸，对样品进行了人细胞色素测定C类氧化酶基因和细菌总16S rRNA基因含量。在73份测试样本中，72份（98.6%）检测到人类DNA，而16S rRNA基因总含量在10份以下⁴份数/拭子（33个样本），10⁴到10⁵副本/拭子（31个样本）或10个⁵到10⁶份数/拭子（12个样本）。生成的所有样本中央处理器网络用于焦磷酸测序的60-UT放大器。

微生物组剖面生成

样本收集和处理后，每个女性平均有三个阴道样本（范围为1至4；中位数为3）可用于分析。根据每个样本平均7585个序列读数（范围从125到37419；中位数为4256）确定微生物特征，产生567个独特的OTU。当在最近邻“物种”水平（具有相同最佳参考数据库匹配的OTU）组合时，鉴定出73个细菌“物种”，平均最小识别率为94.0%±7.1%，平均最大识别率为96.6%±5.2%，平均总识别率为95.5%±5.2%参考序列的5.5%。每个样品中确定的最近“物种”的详细摘要在附加文件中提供（参见附加文件1).

为了评估每个样本的序列读取数是否足以代表阴道微生物群，计算了Chao1-估计物种数量的稀疏图。子采样数据稀疏图的图形描述在附加文件中给出（参见附加文件2). 在大多数样本中，Chao1值在整个过程中保持相对一致（图中的平线），这表明当检测每个样本100到1000个序列读数时，样本丰富度没有显著变化。这种一致性表明，大多数群落都是在达到的采样深度时捕获的。

阴道微生物丰富度、多样性和生态距离

Shannon多样性指数提供了物种多样性（丰富度和均匀度）的定量测量，而Chao1估算的物种数量提供了物种丰富度的定量测量。月经期之间无显著差异（线性混合效应模型；似然比检验，P（P） = 1） 在对每个个体的多个样本进行统计后，阴道微生物组样本的平均香农多样性。然而，观察到月经期与Chao1估计物种数量之间存在显著关系（泊松混合效应模型：似然比检验，P（P） = 0.03），带事后（post-hoc）比较表明，卵泡期的物种平均比黄体期多1.3种（经调整P（P） = 0.01），在考虑每个个体的多个样本后。其他月经期比较均无显著差异。在另一份文件中提供了显示每个月经期计算的平均香农多样性指数和Chao1估计物种数量的数字（参见附加文件三).

阴道微生物群落的比较显示，不同女性样本之间的平均生态距离更大（中位数=0.97；范围=0至1），而来自同一女性的样本中的样本（中位数=0.29；范围=0至0.98；图1：方差分析，如果_{1, 2,209} = 133.4; P<0.0001）。在比较月经期之间和月经期内的样本时，没有发现生态距离的明显差异。

图1

阴道微生物组的弯曲距离矩阵的平均Bray-Curtis生态距离。水平线表示中间距离；方框表示四分位范围；晶须延伸至四分位间距的1.5倍；钻石代表手段。

阴道微生物组组成

所有76个样本的层次聚类显示，从100次重采样运行中，有5个聚类的平均Jaccard相似性为0.99、0.85、0.96、0.80、0.78（图中从左到右2). 图中从左到右的簇1、2、3和52)由克氏乳杆菌（来自13名女性的29份样本），詹森氏乳杆菌（5名女性的12份样本），短双歧杆菌（非-加德内雷拉双歧杆菌：来自两名女性的七份样本），以及内陆乳杆菌（来自11名女性的20份样本）。其余集群包含一个异质的优势分类群混合体，包括总括异scardovia omnicolens、长双歧杆菌、无乳链球菌,阴道毛滴虫子群A，和混合放线菌门物种（五名女性的八份样本）。

图2

阴道微生物组谱的最近邻种层次聚类仅包括至少占一个样本1%的最近邻“物种”。色标反映了每个“物种”所代表的总轮廓的比例。根据100次重采样的平均Jaccard相似性，将样本分为五个簇（用数字表示）。顶部的色块表示每个样本的月经期。软体动物-和脲原体-阳性样本由热图下方的黑框表示（灰色框表示样本未经测试）。

在分析中有多个样本的26名女性中，18名女性的阴道轮廓属于同一组，而8名女性在月经周期中属于不同的组。有集群交换机的四名女性（W14、W27、W30和W33）在内陆乳杆菌集群和卷曲乳杆菌集群等乳酸杆菌总体上占主导地位。一名女性（W29）在克氏乳杆菌和詹森氏乳杆菌集群中，一名女性（W23）在三人之间转换乳酸杆菌-优势集群.没有一名女性进入或退出短双歧杆菌-主导集群，而两名女性（W12和W25）从异质集群转变为乳酸杆菌-月经周期中占主导地位的集群（图三).

图3

月经期的阴道微生物群特征。数据表示为每个样本获得的总序列读数的比例，纵坐标的高度对应于100%。采样时间用垂直折线表示，每个样本的月经周期阶段在横坐标上表示（M，月经；F，卵泡；P，排卵期，L-I，黄体I；L-II，黄体II，如文中所定义）。剖面图的安排反映了微生物相对稳定的女性（变化<25%）（A），由相同有机体组成的剖面，但这些有机体的比例随时间波动超过25%（B），在采样时间内发生显著变化的配置文件（C）以及混合比例变化和引入新生物的剖面图（D）样本识别号显示在每个个体的左上角。该图例包括最近的“物种”，它们至少占至少一个样本中读取序列的10%。

聚类和月经期之间似乎没有关系，因为大多数聚类包含所有阶段的样本（图2). 补充文件中提供了从每个人提供的不同月经期样本中确定的优势物种概况清单（参见附加文件4).为了更清楚地了解阴道微生物群落组成随时间变化的稳定性，我们绘制了每个女性微生物群落分类组成的比例面积图（图三). 这些图分为四种常见类型的阴道微生物群谱。第一组由12名女性组成，她们在采样过程中的细菌特征相对稳定（优势细菌相对比例的变异性<25%；图三A） ●●●●。这些女性也属于那些没有在社区集群之间切换的女性，正如之前的等级集群所定义的那样。第二组由9名女性组成，她们的微生物群特征由相同的细菌有机体组成，但每个“物种”的相对比例随时间波动超过25%（图三B） ●●●●。如前所述，其中五名受试者也在组间切换，而其余四名则没有。第三组由三名女性组成，她们的微生物群在取样过程中发生了巨大变化（社区主要成员发生了彻底变化；图三C） 而第四组包括两名女性，她们的细菌“种类”相对比例变异性大于25%，并且明显引入了新的细菌“品种”（图三D） ●●●●。

微生物组分的差异反映在香农多样性指数和Chao1-估计值的类似差异中。描述引导香农多样性指数的时间变化图和每个个体的Chao1估计值包含在附加文件中（参见附加文件5).

Fisher Exact测试显示，在研究期间，没有证据表明“稳定性”（定义为显性分类群变化<25%）或聚类转换与BMI分类、早孕、婚姻状况、饮酒、阴道性交、使用避孕套或使用无味卫生棉条有关（所有P（P） > 0.05). 其他临床协变量未进行调查，因为每个类别的受试者太少（表1).

通过阴道毛滴虫水平评估最近邻“物种”丰度

为了独立确认最近邻“物种”序列读取的丰度是否反映了样本中实际的细菌物种水平，阴道G定量PCR结果与序列读取计数进行比较。阴道毛滴虫之所以被选为靶点，是因为在74%的样本中检测到它的序列读取丰度范围很广。每个样本获得的总读数比例对应于阴道毛滴虫与阴道G通过qPCR在每个样本中检测(第页_秒 = 0.405;n个 = 76;P（P） < 0.001).

阴道微生物群中的支原体和脲原体

已知的限制氯化聚乙烯基于60的微生物分析表明，某些种类的软体动物不含该基因。为了解决这个问题，所有样本都通过使用传统的基于PCR的测试来检测软体动物支原体和/或脲原体物种。73份样本中的59份（80.8%）检测到软体动物，代表27名女性中的23份（85.2%）（图2). 当脲原体-对同一样本进行特异性PCR，27名女性中10名（37.0%）的73人中有23人（31.5%）返回阳性结果，其中18名（24.7%）为阳性U.parvum公司（8名女性）和5名样本（6.8%）解脲支原体（两名女性）。为了进一步了解软体动物级PCR产物的组成，将来自12个样本（代表5名处于卵泡期、排卵期或黄体期的女性）的PCR产物汇集并进行热测序，以产生54926个读数。类软体动物序列占读取的77.7%，具有清晰的身份（>95%）人型支原体和脲原体76.2%的序列中观察到spp(脲原体不能与16S rRNA基因的这个区域形成物种）。其余1.5%的类软体动物分为7个不同的OTU，与已知物种的同源性仅为85%至90%，这表明微生物群中可能存在新的软体动物。

序列匹配生殖支原体未检测到。有趣的是，这种PCR还从几个葡萄球菌物种，包括表皮葡萄球菌（读取的17.3%），巴斯图里沙门菌（读数的0.21%），鬣狗链球菌（读数的0.04%），以及葡萄球菌spp.（2.9%的读数），以及乳酸杆菌物种内陆乳杆菌（读取的1.6%），克氏乳杆菌（读数的0.04%），以及詹森氏乳杆菌（读数的0.07%）。这表明产生的一些PCR产物不是软体动物衍生的，并表明该PCR检测有可能产生假阳性结果。

讨论

我们的结果氯化聚乙烯对月经周期中阴道微生物群的60位研究表明，在这个队列中，健康女性中只有少数几个社区状态克氏乳杆菌，和詹森氏乳杆菌成为主导成员。这与之前报道的研究一致[12,13,25]. 值得注意的是，加塞乳杆菌在其他研究中表现突出[12,13]但在本研究中，它并不是任何女性微生物群中的优势有机体。

在总体丰富度、多样性和生态距离方面，我们观察到，随着时间的推移，大多数女性的个性化构成模式中都有一个因素：从同一女性不同月经期采集的样本中生成的轮廓与从不同女性但在同一月经期采集到的轮廓相比，显示出更高程度的社区结构共享相似性[13,51]. 然而，鉴于样本量有限，“个性化”微生物群的范围仍有待确认。

我们确实观察到月经期与Chao1估计的物种数量之间存在统计上显著的关系，其中卵泡期样本比黄体期样本平均多1.3个物种。然而，我们认为这一观察在生物学上并不重要，因为单个物种的存在或不存在都会受到技术差异和随机取样效应的影响[52].

生殖器支原体和脲原体与女性生殖器感染有关，如阴道炎、宫颈炎和盆腔炎，并与多种其他不良生殖和新生儿结局有关[53–55].人型支原体、生殖支原体、微小支原体、，和解脲支原体虽然报告的流行范围很广（20%至80%，取决于研究人群），但通过培养或分类特异性PCR方法定期在阴道样本中检测到。在基于16S rRNA基因的微生物群分析中，这些物种的报道要少得多[12,14,51]，可能是因为普遍的引物偏倚[56]. 缺乏氯化聚乙烯60基因在软体动物中并不普遍，因为支原体，包括生殖支原体一定要有氯化聚乙烯60基因。然而，生殖支原体在任何中都未检测到氯化聚乙烯迄今为止对人类阴道微生物组的60项研究[28–30].支原体和脲原体是常见的阴道成分[57,58]这进一步支持了这一观点，即这些微生物是许多临床健康女性阴道微生物群的一部分。此外，深度测序揭示了七个新的类似软体动物的序列，这些序列可能表明没有特征的物种。有趣的是，从12个PCR阳性样品池中对据报道的软体动物特异性PCR产物进行深度焦磷酸测序表明，引物特异性不完善。由其他生物产生扩增子，特别是葡萄球菌和乳酸杆菌与目标软体动物产品大小相同的物种可能会导致在使用这些引物的研究中过度报告软体动物检测结果。

我们的研究在以非-加德内雷拉双歧杆菌。双歧杆菌种（高G+C、革兰氏阳性、放线菌）是已知的阴道微生物群成员双歧杆菌和Alloscardovia公司在几项基于培养的研究中从阴道样本中分离出[19,21,59–62]. 基于16S rRNA基因的培养依赖性研究也有报道双歧杆菌阴道微生物群中的物种[14,63,64]一项研究发现，在20名女性中，有两名女性的社区成员以女性为主[65]. 更常见的是，基于16S rRNA基因的调查往往没有报告双歧杆菌阴道微生物群中[12–14,51]. 这一现象与之前肠道微生物组研究的结果相呼应，其中基于文化的研究揭示了丰富的双歧杆菌，然而，基于16S rRNA基因的培养独立研究检测到的很少，导致发现许多通用的16S rRNA基因PCR引物与该属不匹配[26,66,67].

进一步妨碍识别双歧杆菌它与阴道毛滴虫是阴道微生物群中普遍存在的一个物种，属于同一分类科[68]. 这个氯化聚乙烯实验表明，与基于16S rRNA基因的通用PCR相比，本研究中使用的基于60的通用PCR协议在肠道微生物组中更准确地代表双歧杆菌[26]、和氯化聚乙烯60个目标序列在加德纳菌属和双歧杆菌（与>90%的16S rRNA基因同一性相比，平均序列同一性仅为75%）。我们研究小组的五名女性发现短双歧杆菌、长双歧杆菌，或全草甲藻作为一种主要的阴道生物似乎是合理的。双歧杆菌通常被认为是肠道微生物群的有益成员[69]尽管它们在阴道微生物群中的作用尚未阐明。可以想象双歧杆菌，乳酸菌，在阴道内具有类似于乳酸杆菌双歧杆菌在婴儿早期健康和发育方面也发挥着重要作用[70]它们存在于健康的育龄妇女的阴道微生物群中，可以在出生时从母亲转移到新生儿。

采取措施评估样本质量、序列读取丰度的代表性以及所用技术的已知局限性。样本质量通过扩增人类(通过这个考克斯1基因）和细菌DNA（通过16S rRNA和氯化聚乙烯60个基因）。细菌扩增子可以从所有样品中产生，而人类扩增子只能从一个样品中产生。这一事实表明，核酸质量保持在足以进行分析的水平。然后根据经验确定氯化聚乙烯60个扩增子的产生和测序忠实地代表了目标的实际起始量阴道毛滴虫此外，预计软体动物物种的特征很差氯化聚乙烯60项分析，因此对这一重要群体分别进行了有针对性的调查。所有这些测量都为从氯化聚乙烯60项分析，有助于确保所调查阴道微生物群的描述尽可能真实和具有代表性。

这项研究的结果表明，女性特定的月经期不能预测当时的阴道微生物群。对于18名（69%）女性，在整个月经周期中收集的所有样本按成分聚集在一起。另有六名（23%）女性在乳酸杆菌-在整个月经周期中占主导地位的聚类，而只有两名（8%）女性的样本组成从异质聚类转变为乳酸杆菌-以集群为主。月经期没有发现阴道微生物组组成的明显变化，也与个人健康习惯或性活动无关。值得注意的是，本研究中的大多数女性的微生物群主要由乳酸杆菌物种。虽然这是一个普遍观察到的趋势，但我们认识到，从这个队列中得出的观察结果可能不适用于非-乳酸杆菌-阴道菌群占主导地位。需要对更多加拿大女性进行更长时间的进一步研究，以继续解决有关阴道微生物组的组成和稳定性的重要问题。同样重要的是，要确保这些研究是在世界各地多个地点具有不同种族和行为特征的不同队列中进行的。

结论

在我们的研究中，阴道微生物组的组成似乎与女性的月经期没有直接关系。一些女性的阴道微生物群落组成明显稳定，在整个月经周期中都很丰富，而另一些女性则随着时间的推移发生了轻微或剧烈的变化。尽管发生了这些变化，但总体群落构成趋向于少数几个由以下因素主导的组成结构类型之一乳酸杆菌任何一个时间的物种。蛋白质编码的使用氯化聚乙烯与其他一些方法不同，作为社区条形码标记的60个基因揭示了双歧杆菌主导的阴道特征，其在健康中的作用值得进一步研究。考虑到女性阴道微生物群的特定畸变程度及其对生活质量和生殖结果的不利影响，迫切需要关注这种疾病的流行程度并导致症状性疾病。