Dicer调节西斯特通过转录调控Dnmt3a间接调控ES细胞启动子甲基化

摘要

背景

X染色体失活是哺乳动物用于实现XX雌性相对于XY雄性X连锁基因剂量补偿的机制。染色体沉默在顺式通过非编码RNA的表达西斯特.因此，正确规定西斯特需要基因启动子在雄性和雌性中建立适当的X染色体活性。迄今为止的研究已经证实反义RNA的共转录Tsix公司和X失活开始前的低水平感觉转录。正反义RNA的平衡对于确定给定的西斯特当X失活开始时，等位基因将被表达，称为X失活选择。

结果

在这里，我们进一步研究了西斯特启动子调控。我们证明，正义和反义转录都调节西斯特未分化胚胎干细胞中启动子DNA甲基化，这可能是影响X染色体选择的机制基础。鉴于正、反义RNA参与启动子甲基化，我们研究了RNA干扰（RNAi）途径的可能作用。我们证明了西斯特在缺乏必需RNAi酶Dicer的ES细胞中，启动子被低甲基化，但这种影响可能是从头开始这些细胞中的DNA甲基转移酶。与此一致，我们发现Dicer-deficient XY和XX胚胎显示出合适的西斯特表达模式，表明Xist基因调控没有受到干扰。

结论

我们的结论是西斯特随机X染色体失活开始前的启动子甲基化受到有义和反义转录的相对水平的影响，但这可能独立于RNAi途径发生。我们从理解的角度讨论了这些数据的含义西斯特随机X染色体失活中的基因调控和X染色体选择。

背景

X染色体失活是哺乳动物用于实现XX雌性相对于XY雄性X连锁基因剂量补偿的机制。在发育早期，女性胚胎中的所有细胞都会使两条X染色体中的一条上的大多数基因失活。在胚胎谱系中，X失活通常是随机的，在任何给定的细胞中，母系或父系X失活的概率相等。在某些胚外血统中，总是父亲X失活，称为印记X失活。在早期胚胎发生中建立X失活后，在所有后续细胞世代中都能稳定地保持失活状态（参见[1]).

X失活由X非活性特异转录物的表达触发(西斯特)是一种非同寻常的非编码RNA，具有与转录染色体结合并覆盖染色体的独特性质。西斯特RNA被认为是募集修饰染色质的沉默因子，产生有丝分裂稳定的异色构型，可以通过随后的细胞分裂进行繁殖（综述于[2]).

建立适当的X灭活模式需要确保正确调节西斯特RNA处于早期发育阶段。明确地西斯特在XX细胞中只能有一个等位基因表达，而在XY细胞中则完全不表达。迄今为止的研究表明西斯特随机X失活的表达是复杂的。一种反义RNA，称为Tsix公司，对于维护西斯特在X失活开始前处于稳定状态的基因，其机制被认为涉及抑制性染色质标记的建立和/或DNA甲基化西斯特发起人[三——6].Tsix公司-中介抑制反过来调节给定西斯特XX杂合子中表达的等位基因[7——11]. 与…同时Tsix公司表达来自西斯特发起人[6,12]. 增强的感觉转录起始于西斯特对抗Tsix公司使XX杂合子中的染色体更容易失活[12,13].

在未分化的胚胎干细胞中Tsix公司表达或DNA甲基化仅导致西斯特表达式[8,9,11,14]. 相反，在细胞分化开始后Tsix公司-缺乏和DNA甲基化缺乏的ES细胞上调西斯特也就是说，从XY细胞中的单个X染色体[7,14——17]. 这表明存在替代的、可能冗余的调节机制西斯特表达式。的确，对内细胞团中X染色体重新激活的研究[18,19]，也参与了原始生殖细胞的发育[20]，表明一个重叠的调控途径，专为多能干细胞（包括ES细胞），或抑制西斯特转录，或者降低西斯特表达式。

在这个复杂的调控电路中，还有一条额外的通路，确保只有一条西斯特基因在XX细胞中表达，并且单个西斯特XY细胞中的等位基因仍然受到抑制。这个过程的经典模型调用了限制水平上存在的阻塞因子，使得只有一个西斯特等位基因在每个细胞中被阻断[21]. 最近有证据表明反式-相互作用西斯特等位基因在等位基因控制中很重要西斯特表达式[22——24]. 此外，在最近的一项研究中，有人提出编码关键阳性调节物的基因位于西斯特。建议增加具有一条以上X染色体的早期胚胎细胞中该因子的水平，以达到允许表达西斯特[25].

RNA干扰（RNAi）途径存在于多种生物中，如裂变酵母和哺乳动物（参见[26]). 该途径控制一系列机制，在RNA翻译/稳定性水平（转录后基因沉默）和转录/染色质结构水平（转录基因沉默）调节基因表达。鉴于非编码RNA参与X失活，推测在X失活的起始、传播或维持过程中与RNAi途径可能存在联系。RNAi在X失活启动中的作用，特别是通过在X失活性开始之前，在X失活中存在重叠的正、反义RNA西斯特轨迹。我们之前提供了证据，证明RNAi在通过有条件地删除T淋巴细胞中编码Dicer（一种RNase III酶，对RNAi途径至关重要）的基因来维持X失活中不起作用[27]. 在本研究中，我们进一步探讨了RNAi在X失活的启动和传播中的作用。我们表明，在西斯特启动子影响DNA甲基化水平，与dsRNA介导的机制一致。使用条件Dicer公司敲除ES细胞我们证明Dicer公司缺失导致西斯特基因启动子。然而，我们还发现基因组的低甲基化现象发生得更为广泛，这是由于从头开始ES细胞中的甲基转移酶，尤其是Dnmt3a。此外，分析E6.5处Dicer-deficient胚胎，我们证明单等位基因的启动西斯特表达和传播西斯特RNA正常出现。我们得出结论，RNAi途径在X失活过程中不起关键作用。

结果

通过西斯特促进剂影响西斯特未分化ES细胞中启动子甲基化

我们和其他人之前已经证明了这种意义和反义转录在Xist公司X染色体失活发生前的位点在X染色体失活性选择中起作用[7——9,11——13]. 尽管有证据表明Tsix公司对染色质结构和DNA甲基化有影响西斯特发起人。

迄今为止的证据表明，反义Tsix公司转录对西斯特启动子DNA甲基化在ES细胞分化中的作用[6]和体细胞中[4,6,17]，但不在代表西斯特X失活开始前的启动子状态[4,6,17]. 为了确定感觉转录是否可以影响西斯特在X失活之前，我们分析了两个携带突变的XY ES细胞系西斯特5'区，最初使用常规甲基化敏感限制性内切酶位点（MSRE）分析。第一个突变Δ5'是一个9 kb区域的缺失，该区域位于西斯特转录起始位点（TSS）。第二个是插入转录终止位点SPA-MAZ₄区域内-相对于TSS为1.1 kb[12]（图1安培). 这两种突变在未分化的XY ES细胞中均表现出增强的感觉转录，与突变X染色体的优先失活相关体内[12]. 根据之前的调查结果[28]，的西斯特在未分化的野生型（wt）XY ES细胞中发现启动子高度甲基化（图1安培和1B年). 有趣的是，Δ5'+neo和SPA+neo-XY ES细胞系在所有分析的CpG位点，即Hpall、HaeII、HhaI、MluI和SacII，都显示出显著的低甲基化（图1B年). 使用ImageQuant软件对条带进行量化，结果表明不同CpG位点的甲基化损失在20-45%范围内，SPA+新突变受影响更严重（图1摄氏度). 这表明Xist公司启动子可导致CpG低甲基化。

图1

分析 西斯特 启动子DNA甲基化 西斯特 突变体（A）示意图跨越西斯特和直接上游基因，依诺克斯包括pS12x和pS19x。西斯特和依诺克斯TSS和转录方向用箭头表示。图表下方显示了分析中使用的限制性甲基化敏感酶。灰色条显示用于Southern杂交的探针位置。这三个目标Xist公司突变体Δ5'，SPA[12]和XT67E1[29]如图所示。红色虚线表示Δ5'和XT67E1突变体中的缺失，示意图下方的淡紫色方框表示插入漂浮的PGKneo盒。黄色小方框显示SPA插入的位置。（B） MSRE分析西斯特启动子位于wt（129/1）和两个突变型（Δ5'+neo和SPA+neo）XY ES细胞系中。不同大小的亲本EcoRI片段西斯特突变体是由于缺失/插入的序列。突变样品中消化片段的强度增加表明部分低甲基化。（C） 定量wt和突变细胞系中MluI、HaeII和SacII位点的低甲基化程度。（D） MSRE分析西斯特wt XY（129/1）、wt XX（Pgk12.1）和突变体（XT67E1）XX ES细胞系中的启动子。蓝色箭头表示甲基化的wt PGK片段，红色箭头表示较大的突变体XT67E1片段。注意DNA甲基化在西斯特XT67E1突变等位基因的上游区域。（E） 链特异性RT-PCR分析西斯特wt Pgk12.1和突变型XT67E1 XX ES细胞系中的5'区。上图显示了扩增子4（amp 4）、扩增子51（amp 51）和扩增子51mut（amp 51mut）引物的位置以及正（s，绿色）和反义（as，红色）转录物的方向。注意XT67E1中异位感觉转录物的表达，归因于突变等位基因。

然后我们分析了另一个西斯特突变，XT67E1[29]，删除了西斯特Pgk12.1-XX ES细胞129等位基因的外显子1和最小启动子区域（图1安培). 虽然XT67E1细胞中的缺失删除了细胞中许多可甲基化的CpG位点西斯特启动子，TSS上游36 bp的位点被保留。此外，该删除导致BamHI片段在西斯特因此，我们能够区分wt和突变等位基因（图1安培和一维). MSRE分析显示突变等位基因完全低甲基化。wt等位基因是镶嵌甲基化的，类似于亲本XX ES细胞系Pgk12.1[29].

作为西斯特在XT67E1细胞中，TSS在突变等位基因上被删除，我们预计感觉转录将无法检测到，但反义Tsix公司转录将保持不变。然而，通过链特异性聚合酶链反应（PCR）分析意外地发现，突变等位基因转录了正、反义RNA，而且相对于亲本Pgk12.1细胞系而言，正转录物丰富（图1E级，放大器4）。为了验证这一结果，我们设计了能够区分突变和wt等位基因的引物；这两个等位基因的正向引物相同，位于Xist公司TSS公司。反向引物位于外显子1（TN51，wt等位基因）或新霉素选择性盒的3'端（neoTN9≡51mut，突变等位基因。使用这些引物的链和等位基因特异性逆转录（RT）PCR清楚地显示了突变等位基因上的异位义转录（图1E级). 驱动新霉素耐药基因表达的PGK启动子不能是异位转录物的来源，因为它位于所分析区域下游约1.7 kb处，相对于西斯特这表明感觉转录是从次要上游激活的西斯特TSS，与之前报告的结果一致[13]. 重要的是，这一结果加强了对Δ5'+neo和SPA+neo突变ES细胞的分析得出的结论，这些细胞增强了在上游启动的感觉转录西斯特对抗西斯特启动子甲基化。

未分化ES细胞中Xist-CpG岛的低甲基化与X失活偏斜相关

调查西斯特更详细地说，我们使用序列矩阵辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱分析亚硫酸氢盐修饰的DNA[30]. 这种方法使我们能够更广泛地分析可甲基化的CpG，并获得CpG甲基化水平的准确定量测量。为了验证该方法，我们首先分析了对照XX和XY体细胞和ES细胞系中的甲基化模式（图2安培和2B型). 正如预期的那样，CpG甲基化在XY雄性体细胞中接近100%，在XX雌性体细胞中约为50%，代表完全甲基化不活跃的平均值西斯特不活动X染色体上的位点和一个完全非甲基化的活性位点[28]. 在XY ES细胞中，甲基化在西斯特区域1，尽管在区域2中略低。西斯特在XX ES细胞中显著低甲基化，与我们之前的观察结果一致[31].

图2

序列质谱分析 西斯特 CpG岛DNA甲基化 西斯特 突变型XY胚胎干细胞系.（A）的示意图西斯特启动子区域和外显子1的5'端（CpG区域1和2）。P1和P2起始位点和转录方向由箭头指示。灰色阴影框显示了5'重复的位置。单个CpG站点由示意图上方的小圆圈表示；灰色圆圈表示所分析的地点。聚合酶链反应片段A、C和D包含位点A1–15、C1–22和D1–10（参见方法）。图表显示了特异性的甲基化百分比西斯特野生型（wt）XY和XX胚胎干（ES）和体细胞（B）以及Δ5'（C）、SPA（D）和Δhs（E）中的CpG位点西斯特突变体[12,13]以及pAA2Δ1.7和pSS1Δ2.7（F）Tsix公司突变体[11]. wt 129/1 XY ES细胞系被包括在每个图上作为参考对照。插入内容显示突变的类型和位置。每个突变的X失活偏斜表型显示在旁边。这些点由分析连续位点的线条连接。图下方以灰色编号的CpG位点表明，由于碎片质量低或高，或者由于两个或多个碎片的重复或重叠，数据点不可用。两个或三个CpG位点（例如，A7/8/9）的平均数据显示在这些位点彼此靠近并且不能被解析为单独片段的情况下。注意低甲基化与西斯特突变ES细胞的启动子区和初级（1°）非随机X失活体内.

验证了SEQUENOM方法后，我们继续分析西斯特上述突变型XY ES细胞系的启动子甲基化，此外，在Δhs XY突变型ES细胞系中，也有报道称X失活的异位转录依赖性偏斜[13]. 我们发现9 kb的西斯特上游区域（Δ5'）导致区域1和区域2甲基化损失约20%。携带PGKneo盒的突变体以及Δneo ES细胞也是如此（图2摄氏度). SPA+新突变体的甲基化损失更严重（图二维)，与上述MSRE分析一致（图1磅和1摄氏度). Δhs+neo的中度低甲基化，但ΔhsΔneo突变体的甲基化程度不高（图第二版). 引人注目的是，所有的突变体都显示出西斯特CpG岛也显示女性杂合子突变等位基因的优先X失活[12,13]. 相反，不影响X失活随机性的ΔhsΔneo突变没有表现出低甲基化。总的来说，这些结果证明了西斯特启动子和该染色体被选为杂合子雌性非活性X的概率增加。

此前有报道称尖沙咀转录不会导致西斯特未分化ES细胞中启动子低甲基化，尽管分析仅限于区域I中的两个MSRE位点[6]. 为了进一步解决这个问题，我们使用序列分析来评估西斯特两种不同基因启动子甲基化Tsix公司突变ES细胞系pSS1Δ2.7和pAA2Δ1.7[11]. 在第一个突变体pSS1Δ2.7中，Tsix公司外显子1被删除，但这对Tsix公司转录或功能。在第二个突变体pAA2Δ1.7中，尖沙咀通过西斯特该基因座被废除，导致女性胚胎中目标等位基因的原发性非随机失活。我们分析了三个独立的pAA2Δ1.7 XY ES细胞克隆，在所有病例中我们都观察到明显的低甲基化西斯特启动程序（图2楼). 与CpG区域2相比，CpG区I的低甲基化程度适中，这可能是Sun等人[6]没有观察到这个结果。pSS1Δ2.7突变没有观察到甲基化差异，与正常情况一致Tsix公司女性杂合子中的转录和随机X失活。这一结果表明，在X失活开始之前，Tsix公司转录，可能与生理水平的感觉一起西斯特转录，决定西斯特启动子CpG甲基化水平，进而影响X染色体在随机X失活开始期间被选为非活性X的概率。增加有义转录，或可能利用异源上游启动子，拮抗启动子CpG甲基化，从而增加杂合子女性中X染色体被选为无活性X的可能性。

RNAi途径在X失活启动中的作用：条件性Dicer敲除ES细胞的产生

正、反义转录影响CpG甲基化并抑制CpG表达的机制是什么西斯特发起人？一种可能性是正、反义RNA触发RNAi反应，类似于高等植物中RNA依赖的DNA甲基化[26]. 或者，涉及反义RNA的RNAi独立机制Tsix公司或正、反义RNA都可能起作用。增加感觉转录减少Tsix公司-从属的西斯特启动子甲基化可以解释为沉默不依赖于dsRNA的产生。然而，这并不排除来自西斯特启动子与反义合作Tsix公司RNAi介导沉默中的RNA。为了进一步研究这一点，我们开始分析缺乏RNase III酶Dicer的ES细胞，这对哺乳动物细胞中的RNAi途径至关重要。

我们着手获得一种ES细胞系，其中编码Dicer的基因可以使用CRE/loxP有条件地删除，使我们能够区分归因于Dicer公司缺乏这种基本因子的ES细胞的衍生和长期培养导致的缺失和次级效应。我们建立了D41 XY ES细胞系，其中RNase III结构域两侧都有loxP位点Dicer公司等位基因[27]. 最初，通过转染pCAG--Mer-Cre-Mer，他莫昔芬诱导的Cre重组酶质粒（详见方法），然后进行羟基他莫昔酚（4-OHT）处理（图3A级). Cre重组效率低Dicer公司^Δ/Δ杂合子很快使菌落过度生长Dicer公司^lox/Δ聚居地。然而，我们分离出三个独立的亚克隆S5、S6和E5，它们删除了两个等位基因上的Dicer RNase III结构域（图3B公司).

图3

Dicer缺陷XY胚胎干细胞系的建立与分析（A）两种用于创建Dicer-deficient embryonic stem（ES）细胞系的方法（详见方法）。（B） PCR基因分型检测以区分Dicer公司野生型（wt）、漂浮型和缺陷型细胞系。1-3和11，Dicer公司空克隆；4-5和7-8，Dicer公司^{液氧/液氧}亲本细胞系；6，一个含有缺失和漂浮等位基因的混合克隆；9，wt/Δ杂合小鼠；10，重量控制。Dicer-deficient克隆中的wt带是由于ES样品被饲养细胞污染所致。（C） 来自漂浮细胞系（A6和D3）和Dicer公司使用mi292as探针检测Dicer功能的空克隆（S5和S6）。S5和S6克隆中miRNA的丢失和前miRNA的增加，而漂浮克隆A6和D3中没有，表明突变克隆中Dicer功能被取消。（D） 示意图西斯特5’区域显示在限制地图旁边。灰色条表示用于Southern杂交的探针位置。（E） MSRE分析西斯特对照和突变ES细胞系中的启动子。DNA甲基化水平Dicer公司^Δ/Δ克隆更类似于低甲基化的XX细胞系，而不是甲基化的XY对照或亲本XY细胞系。（F） 低甲基化程度的量化国际计算语言学协会我，Mlu公司一、 和囊II位点在漂浮和Dicer-deficient ES细胞系中。站点相对于西斯特起始站点显示在括号中。

确保RNase III域的删除完全废除Dicer公司我们用miR-292探针对来自Floxy和Dicer缺陷克隆的RNA进行了Northern杂交（图3C公司). 结果证实了S5和S6中miR-292的缺失和相应的前miRNA的富集Dicer公司相对于对照细胞系的突变克隆。

我们接着描述了Dicer-deficient ES细胞系的特征。根据之前的观察[32]，Dicer公司^Δ/Δ克隆过度表达主要的卫星重复序列（数据未显示），无法分化。我们试图通过提取LIF来分化细胞。与父母相比Dicer公司^{液氧/液氧}细胞，D3Dicer公司^Δ/Δ克隆并没有形成胚状体，而是留在不规则形状的丛中，随后附着并继续生长。经过11天的分化，多能干细胞标记物Oct4、Nanog、Fgf4和Errβ的表达水平保持不变（附加文件1). 有趣的是，T/Brachyury通常在wt ES细胞中低水平表达，可能是由于少量分化细胞的缘故，但在Dicer公司^Δ/Δ克隆，在分化条件下培养细胞11天后也没有出现。这一结果表明，Dicer-deficient ES细胞要么无法分化，要么存在于培养物中的分化细胞无法存活。

低甲基化西斯特Dicer-deficient XY-ES细胞中的启动子

确定Dicer缺乏是否影响西斯特启动子甲基化，我们对来自对照组和Dicer公司^Δ/Δ克隆（图三维和第三方). 有趣的是，所有Dicer公司^Δ/Δ克隆在所分析的所有限制位点上都表现出部分甲基化缺失。然而，应该注意的是，不同的克隆表现出不同程度的甲基化缺失，其中S5表现出最高的低甲基化百分比，S6表现出最低的甲基化百分比（图第三方和第三层).

在衍生过程中，初步分析中使用的细胞系经过了几轮克隆和选择，因此我们继续衍生出更多的细胞系，在本例中，使用携带flox的ES细胞Dicer公司靶向Rosa26位点的等位基因和三苯氧胺诱导的Cre重组酶基因[33]. 在这个系统中，添加三苯氧胺后，通过Cre重组介导删除漂浮盒非常有效，我们能够从两个不同的亲本中选择几个单独的克隆Dicer公司^lox/lox细胞株DTCM23和DTCM49。此外，我们从200–250个三苯氧胺处理过的细胞群中建立了Dicer-deficient细胞（图3A级). 所有进一步的分析都是在两种方法获得的克隆上并行进行的。

要确定Xist公司启动子低甲基化定量分析D3亚硫酸氢修饰的DNA^{液氧/液氧}和S5、S6、E5Dicer公司^Δ/Δ克隆使用SEQUENOM MALDI-TOF质谱分析。D3衍生Dicer公司^Δ/Δ克隆在区域1和区域2都显示出显著的低甲基化（图4A级). D3^{液氧/液氧}亲本克隆也显示区域1甲基化中度缺失，区域2甲基化显著缺失，但低于Dicer公司^Δ/Δ克隆。其原因尚不清楚，但可以用D3在几轮细胞选择过程中发生的突变或重排来解释^{液氧/液氧}对细胞进行处理。为了排除这种无关突变导致观察到的低甲基化表型的可能性，我们对DTCM23进行了质谱分析^{液氧/液氧}亲代细胞系和Dicer公司^Δ/Δ克隆23ΔE3、23ΔF4和23Δ池。DTCM23^{液氧/液氧}细胞系显示出类似于129/1 XY ES对照的甲基化模式，而Dicer公司^Δ/Δ克隆在区域2表现出最显著的低甲基化（图4B类). 另一组克隆DTCM49也获得了类似的结果^{液氧/液氧}和Dicer公司^Δ/Δ衍生工具（附加文件2安培).

图4

序列质谱分析 西斯特 Dicer缺陷XY胚胎干细胞系的DNA甲基化。的示意图西斯特启动子区域和外显子1的5'端（CpG区域1和2，详细描述见图2）。图表显示了特定基因甲基化的百分比Xist公司两组中的CpG位点Dicer公司^{液氧/液氧}和胚胎干（ES）细胞系缺陷（A）和（B））。每个CpG位点显示了至少三个独立DNA样本的平均数据。wt 129/1 XY ES细胞系作为参考控件包含在每个图形中。当分析连续的位点时，这些点被线条连接起来。图下方以灰色编号的CpG位点表明，由于碎片质量低或高，或者由于两个或多个碎片的重复或重叠，数据点不可用。两个或三个CpG位点（例如，A7/8/9）的平均数据显示在这些位点彼此靠近且无法作为单独片段进行解析的情况下。（C） 的动态西斯特暴露于他莫昔芬50小时（蓝色）或168小时（淡紫色）的DTCM23漂浮细胞系中的CpG岛低甲基化。

为了确定甲基化损失的动力学，我们处理了DTCM23^{液氧/液氧}和DTCM49^{液氧/液氧}具有4-OHT的细胞系，并在50和168小时后收集用于序列分析的DNA。结果表明：西斯特启动子低甲基化在缺失Dicer公司随着细胞持续传代，进一步的低甲基化发生，同样最显著的是区域2（图4摄氏度和其他文件2B型).

西斯特Dicer-deficient XY ES细胞表达升高

为了测试低甲基化如何影响西斯特在Dicer-deficient ES细胞系的启动子中，我们进行了RNA荧光就地S5的杂交（FISH）分析Dicer公司^Δ/Δ使用探针检测的ES克隆西斯特和Tsix公司抄本。大多数S5细胞显示出类似于对照129/1 XY ES细胞的单一精确定位信号。然而，偶尔也有细胞表达上调西斯特信号，它要么“绘制”X染色体（图5A级，从顶部算起第三个面板）或分散在染色体附近（图5A级，底部面板）。平均约10%的细胞显示出这种上调模式，证实了西斯特启动子受损调节西斯特表达式。

图5

分析 西斯特 Dicer-deficient XY胚胎干细胞的表达（A）使用全长DIG标记的未分化wt XY ES细胞系（129/1）、wt XX-ES细胞系（Pgk12.1）和Dicer-deficient XY ES克隆（S5）的RNA FISH分析西斯特探查。探针用FITC-偶联抗体（绿色）检测，DNA用DAPI复染。合并的彩色图像显示在右侧面板中。大多数Dicer公司突变的ES细胞每细胞显示一个精确信号，对应于西斯特和Tsix公司转录物，类似于XY对照细胞系。一部分突变细胞显示西斯特信号（箭头）要么沿染色体紧密聚集，类似于XX细胞（比较两个中间面板），要么在X染色体附近显示更分散和分散的位置（箭头，底部面板）。偶尔堆积西斯特在未分化的Pgk12.1-XX ES培养中，分化细胞的比例很小。（B） 定量RT-PCR分析西斯特中的表达式Dicer公司^{液氧/液氧}XY ES细胞缺乏。三个面板显示了三组Dicer公司带有相应floxed父母控制的空克隆。右侧面板显示的是西斯特在129/1 XY和Pgk12.1 XX ES细胞中表达。所有数据均标准化为β-肌动蛋白转录物水平，并相对于129/1呈现西斯特RNA水平。累计西斯特RNA FISH检测到的RNA与西斯特通过定量RT-PCR测定转录本。

接下来我们分析了西斯特所有人的定量表达Dicer公司^{液氧/液氧}控制和Dicer公司^Δ/ΔES克隆。的数据西斯特表达正常化为β-actin，然后达到西斯特控制129/1 XY ES细胞中的转录物，如图所示5亿.全部Dicer公司^Δ/ΔES克隆显示西斯特与相应的亲代细胞系进行比较；然而西斯特单个克隆的上调幅度不同。值得注意的是，虽然西斯特DTCM23中的表达式^{液氧/液氧}和DTCM49^{液氧/液氧}与129/1对照组的D3相同^{液氧/液氧}克隆表现出高表达，与观察到的启动子低甲基化一致。

低甲基化Xist公司Dicer-deficient XY ES细胞中的启动子与细胞凋亡相关从头开始DNA甲基转移酶

西斯特Dicer-deficied ES细胞中启动子低甲基化可能是由于直接影响DNA甲基转移酶（Dnmts）的募集，例如由RNAi途径介导。或者，可能需要有义和/或反义转录，以在Xist公司启动子，例如特定组蛋白赖氨酸甲基化标记，这反过来可能对Dnmts的招募产生间接影响。为了测试间接模型，我们分析了抑制性组蛋白修饰H3K9me2（数据未显示）、H3K27me3、H4K20me3以及活性标记H3K4me2在西斯特使用染色质免疫沉淀（ChIP）在wt和Dicer-deficient ES细胞中定位。这些组蛋白修饰在Dicer-deficient ES细胞中均未显示出显著变化（其他文件三和4).

组蛋白修饰在Dicer公司^Δ/Δ与漂浮的亲代细胞相关的细胞表明，低甲基化是Dnmts募集的直接影响。此前有报道称西斯特启动子甲基化由从头开始DNA甲基转移酶Dnmt3a和/或Dnmt3[34]. 因此，我们继续使用蛋白质印迹分析这些酶的水平，以及维持甲基转移酶Dnmt1的水平。与先前的观察结果一致，与XY对照ES细胞系相比，XX中Dnmt3a和Dnmt2b的水平非常低[31]. 有趣的是，我们还观察到Dnmt3a在Dicer公司^Δ/Δ克隆与Dicer公司^{液氧/液氧}控件（图6A–C级). 受影响最大的克隆是S5，与D3对照相比，其Dnmt3a蛋白大约减少了5倍。DTCM23和DTCM49Dicer公司^Δ/Δ克隆显示Dnmt3a耗竭，Dnmt3 b水平也略有下降。

图6

分析 从头开始 DNA甲基转移酶在双基因缺陷XY胚胎干细胞系中的表达对Pgk12.1 XX（Pgk）、129/1（129）、，Dicer公司^{液氧/液氧}（F/F）和Dicer缺陷（DiΔ/Δ）XY胚胎干细胞系。拉明B被用作加载控制。定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3a2和Dnmt3G基因的转录Dicer公司^{液氧/液氧}（Di F/F）和Dicer-deficient XY ES细胞系（D）-（F）。每个Dnmt使用两个或三个引物对，并显示了来自一式三份测量的平均数据。所有数据均归一化为Idh2和β-actin转录水平，并相对于S5、S6和E5克隆的D3Cre Dnmt水平，以及DTCM23和DTCM49克隆组的DTCM23 F/F。

为了确定Dnmt3a/b缺失是由转录调控还是转录后调控引起的，我们使用为Dnmt1、Dnmt2a2（ES细胞中的主要Dnmt3亚型）、Dnmt 3b（所有Dnmt4b亚型）和Dnmt3G设计的引物进行了定量RT-PCR分析（图6D–F). 与西方数据一致，我们发现Dnmt3a2转录水平在Dicer公司^Δ/Δ克隆，而不是在控件中。我们还发现，在Dicer-deficient克隆中，Dnmt3a2的功能性伴侣Dnmt3GL的水平显著降低。Dnmt3b水平在DTCM系列克隆中降低，但在S5、S6和E5中没有降低Dicer公司^Δ/Δ克隆，符合Western blot结果。对照和Dicer-deficient克隆之间的Dnmt1水平没有显著差异。D3基因RNA的Affymetrix微阵列分析^{液氧/液氧}与S5相比Dicer公司^Δ/Δ克隆还显示出Dnmt3a减少2.4倍和Dnmt3L减少3.3倍（数据未显示）。

为了确定低甲基化是否发生在Dicer公司^Δ/Δ我们分析了两个印迹基因H19和Igf2rAir的差异甲基化区域（DMR）的甲基化克隆（附加文件5). 在这两个例子中，我们观察到低甲基化在Dicer公司^Δ/Δ克隆。值得注意的是，最近的两项研究报告了在Dicer公司^Δ/ΔES细胞并将其归因于Dnmts水平的降低[35,36].

根据中Dnmt3a/b的要求西斯特启动子甲基化[31,34,37]，我们得出结论Dicer公司^Δ/Δ克隆很可能是由于这些酶的表达水平降低，而不是缺乏dsRNA介导的转录基因沉默机制。

单等位基因西斯特表达和西斯特Dicer缺陷XX胚胎中的RNA传播

最后，我们希望测试Dicer在启动XX细胞随机X失活中的作用，并确定RNAi途径在传播中是否重要西斯特非活性X染色体上的RNA。由于Dicer-deficient ES细胞无法分化，而且我们还无法分离出稳定的Dicer-deficient XX ES细胞系，因此我们分析了通过交配产生的Dicer deficient-XX胚胎Dicer公司^重量/Δ杂合小鼠。一般来说，Dicer公司^Δ/Δ胚胎存活到大约E7.5–E8.5，并且小于杂合子或同窝重的胎儿，这与之前发表的一项研究一致[38]. 这为分析大约在E5.5开始的随机X失活的启动提供了机会。我们使用西斯特和Tsix公司E6.5胚胎上的探针（图7). 这个Dicer公司^Δ/ΔXY胚胎显示西斯特/Tsix公司精确定位与wt和杂合子XY同窝卵相似的信号，而Dicer公司^Δ/Δ雌性胚胎既精确又积累西斯特转录本，表明Dicer不影响内细胞团（ICM）中随机X失活的起始步骤。以下人员的在场西斯特XX胚胎细胞中的云意味着西斯特RNA也不需要Dicer活性。我们确实注意到XX个胚胎表现得更弱、更混乱西斯特具有较强通用背景的信号西斯特和Tsix公司探针，这在不同的胚胎中是不同的。这可能是由于突变胚胎中胚胎致死和凋亡的开始。总的来说，这些观察结果进一步支持了我们的结论，即X失活可以独立于RNAi途径发生。

图7

RNA荧光 就地 杂交分析 西斯特 / Tsix公司 中的表达式 Dicer公司^Δ/Δ E6.5胚胎.（A）RNA FISH分析西斯特使用全长DIG标记的代表性全山E6.5 wt和Dicer-deficient胚胎中的表达西斯特探查。用FITC-偶联抗体（绿色）检测探针。示例显示整个胚胎的联合共聚焦光学切片（每个胚胎合并15个截面，每个截面之间的距离为0.35μm；63×物镜）。（B） RNA-FISH后E6.5 wt和Dicer-deficient胚胎全山外胚层部分的放大图（×3）西斯特探针，如（A）所示。用FITC-偶联抗体（绿色）检测Xist探针，用DAPI对DNA进行反染。（C） RNA FISH分析西斯特（绿色）和尖沙咀（红色）在整个mount E6.5 wt和Dicer缺陷胚胎中表达。示例显示通过胚胎外胚层部分的组合共焦光学切片（每个胚胎合并10个截面，每个截面之间的距离为0.35μm）。准确指出西斯特/Tsix公司信号（箭头）在wt和in中可见Dicer公司^Δ/Δ胚胎。

讨论

在本研究中，我们着手进一步探索西斯特随机X失活开始时的基因表达。特别是，我们希望了解正反义转录在西斯特启动子阻遏和RNAi途径的可能参与。我们证明，在X失活开始之前，ES细胞中增强的感觉转录降低了DNA甲基化水平Xist公司发起人。此外，我们发现反义Tsix公司需要转录西斯特未分化ES细胞中启动子甲基化。DNA低甲基化西斯特在Dicer-deficient ES细胞中也观察到启动子，但进一步分析表明，这是一种间接效应，可归因于从头开始甲基转移酶Dnmt3a、Dnmt2b和Dnmt3G。同样，Dicer-deficied胚胎表现出正常的等位基因调控西斯特/Tsix公司表达，而且，西斯特在DNA缺乏的XX胚胎中，RNA在单个X染色体上扩散。我们的结论是尖沙咀-调节西斯特X失活过程中的表达和其他步骤独立于RNAi途径发生。

正、反义转录在调控中的作用Xist公司启动子甲基化

之前我们演示了西斯特显示ES细胞中异源启动子的义转录增加的等位基因在XX杂合动物中也显示出优先的X失活[12,13]. 这里我们扩展了这一发现，表明这些修改了西斯特等位基因在西斯特启动子区，为XX杂合子的优先表达提供了机制基础。类似地，突变体西斯特XT67E1 XX ES细胞中的等位基因在有意义的方向有异位转录，并且位于缺失区域上游的启动子CpG位点完全甲基化。在这种情况下，低甲基化与表达概率增加无关，因为缺失的等位基因缺乏西斯特TSS公司。

增强的感觉转录拮抗剂西斯特即使反义水平正常，启动子甲基化Tsix公司RNA存在。然而，我们的数据表明Tsix公司转录对于建立西斯特ES细胞中启动子甲基化，即X失活之前。这与之前的一份报告不同尖沙咀突变等位基因被认为在西斯特启动子甲基化在ES细胞分化期间，但在未分化ES细胞中随机X失活开始之前[6]. 这种差异的部分原因是区域2的低甲基化发生率高于区域1（本研究），Sun等人[6]仅分析了区域1。第二个可能的因素是Tsix公司突变型XY ES细胞表现不同。值得注意的是，Δ65、2 lox、pAA2Δ1.7和Δ34#1 XY ES细胞系均上调西斯特分化时不适当[7,9,11,16]，推测至少部分是由于启动子低甲基化，而ΔCpG细胞系保持西斯特分化过程中的抑制[8]. 这种差异可能是因为次级途径，西斯特与多能性程序相关的抑制[18]在ΔCpG XY ES细胞系中起主导作用。

Dicer间接调节西斯特ES细胞中启动子甲基化

我们想确定西斯特正、反义RNA的启动子甲基化由RNAi途径介导。我们发现Dicer-deficient ES细胞显示西斯特启动子低甲基化和适度上调西斯特转录本，在一些独立的细胞系中观察到的一种效应，尽管程度有所不同。然而，一些事实使我们得出结论，这是Dicer公司删除。首先，我们观察到从头开始Dicer-deficied细胞中的DNA甲基转移酶、Dnmt3a、Dnmt 3b和Dnmt 3G。几项研究表明，Dnmt3a/3b水平对于维持西斯特启动子甲基化[31,34,37]，表明降低的Dnmt水平足以说明西斯特Dicer-deficient细胞中启动子低甲基化。与这个想法一致，我们在印迹位点观察到低甲基化，最近的两项研究报告了亚甲基化重复序列[35]和的发起人10月4日，Tsp50和Sox30系列基因[36]在独立分离的Dicer-deficient细胞系中。重要的是，这些研究中发现的低甲基化表型由Dnmt转基因的异位表达补充，这表明RNAi途径并不直接参与。这些研究还表明，Dnmts的下调是由于Rbl2的过度表达所致，而Rbl2又通常受到miR-290簇miRNAs的负调控。与此结论一致，我们还发现，在这里描述的Dicer-deficient细胞系中，Rbl2转录水平上调了4.4倍（数据未显示）。

第二条证据表明RNAi途径不需要用于西斯特基因调控和随机X失活来自我们对植入后早期Dicer-deficient胚胎的分析。在这里，我们观察到适当的西斯特和Tsix公司XY的表达模式和上调西斯特来自XX胚胎中的单个等位基因。XX胚胎的染色强度降低西斯特结构域很可能反映出胚胎死亡发生在我们检测的阶段E6.5之后不久[38]. 需要注意的是，我们不能正式排除在XX胚胎中，我们观察到的模式代表了印记X失活模式的持续性，也就是说，Dicer缺陷导致在建立随机X失活之前未能消除印记X的失活。

的规定西斯特启动子甲基化

鉴于RNAi途径不介导的证据西斯特通过正反义转录调控启动子，有哪些替代机制？事实上，我们在未分化的Tsix公司-XY ES细胞缺陷提示反义转录和启动子CpG甲基化之间存在直接联系。一些CpG甲基化保留在Tsix公司突变细胞可能表明启动子中DNA甲基化的冗余机制，例如，与西斯特多能性程序的抑制[18,20]，或者可以简单地反映维持甲基转移酶活性Dnmt1足以将启动子甲基化保持在规定水平。

假设西斯特启动子甲基化在X失活开始之前确实是反义的结果Tsix公司我们可以设想两种可能的机制。要么Tsix公司直接招募从头开始Dnmts、Dnmt3a和Dnmt2b，正如之前针对Dnmt3a提出的建议[6]，或者也可以Tsix公司可能介导其他染色质变化西斯特启动子，例如如前所述降低H3K4甲基化[三]，DNA低甲基化是次要后果。虽然我们目前无法区分这些可能性，但有趣的是，H3K4甲基化对抗Dnmt3a/Dnmt3G二聚体与核小体的结合[39]，为DNA低甲基化提供了一种可能的机制Tsix公司-介导H3K4甲基化水平的降低。在该模型的背景下，上游异源或隐蔽启动子增加的有义转录可能拮抗西斯特启动子甲基化通过局部增加H3K4甲基化水平。

结论

我们已经证明了在西斯特启动子可以在随机X失活开始之前调节DNA甲基化水平，为突变体中改变有义或反义RNA水平的偏斜X失活模式提供了机制基础。我们继续研究RNAi途径的可能参与。我们对Dicer-deficient ES细胞的分析表明西斯特启动子低甲基化，但这似乎是Dnmts水平降低的次要后果。与此一致，适当西斯特/尖峰Dicer-null胚胎中出现了表达模式。基于这些观察结果，我们得出结论，哺乳动物X染色体失活可能不需要RNAi途径。

方法

ES细胞系的衍生与维护

Dicer公司^{液氧/液氧}通过两种方法从E3.5胚胎的ICM中获得ES细胞系。在第一种方法中，ES细胞系来源于纯合子为Dicer公司^液氧等位基因。已建立的Dicer公司^{液氧/液氧}随后用pCAG-Mer-Cre-Mer质粒对XY ES细胞系D41进行脂质体感染，携带三苯氧胺诱导的Cre重组酶。用800nM 4-羟基他莫昔芬（4-OHT，Sigma）处理克隆D41D3Cre（D3Cre），以克隆密度铺板，并挑选、扩增单个菌落，然后通过基因组PCR检测Dicer RNase III结构域的缺失。三个克隆S5、S6和E5被鉴定为Dicer RNase III漂浮盒缺失。

在第二种方法中，ES细胞系来源于纯合的小鼠Dicer公司^液氧靶向Rosa26基因座的三苯氧胺诱导的Cre重组酶的等位基因杂交到动物，无论是纯合子还是杂合子（来自Artemis Pharmaceuticals[33]). 用800 nM 4-OHT处理两个衍生的亲本XY ES细胞系DTCM23和DTCM49，并在克隆密度下进行电镀。针对RNase III漂浮盒的丢失，对单个克隆以及大约200–250个克隆的池进行了基因分型。选择Dicer-deficient克隆DTCM23ΔE3、ΔF4、DTCM49ΔA1和ΔE2以及一组Dicer-eficient无性系DTCM23△pool进行进一步分析。

在添加了10%胎牛血清（FCS，Autogen Bioclear）、7%敲除血清替换物（KSR）、2 mM L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、50μM 2-巯基乙醇、，50μg/ml青霉素/链霉素（均来自Invitrogen）和LIF条件培养基，室内制备，浓度相当于1000 U/ml。细胞在37°C、含5%CO的潮湿环境中生长₂.

甲基化敏感限制性内切酶分析

Dicer公司^{液氧/液氧}将缺乏的ES细胞预先电镀30分钟，以尽量减少饲养细胞污染，然后培养2-3天，直到在涂有0.1%明胶的平板上汇合。基因组DNA采用标准程序提取苯酚/氯仿。使用引物SEQ28290（agtaatgtgagcatagtcccag）、Di31831（agtgtagcttagccattgc）和Di32050AS（ctggtggcttgaggacacac）以及以下PCR条件，通过PCR确认每种制剂的基因型：95°C，4分钟；（95℃持续30秒；60℃持续30秒钟；72℃持续30秒内）×35个循环。在2.5%琼脂糖凝胶上解析PCR片段，得到259 bp的wt等位基因片段、390 bp的floxed等位基因片段和309 bp的Dicer公司零等位基因（见图3B公司).

根据制造商的说明，使用EcoRI或BamHI限制性内切酶消化基因组DNA，在TE缓冲液中沉淀乙醇并重新溶解（10 mM Tris，pH 8.0；1 mM EDTA）。使用甲基化敏感酶，将10μg DNA等分样品重新稀释，在1%琼脂糖凝胶上通过电泳分离，并在GeneScreen尼龙过滤器（Perkin Elmer Life Sciences）上进行印迹。与混合西斯特探针3（相对于西斯特启动站点P₁)如前所述执行[40]. 在荧光成像仪（分子动力学）上收集图像，并使用ImageQuant软件（分子动力学（Molecular Dynamics））进行碎片强度定量。

序列甲基化分析

基因组DNA的提取方法与甲基化敏感Southern分析相同。我们使用EZ DNA甲基化试剂盒（Zymo Research）对亚硫酸氢盐处理2μg等分的高分子量DNA。基本上按照制造商的说明进行处理，并对转换步骤进行了修改，包括在以下条件下进行20次样品处理循环（95°C 30秒；50°C 15分钟）。在柱上纯化转化的DNA，并在100μl水中洗脱。我们每25μl PCR反应使用5μl样品。

HotStarTaq DNA聚合酶试剂盒（Qiagen）用于扩增修饰的DNA和PCR引物，所用条件如表所示1PCR片段被送往SEQUENOM GmbH公司（德国汉堡）在体外使用EpiTYPER软件进行转录和随后的MALDI-TOF质谱分析[30].

表1亚硫酸氢盐甲基化分析的引物和聚合酶链反应（PCR）条件

RT-PCR分析

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Sigma）从ES细胞中分离RNA。RNA常规用Turbo DNA-free试剂（Ambion）处理，以排除DNA污染的可能性。cDNA合成由随机六聚体（GE Healthcare）用Superscript III逆转录酶（Invitrogen）启动。链特异性RT-PCR西斯特根据前面描述的方法，执行放大器4、5、51和51mut[13]. 表中给出了引物和PCR条件2.

表2定量逆转录PCR的引物和聚合酶链反应（PCR）条件

使用SYBR Green PCR Master Mix（Bio-Rad）在Chromo4实时PCR系统（Bio-Rad）上进行实时PCR。PCR引物和条件列于表2在每个实验结束时进行熔融曲线测试，以确保扩增的特异性。将数据归一化为β-肌动蛋白和Idh2，然后归一化为该组中的一个对照样本。每个扩增子在独立的cDNA制备物上至少分析两次，一式三份。

Northern印迹分析

使用TRIzol试剂分离的总RNA（20–30μg）在15%的含脲凝胶上通过PAGE分离。使用Bio-Rad半干印迹仪以2.1 mA/cm的恒定电流将RNA转移到Hybond-XL尼龙膜上²持续1小时。该膜在Stratagene UV交联剂中与1000μJ进行UV交联，并与³²P-dCTP标记mi292as探针。该图像是在荧光成像仪上采集的。

RNA FISH分析

RNA FISH如前所述进行[7,41]. 对西斯特一个18 kb的DNA片段西斯特转录物，使用二氧杂合素-16-dUTP缺口翻译混合物（Roche）标记，并用绵羊（Roches）中培养的抗低氧荧光素异硫氰酸盐（AD-FITC）抗体检测，然后用抗羊荧光素异硫氰酸酯（FITC）抗体检测（Vector Laboratories）。使用LAS AF软件在徕卡TCS SP5共焦显微镜上采集图像。

对于全量RNA，FISH E6.5胚胎是通过小鼠杂合杂交获得的Dicer公司RNase III域删除。从子宫中分离胚胎，在预冷磷酸盐缓冲液（PBS）中冲洗，并在细胞骨架（CSK）缓冲液中在冰上渗透10分钟。在整个过程中，清洗是在冰上保存的3厘米培养皿中进行的。胚胎在4%甲醛中冰上固定15分钟，然后在预冷的PBS中冲洗。所有上述溶液都包括0.1%吐温-20（Sigma），以防止胚胎粘连。然后通过乙醇系列（70%、80%、90%、100%）脱水胚胎。该程序是在带有凹陷（VWR）的玻璃载玻片上进行的。最后一次脱水清洗后，蒸发乙醇和15μl含有DIG标记的杂交溶液西斯特和生物素化Tsix公司立即加入探针。载玻片上覆盖有盖玻片，并用橡胶水泥密封，杂交在37°C下进行了一夜。这个西斯特探针是全长的西斯特cDNA和Tsix公司探针是一个4.6 kb的EcoRI片段Tsix公司主要起始地点。杂交后清洗如前所述[41]经过修改，包括在所有溶液中添加0.1%吐温-20。这个西斯特用绵羊（罗氏）的AD-FITC抗体检测探针，然后用抗羊FITC抗体（Vector Laboratories）检测探针Tsix公司探针是用亲和素-Texas红（AV-TR）检测的，随后是生物素化抗亲和素抗体，然后是AV-TR。除非另有说明，所有抗体均来自Vector Laboratories。使用LAS AF软件在徕卡TCS SP5共焦显微镜上采集图像。成像后，通过PCR对每个胚胎进行基因分型，以确定性别和Dicer公司基因型。

西方分析

如前所述进行Western blot分析[31]进行了一些修改。简单地说，蛋白质在8%SDS-PAGE凝胶上分离，并在1×转移缓冲液（48 mM Tris，39 mM甘氨酸，0.037%SDS，20%甲醇）中以100 mA/凝胶的速度转移45分钟，使用Bio-Rad半干印迹仪。Dnmt3a抗体（工作稀释度1:250）和Dnmt2b抗体（WD 1:300）来自Alexa Biosciences；Dnmt1抗体（WD1:250）来自Abcam；LaminB抗体（WD 1:2000）来自圣克鲁斯。按照制造商（GE Healthcare）的建议执行增强化学发光检测。

所有的老鼠工作都是根据1986年《动物（科学程序）法案》中英国内政部的规定进行的。