早老蛋白突变相关痴呆患者的组织病理学和分子异质性

摘要

背景

早老素的突变(PSEN公司)基因与早发家族性阿尔茨海默病（FAD）相关。生化特征和比较表明，许多PSEN突变改变γ-分泌酶活性，促进有毒Aβ42肽的积累。在本研究中，我们比较了10例表达独立PSEN突变的FAD病例的组织病理学和生化特征，并通过γ-分泌酶测定了淀粉样β前体蛋白（AβPP）、Notch、N-钙粘蛋白和Erb-B4的降解模式。此外，通过ELISA定量Aβ40/42肽的水平。

结果

我们观察到淀粉样沉积物和神经纤维缠结的类型、数量和分布有很大差异。在检查的10例病例中，有4例显示aβ40相对于aβ42的相对比例显著增加。通过Western blots和扫描密度测定法评估的AβPP N端和C端片段以及Tau物种也显示出广泛的差异。7例PSEN患者的Notch-1胞内结构域经Western印迹可忽略不计。不同PSEN突变之间存在显著的N-cadherin和Erb-B4肽异质性。

结论

这些观察结果表明PSEN公司基因可以改变一系列关键的γ分泌酶活性，从而产生一系列细微不同的生化、神经病理学和临床表现。除了痴呆、斑块和缠结的广泛共同特征外，各种PSEN突变导致了广泛的异质性和复杂性，并与散发性AD不同。

背景

早老素-1的突变(PSEN1公司)和早老素-2(PSEN2公司)基因导致家族性早发性和侵袭性阿尔茨海默病（FAD）。在人类中PSEN1公司和PSEN2公司基因分别位于第14号染色体和第1号染色体上，编码具有65%氨基酸序列同源性的蛋白质[1]. 早老素-1和PSEN2分别长467和448个氨基酸，具有九个跨膜结构域（TMD），其中两个（TMD6和TMD7）在257和385位含有催化性天冬氨酸残基，形成内蛋白水解所需的活性中心[2,三]. 超过150个突变PSEN1公司和PSEN2公司已报告http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations网站). 早老素是γ分泌酶的一部分，γ分泌酶是一种异四聚天冬氨酸膜结合蛋白酶复合体，由四个相互作用的分子组成：PSEN、尼卡司汀、前咽缺陷1（Aph1）和早老素增强子2（Pen2）[4–6]. 近年来γ-分泌酶的生化和功能表征（参考文献综述[7])有助于更好地理解疏水TMD的水解及其副产物的重要功能作用。γ-分泌酶与25种以上不同底物相互作用，因此可能参与广泛的细胞功能[8–11].

γ-分泌酶的众多重要底物之一是淀粉样β前体蛋白（AβPP），这是一种1型膜结合分子，通过β-和γ-分泌酶类的作用降解，生成40/42氨基酸的淀粉样β（Aβ）肽。γ-分泌酶还水解ε位点的AβPP，生成转录因子Aβ胞内结构域（AICD）[12]. 在AD中，Aβ肽沉积在脑实质和脑血管壁中。绝大多数FAD是由AβPP和PSEN公司基因与散发性AD（SAD）中观察到的神经病理学相同，通常包括淀粉样斑块和脑淀粉样血管病，以及由过度磷酸化tau组成的神经纤维缠结（NFT）。人们普遍认为PSEN公司基因通过影响AβPP加工优先产生Aβ42而导致AD[13]. 此外，由于PSEN突变导致的FAD临床发病早期似乎与Aβ42生成增加和Aβ40生成减少相关[14]. 此外，在转基因小鼠和培养细胞中，PSEN突变似乎比Aβ40产生更多的Aβ42[15–22]. PSEN突变导致的Aβ42/40比率增加被描述为“毒性功能增强”[23]. 然而，在最近的一份出版物中，转染组织培养细胞中的几个PSEN突变分泌的aβ40多于aβ42[24]. 此外，大多数PSEN突变显示AβPP和多种其他底物上的蛋白水解活性降低，这种表型被认为是“功能丧失”[25]. 有趣的是，最近已经证实，小鼠PSEN1和PSEN2功能的完全丧失会导致类似于AD中观察到的严重神经退行性变，但没有淀粉样蛋白病理[26].

微管相关蛋白tau的高磷酸化形式是NFT的主要成分，代表SAD和FAD的病理特征之一。对NFT的详细化学分析表明，有大量的脂肪酸、糖脂和神经节苷脂，表明其来源与膜有关[27–30]. 电子显微镜研究表明，成对螺旋丝（PHF）密切相关，可能来源于大量变性细胞膜，如滑面内质网、高尔基体和线粒体[31,32].

γ-分泌酶水解的多种蛋白质之一是Notch-1，一种2532氨基酸跨膜I型蛋白质（瑞士-普罗特：P46531）。在人类中，Notch家族包含四个高度保守的分子（Notch1-4）。Notch是一种异二聚体受体，参与多种复杂的信号通路，包括神经功能和发育、心血管稳态、血管生成和细胞再生[33–35]. Notch功能障碍会导致大量发育缺陷和成人疾病，如不同类型的癌症[36]. 与AβPP降解平行，Notch-1在S2位点被跨膜ADAM/TACE蛋白酶裂解，释放分子的胞外N末端区域，该区域与对立细胞上的Delta型配体结合。与AβPPγ/ε位点类似，在靠近细胞膜双层细胞质表面的S3和S4位点，Notch被γ分泌酶裂解，释放Notch-1细胞内结构域（NICD）。这个80kDa的C末端片段被转位到细胞核中，在那里它激活无处不在的转录因子复合体CBF1/无毛/拉格1抑制因子（CSL），以增加大量基因的表达[37–40].

N-钙粘蛋白（一种促进神经细胞粘附的分子）的蛋白水解降解也由γ-分泌酶介导。N-cadherin是一种881氨基酸I型跨膜钙依赖分子（Swiss-Prot:P19022），具有五个细胞外钙粘蛋白重复序列和一个短的高度保守的细胞质尾部，通过连环蛋白分子与肌动蛋白细胞骨架相互作用[41,42]. N-钙粘蛋白在细胞粘附、胚胎发生、分化、迁移、侵袭、信号转导、神经元生长控制、突触构型和神经可塑性中的作用[43–45]. PSEN1对N-cadherin的裂解导致N-Cad/CTF2的生成，N-Cad/CTF2与转录共激活因子CBP（CREB结合蛋白）形成复合物以抑制转录。有研究表明，PSEN突变导致N-Cad/CTF2生成减少，CBP/CREB介导的转录活性和FAD增加[46].

早老素的另一个重要底物是Erb-B4，它是1283个氨基酸的I型分子（Swiss-Prot:Q15303），也是构成酪氨酸激酶家族一部分的表皮生长因子（EGF）受体的成分[47]. Erb-B4参与多种细胞功能，如有丝分裂、分化、生长抑制和存活[48]. 肿瘤坏死因子转换酶对Erb-B4的裂解产生~80kDa片段，随后被γ-分泌酶水解，产生作为转录因子的细胞质域（B4ICD）[49–52]. 关于AβPP代谢，最近的数据表明内源性AICD能够与EGF受体基因的启动子结合[53]. 在这一连串事件中，重要的是神经调节蛋白（NRG），这是一组神经营养因子，通过激活Erb-B受体控制组织发育、神经元存活、突触发生、小胶质细胞激活、星形细胞分化和少突胶质细胞存活[54–56]. 在SAD中，NRG和Erb-B4均与神经炎斑块相关[54].

在本研究中，我们比较了9例独立PSEN1和1例PSEN2 FAD病例、4例SAD病例和2例非痴呆（ND）对照组的神经病理学和生化结果。对不同类型的Aβ斑块和NFT及其相对丰度进行了形态学描述。我们测定了Aβ40和Aβ42肽水平，以及AβPP N端和C端肽和可溶性tau的加工模式和相对数量。我们还研究了PSEN突变之间的差异，以及PSEN组与SAD或ND对照组之间关于Notch-1、N-cadherin和Erb-B4的差异，这些分子被γ-分泌酶复合物裂解。这些差异可能反映了特定PSEN突变对早老素参与的多条通路的影响。PSEN突变之间的显著差异可能是由于PSEN氨基酸替换的位置和性质，以及这些突变对参与神经元、胶质细胞和脑血管稳态的多个分子的影响。

材料和方法

人体组织与神经病理学

10名携带以下PSEN突变的个体的大脑被切除；（PSEN1:A79V、A260V、F105L、Y115C、A431E、V261F、V261I、M146L和P264L，以及PSEN2:N141I），来自4例SAD患者和2例ND患者。PSEN1/2突变、SAD和ND对照受试者的平均死亡时间间隔（PMI）分别为12.3 h、10.8 h和3.5 h。ND对照组和SAD/PSEN患者之间PMI的差异是由于组织获取的位置不同。ND对照来自太阳健康研究所的大脑库，其平均PMI为2.75小时，部分原因是一个轮换团队每天24小时随时待命，死亡发生在与该研究所相同的社区[57]. 然而，由于多种原因，其他中心无法缩短这些时间。特别是，PSEN大脑是从具有不同内部程序和时间标准的不同实验室获得的，必须用干冰运送到印第安纳州阿尔茨海默病中心。在这三个队列中，PSEN组的平均死亡年龄为53岁，SAD组为64岁，ND组为80岁。PSEN突变受试者的平均发病年龄为45岁，SAD患者为52岁。尝试使用年轻SAD个体与PSEN受试者进行比较。

在PSEN组中，5名个体为女性，5名为男性。在SAD队列中，三名受试者为男性，一名个体为女性。在ND对照组中，有一名男性和一名女性。每个病例的左半球固定在10%福尔马林中，而右半球冷冻用于遗传和生化研究。固定的大脑半球被切成冠状切片。为了进行组织学分析，每个病例都从伏隔核水平的切片上采集了额叶上回和扣带回的样本，对应于用于生化分析的对侧半球冰冻组织切片。组织在分级酒精系列中脱水，用二甲苯清除并用石蜡包埋。切片（8μm）按照以下方法进行处理：Weigert、苏木精-伊红、Woelcke-Heidenhain、Bodian和硫黄素-S。免疫组化研究使用一组不同的抗体。其中包括抗Aβ1-5的单克隆抗体3D6（加州旧金山Elan公司）、抗Aβ3-6的单克隆10D5（Elan公司。如前所述，额叶皮质淀粉样β免疫反应性沉积物可分为不同的形态类型，如棉毛斑块（CWP）、成熟斑块、原始斑块和弥漫性斑块[58,59]. 淀粉样斑块和NFT在三个随机选择的非重叠1mm范围内计数²微观领域。

AβELISA

用电动研磨机将脑组织灰质均匀化于10倍体积的90%玻璃蒸馏甲酸（GDFA）中。匀浆以500000×克在使用120.2转子的Beckman Optima TLA超离心机中，在4°C下保持20分钟（加利福尼亚州Fullerton Beckman）。收集上清液并用5M盐酸胍、50mM盐酸Tris-HCl、pH 8.0的溶液透析。使用分别来自免疫生物学实验室（明尼阿波利斯，明尼苏达州）和Innogenetics（比利时根特）的抗Aβ40和抗Aβ42试剂盒，通过ELISA对样品进行分析，并按照制造商的说明进行。

Western Blot分析

脑组织在10倍体积的RIPA缓冲液（西格玛，密苏里州圣路易斯；150 mM NaCl，1.0%IGEPAL）中均质^®CA-630，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS 50 mM Tris，pH 8.0），含蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏诊断公司，德国曼海姆），4°C。匀浆在14000×克在Beckman Microfuge 22R离心机中，在4°C下保持20分钟。收集上清液，并使用BCA蛋白检测试剂盒（伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯）对总蛋白进行定量。将样品置于含有50 mM二硫苏糖醇的NuPage 2×LDS样品缓冲液（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，并在80°C下加热10分钟。蛋白质在4–12%双三凝胶上电泳，NuPage 2-吗啉乙磺酸（MES）作为流动缓冲液（Initrogen.）。然后用NuPage转移缓冲液（Invitrogen）和20%甲醇将蛋白质转移到0.45μm孔径的硝化纤维素膜（Invit罗gen）上。用5%的非脂肪乳在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中封闭膜，0.5%的吐温20（密苏里州圣路易斯弗卢卡）。表1描述了实验中使用的一级和二级抗体。用SuperSignal WestPico化学发光底物（Pierce）、CL-X胶卷（Pierse）和柯达GBX显影剂（Sigma）对蛋白质进行可视化。使用GS-800校准密度计（加州Hercules的Bio-Rad）和Quantity One软件（Bio-Read）对胶片进行扫描和分析。用Restore™Western印迹剥离缓冲液（Pierce）从膜上去除抗体。在PBS中清洗污渍，然后用5%的PBS中的非脂肪乳和0.5%的吐温20（密苏里州圣路易斯市弗卢卡）进行封闭。按照上述技术，使用抗鼠或抗兔肌动蛋白抗体作为蛋白质归一化标准对膜进行再probe。直方图中的所有值都已根据本研究中显示的所有WB密度中的肌动蛋白丰度进行了校正。

表1 Western Blots中使用的一级和二级抗体

载脂蛋白E基因分型

载脂蛋白E的DNA(APOE公司)从大脑皮层片段中提取基因分型[60]. 组织（50 mg）用蛋白酶K（1 mg/ml）在55°C下消化至完全，并使用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒（Promega，Madison WI）纯化。对于每个PCR反应，使用每个样本中约500 ng的DNA。PCR引物和扩增条件的使用，以及APOE公司根据公布的方案，通过HhaI限制性内切酶消化扩增材料进行基因型分析[61]. 识别APOEε等位基因和消化片段通过9%丙烯酰胺凝胶电泳分离，并在溴化乙锭染色凝胶上显示。

结果

I.可溶性Aβ和tau的神经病理学表现和特征

本研究中检查病例的最相关人口统计学数据和神经病理学特征的描述如表所示2在PSEN突变和SAD病例中，神经元丢失和胶质增生的程度从轻到重不等。两名ND对照个体（81岁女性和79岁男性）没有明显的大脑萎缩，淀粉样斑块数量稀少，NFT和Braak分数低，为I（范围I-VI）。PSEN突变和SAD患者的平均脑重分别为1042 g和1143 g，而ND患者的平均大脑重量为1180 g。在PSEN突变组中APOE公司等位基因频率为ε2=0.10、ε3=0.80和ε4=0.10，而SAD组为ε2=0.、ε3=0.62和ε4=0.38（表2). 两名ND患者的ε2/ε3和ε3/εAPOE公司基因型。

表2患者信息和神经病理学数据

表中给出了PSEN突变病例和SAD病例大脑皮层中不同类型和数量的神经病理学发现的定量比较2其形态的代表性显示如图所示1在4例患者中，棉花-羊毛斑块（CWP）是Aβ沉积最丰富的类型PSEN1公司突变：A431E、V261F、V261I和P264L。它们在整个皮质层中都能观察到，尽管它们在上层更为丰富。这些斑块的直径从A431E、V261F和P264L病例的平均80-90μm到V261I病例的145μm不等。他们的平均频率约为40-50个斑块/mm²在A431E、V261F和V261I突变中。P264L突变病例显示CWP数量减少（平均14/mm²)与其余病例相比，其Aβ沉积负担总体降低。SAD组和PSEN1突变的病例（A79V、A260V、F105L、Y115C和M146L）以及PSEN2 N141I突变的病例的上额回和扣带回均未观察到CWP。

图1

PSEN突变中淀粉样沉积物的组织学和免疫细胞化学.A）用10D5抗体免疫反应的PSEN2 N141I突变原始斑块。B） PSEN1 A431E突变中的棉毛斑块与21F12免疫反应。右上角有一块成熟的斑块。C） 和PSEN1 A260V突变相关的棉毛斑块用10D5抗体免疫反应。D） 在PSEN1 A79V突变中观察到成熟的神经炎斑块。10D5抗体。E） 原始斑块定位于与10D5抗体免疫反应的PSEN1 A79V突变的大脑皮层。F） 低倍镜下，PSEN1 V261F突变的皮质淀粉样斑块与10D5抗体免疫反应。除了严重的淀粉样血管病外，还观察到大量CWP和偶尔的成熟核心神经炎斑块。G） PSEN1 V261F突变中的棉毛斑块是用10D5抗体形成的。H） 在PSEN1 V261F中观察到丰富的CWP，通过血锡蛋白和曙红染色。斑块周围有少量反应性星形胶质细胞。在该领域的其余地区，观察到一些严重的神经元丢失和乙醛沉积，以及适度的微血管化。一） 严重的Aβ免疫反应性脑淀粉样血管病的大脑皮层中PSEN1 A431E突变。J） PS1 431E突变的大脑皮层苏木精和伊红染色切片。放大倍数：63×（A、B、C、D、E、G）；40×（I和J）；20×（H）和10×（F）。比例尺=20μm。

弥漫性斑块主要存在于中间皮质层，是aβ沉积的常见类型。在不同的突变中，它们的丰度差异很大。A260V突变中数量最多（平均109个斑块/mm²)和M146L突变（102个斑块/mm²)，但V261F或V261I突变病例稀疏（~2斑块/mm²). 在PSEN1突变A79V、A260V、F105L、Y115C和M146L以及PSEN2 N141I突变中，弥漫性斑块是Aβ沉积的主要类型。P264L突变病例显示了相似数量的CWP和弥漫性斑块。SAD组的平均斑块数为19.8个/mm²弥漫性斑块（范围12.00–30.67）。

在所有皮质层都观察到成熟的核状神经炎斑块，但在较低的皮质层更常见。不同突变的频率不同，A431E和M146L PSEN1突变的频率较高，其余病例的频率较低。与CWP和弥漫性斑块相比，神经炎性斑块的发病率较低，并且与Aβ沉积的总体负荷大致相关。仅在V261F或V261I突变的病例中很少观察到它们。总的来说，原始斑块仅在PSEN1 A79V突变中大量存在，在Y115C和A431E PSEN1突变的上皮层也有少量。SAD队列中未发现原始斑块，而成熟斑块平均为19.3斑块/mm²（范围5.67–36.67/mm²).

NFT的数量与Aβ沉积的总负荷密切相关。9例PSEN患者表现为中度至重度神经纤维变性（平均NFT值=31.8/mm²; 范围14.3至65/mm²)除V261I突变外，在该突变中观察到稀疏的NFT。SAD病例中观察到类似值（平均NFT值=29.0/mm²; 范围6.3至55.3/mm²). NFT数量与病程呈负斜率相关（R=0.70）。

大脑皮层中Aβ水平的量化显示，在十分之四的PSEN突变中，Aβ40的含量高于Aβ42（表三和图2). 具有A431E、V261F、V261I和M146L突变的早老素-1患者的Aβ42/Aβ40比值小于1.00，前者比后者更显著（0.28和0.18对0.43和0.68）。在一个案例（F105L）中，比率接近1:1（表三). 在四分之二的SAD病例中发现了类似的模式（Aβ42/Aβ40比值为0.61和0.90）。上述四例PSEN突变病例的皮质血管淀粉样蛋白得分分别为2、3、2和1（表2)，其中得分1、2和3分别对应轻度、中度和重度血管淀粉样沉积。此外，在这四例PSEN病例中，有三例的CWP值最高，其余个体（M146L）的弥散性沉积物数量较高（102个/mm²)和成熟斑块（14.00/mm²)（表2). 除PSEN病例A79V和P264L（组织切片中可见非常轻微的皮质血管淀粉样蛋白）外，所有PSEN病例的灰质都有轻度至中度淀粉样蛋白血管病。只有V261F患者出现严重的皮质淀粉样血管病。然而，对所有PSEN突变病例中分离出的软脑膜血管的检查显示，广泛的血管淀粉样变，如图所示三从中度（2例）到中度/重度（1例）到重度（5例）。与皮质血管淀粉样蛋白评估一致，病例A79V和P264L的软脑膜血管淀粉样物质含量可以忽略不计（数据未显示）。SAD患者的皮质血管淀粉样蛋白含量从无到中等不等。两例ND患者出现轻度CAA。此外，我们发现在PSEN队列中，大脑Aβ40水平与血管淀粉样变程度之间存在正相关（R=0.81）。

图2

描述ELISA检测到的Aβ40和Aβ42相对量的直方图注意PSEN A431E、V261F、V261I和M146L中的大量Aβ40。F105L的Aβ40和Aβ42的含量几乎相等。PSEN=早老素；SAD=阿尔茨海默病；ND=非痴呆。

图3

软脑膜血管的硫黄素-S组织化学.用硫黄素-S染色的全部软脑膜血管显示不同PSEN突变中的淀粉样血管病。A） PSEN1 M146L：中等；B） PSEN1 V261I：严重；C） PSEN2 N141I：严重。D） PSEN1 V261F：严重；E） PSEN1 A431E：严重；F） PSEN1 Y115C：中等；G） PSEN1 F105L：重度，H）PSEN1 A260V：中度-重度。其余两个PSEN1突变A79V和P264L有轻度淀粉样沉积（数据未显示）。比例尺=500μm。

表3 AβELISA值

总的来说，9个PSEN1和1个PSEN2突变以及用作病理对照的4个SAD病例中，不同类型斑块的神经病理学分布、脑血管淀粉样蛋白的强度和NFT的数量存在显著差异。表中给出了这些参数的详细说明2和数字1和三.

Tau抗体检测显示了一系列范围为~110至~28 kDa的条带（图4)，代表正常和PHF-tau[62]. 在十分之七的PSEN突变中，有对应于tau二聚体形式的条带（约100–110 kDa）。一般来说，PSEN突变表明相对于ND对照组，可溶性tau蛋白的数量增加，但~28和~57 kDa带除外（图4). PSEN A79V和V261I突变在神经病理学检查中显示出低NFT计数（表2)和WB上有相对适量的可溶性τ肽，并且缺少~100–110 kDa（二聚体）肽（图4). A260V突变的病例也缺失了约100–110 kDa肽，其平均NFT量为31.00/mm²)（表2). NFT得分最高的PSEN病例（A431E、V261F和N141I；表2)WB也观察到二聚体τ的水平最高（图4).

图4

扫描密度法定量可溶性τ亚型的蛋白质印迹可溶性tau亚型的总量在不同的PSEN突变和SAD病例之间以及在ND对照中显著变化。大多数tau蛋白集中在~60~40 kDa之间。一般来说，PSEN突变中的tau蛋白比ND对照中的多。在ND对照组中缺失的10个PS突变中，有7个在~100–110 kDa处有显著条带。同样，在4例SAD病例中有3例出现这种条带，而在ND对照组中没有。这些带可能对应于τ的二聚体形式。SAD=散发性阿尔茨海默病；ND=非痴呆。

二、。AβPP、Notch、N-钙粘蛋白、Erb-B4加工的表征

WB对AβPP的N端和C端肽降解进行了研究（图5). 与ND对照组相比，22C11抗体检测到的AβPP总量（约110 kDa）在PSEN突变中大约增加了两倍。SAD患者的总AβPP与ND对照组相同或略高（图5A级). 在ND病例中，28和25kDa的肽带很微弱，PSEN突变普遍显著升高，表明N末端肽的积累更大。与ND对照组相比，在SAD患者中观察到不同数量的N-末端肽。CT9APP抗体检测到的C末端（CT）肽表明，与ND对照组相比，PSEN突变和SAD病例中CT99/CT83条带的积累更大。相反，SAD患者的CT肽含量高于ND和PSEN队列中观察到的CT肽（图5亿). 与ND对照组和PSEN患者的CT肽水平相比，AβPP水平升高。SAD组的这一比率与之相反（图5亿). 有趣的是，我们的实验室在其他FAD、SAD、ND对照组和我们目前正在研究的转基因小鼠中常规观察到一条~40 kDa的带。

WB对Notch-1的分析表明，由于~80kDa NICD的水平很低，因此在10个PSEN突变中的7个中S3的断裂可以忽略不计。然而，我们不能排除碎片更替更快导致稳态水平降低的可能性。与ND对照组相比，其余三例患者中的两例（P264L和N141I）表现出较少的80kDa NICD，而其余病例（Y115C）的值与ND控制组相当（图6A级). SAD中NICD肽的检测量非常不均匀。在一个案例中，只出现了微量的NICD。在两个病例中，该肽的水平低于ND对照组，而在一个个体中，该水平高于ND对照（图6A级).

图5

AβPP及N端和C端相关肽的蛋白质印迹A）与ND对照组相比，所有PSEN突变中AβPP全蛋白（110 kDa）和28和25 kDa条带的数量均增加。SAD中的110 kDa（AβPP）几乎等同于ND病例，但就28和25 kDa谱带而言是可变的。B） 在我们的SDS-PAGE系统中，CT99和CT83以~14kDa的单带共存迁移。可以理解，ND对照组的CT肽明显少于PSEN和SAD病例。此外，AβPP（110 kDa）在PSEN病例和ND对照组之间是可变的，但SAD病例与ND对照相比有所下降。SAD=散发性阿尔茨海默病；ND=非痴呆。

图6

80kDa Notch-1细胞内结构域（NICD）和N-钙粘蛋白/CTF2的蛋白质印迹A）注意，除了3个PSEN突变病例（Y115C/PSEN1、N141I/PSEN2和P264L/PSEN1）外，所有PSEN突变都减少了NICD转录因子的数量。在SAD病例中，与ND对照组相比，NICD的分布不均匀，一例SAD病例几乎可以忽略不计，另一例升高，其余两例降低。B） 与ND对照组相比，在所有PSEN病例中，在110 kDa时检测到的N-Cadherin全蛋白量都减少。SAD病例也观察到类似的模式。在所有PSEN突变中，28kDa的N-Cad/CTF2带均降低，但A260V和M146L突变除外，它们显示出更高的值。相对于ND水平，SAD中N-Cad/CTF2的数量是可变的。SAD=散发性阿尔茨海默病；ND=非痴呆。

我们的WB数据显示了全长N-钙粘蛋白（110kDa）和CT片段（28kDa[46,63,64]. 与ND对照组相比，所有PSEN突变携带者以及SAD患者的全长N-钙粘蛋白水平均降低（图6亿). 除了两个PSEN1突变（A260V和M146L）外，其余PSEN突变和两个ND对照显示了不同数量的~28kDa肽。在SAD队列中也观察到了这种模式（图6亿).

WB显示，与ND病例相比，PSEN突变中Erb-B4（~180kDa）的总水平降低。在SAD队列中观察到类似的模式（图7). 在PSEN和SAD患者中，~60kDa肽减少。最显著的带（~55kDa）在PSEN突变和ND对照中显示出可变数量。F105L和P264L病例的~50kDa谱带含量最高，其余PSEN病例和ND对照组的含量相似。在大多数PSEN突变中，~40 kDa带减少了2-10倍，而~30 kDa-肽具有异质值（图7). 我们自己和其他人的吸收实验（数据未显示）[65,66]，表明这些片段是Erb-B4的特异性片段。总的来说，WB模式表明，在PSEN突变中，Erb-B4在CT肽降解方面具有高度的变异性（图7).

图7

Erb-B4的蛋白质印迹总的来说，所有PSEN突变以及与ND对照组相关的SAD病例中与全蛋白（~180kDa）和~60kDa相对应的条带均减少。在携带Erb-B4 C-末端表位的降解肽中，最具代表性的带位于~55kDa，在不同的PSEN突变中表现出异质性水平。在SAD病例中，数值与控制水平更为相似。在PSEN、SAD和ND对照组中，~50和~30 kDa肽带也显示出较大偏差。与PSEN和SAD病例相比，ND对照组的~40kDa带增加。SAD=散发性阿尔茨海默病；ND=非痴呆。

讨论

所研究的10个PSEN突变中最显著的特征之一是其临床发病年龄早（平均44.7岁，范围35-60），这证实了之前的观察结果（参考文献中回顾[67]). 研究中使用了较年轻的SAD个体（平均年龄：64岁，范围：55-73岁），以便使比较更加等效。不同PSEN突变在疾病持续时间、脑萎缩程度、神经元丢失、皮质和软脑膜血管淀粉样变以及淀粉样斑块的基本类型、数量和分布方面表现出明显的异质性。同样，NFT在10个PSEN突变个体中的数量和分布也表现出广泛的变异。这些截然不同的病理表现表明PSEN公司由于复杂的多效性效应，基因导致与每个不同PSEN突变相关的表型变异。

人们普遍认为，PSEN突变的主要病理效应是毒性aβ42的比例增加[15–22]. 在我们的研究中，6例PSEN突变病例中观察到的高Aβ42/Aβ40比率支持了这一假设。然而，在四种情况下，PSEN突变导致Aβ40水平显著高于Aβ42水平。就大脑皮层的平均ng/g而言，PSEN突变的Aβ40（7093）显著高于Aβ42（4856），而SAD患者的Aβ402627低于Aβ423322，ND患者的Aα40（42）和Aβ42132含量都很低。这些差异可能在一定程度上是由于大量的脑血管淀粉样变，其中aβ40沉积占主导地位。然而，以前的PSEN研究中，Aβ42/Aβ40的比率升高，大多是在细胞培养物或表达突变的小鼠中进行的PSEN公司基因[23]. 血管淀粉样变通过改变血脑屏障通透性和阻塞小血管在PSEN痴呆、FAD和SAD中起基础病理作用。在较大的动脉中，它会破坏中膜，导致顺应性下降，从而降低脑灌注。此外，严重的血管周围淀粉样蛋白沉积会阻塞动脉周围间隙，从而将大脑间质液体排入全身循环，导致动脉周围间隙扩张、脑水肿和严重的血流动力学改变[68,69]. PSEN突变病例中分离的软脑膜也显示淀粉样血管病的广泛变异。

我们观察到APOE公司ε4等位基因出现在SAD中，表明该等位基因可能在PSEN表型中不起关键作用。然而，需要对更多的PSEN突变群体进行研究以支持这一结论。有趣的是，在PSEN1突变组中，携带APOE的复数ε2/ε3基因型（A260V和F105L突变）在额叶皮层中的总Aβ含量最低，平均1533 ng/g组织。相比之下，其余PSEN突变受试者的平均总Aβ为14554 ng/g组织，是其9倍。这些明显的差异表明APOE公司ε2等位基因可能在限制aβ的产生和/或积累中起作用。

与ND对照组相比，许多PSEN突变病例中可溶性tau蛋白的总水平增加。有趣的是，与四分之三的SAD病例一样，十分之七的PSEN突变显示出二聚体τ水平。对照组无一例出现二聚体τ。此外，三分之二没有二聚体tau带的PSEN病例的NFT神经病理学计数最低。其余病例有平均数量的NFT。WB观察到，NFT计数最高的三个病例的二聚体τ值也最高。这些发现可以用以下事实来解释：τ的二聚化在成核和成对纤维伸长中起关键作用[70]. 鉴于NFT是AD的一个重要标志，因为它们会破坏神经元及其神经突起，并在一定程度上负责PSEN突变中的痴呆过程，令人惊讶的是，在可溶性τ水平和不溶性NFT病理学中发现了广泛的异质性。基于先前的研究，可溶性tau的异常磷酸化明显导致了纤维的形成，这表明磷酸化可能是NFT组装的驱动力[71,72].

PSEN突变中AβPP和CT肽的数量之间存在有趣的对比，而SAD患者的情况正好相反，其中CT肽的量相对于AβPP要高得多。相反的比率意味着AβPP在大多数PSEN突变中积累，可能是由于γ分泌酶缺陷限制了Aβ和AICD的生成。自相矛盾的是，在SAD病例中，大量CT肽的存在表明存在一种非常活跃的β-分泌酶，与ND控制水平相关，CT片段的积累。与ND对照组相比，PSEN和SAD病例中CT肽的升高也很有意义，因为考虑到SAD个体中Aβ的普遍积累，人们预计这些片段会减少，或至少在ND病例的水平上发现。CT片段的增加可能是PSEN痴呆和SAD的毒性因素，就像动物模型中发生的一样。在表达AβPP的CT100氨基酸结构域的转基因小鼠中，存在神经元和突触病理、CT片段的细胞内积聚、海马退行性变、脑血管改变和认知缺陷[73–76]. PSEN和SAD个体中Aβ的积累可能是由于酶降解减少和这些分子进入体循环的清除减少所致。最近有人建议PSEN公司-受影响的基因可能是一个显性阴性突变，能够抑制其他分子的正常活动，例如cAMP反应元件（CRE）依赖性基因表达，以及NMDA受体功能和突触可塑性导致细胞死亡[77]. PSEN突变引起的结构变化也可能产生比Aβ42肽更长的肽，这些肽保持膜结合并具有毒性累积效应[78]. 此外，PSEN突变可能增加AβCT末端肽的积累[79]. PSEN突变中观察到的AβPP积累可能有两种机制。首先，升高的水平可能是由于突变的PSEN未能裂解aβPP并生成aβ肽。其次，有人认为PSEN1也是β分泌酶的调节器[80]因此，其功能障碍可能导致AβPP的积聚。

中的突变PSEN公司基因会产生大量异常加工的分子和因子，这些分子和因子会深刻改变大脑功能，并表现在疾病的早期发作、广泛的临床症状和不同的最终神经病理学中，因此导致复杂的多效性级联反应。在这种病理学中重要的是来自γ-分泌酶水解的肽，这些肽在结构和调节功能中至关重要，例如由AβPP、Notch-1、N-Cadherin和Erb-B4产生的肽。与ND病例相比，所有10例PSEN病例的切口处理似乎都受到了损害，但在7例患者中，这种影响是深远的，几乎完全没有可检测到的NICD。PSEN突变在NICD表达明显减少中的直接作用尚未确定。然而，考虑到NICD/CSL转录因子激活的大量基因，发生了重要的病理生理学变化，可能在这些痴呆的发展中起到很大作用。与ND病例相比，所有PSEN突变和SAD患者的N-Cadherin含量均减少，部分原因可能是PSEN公司或限制γ分泌酶的功能。N-Cadherin的异常处理会触发CBP的积累，导致CREB转录功能受损，突触传递和突触形态发生受损，继而导致认知能力下降[81,82]. 与ND对照组相比，所有PSEN和SAD病例中的Erb-B4和B4ICD结构域水平均较低。这两种肽的合成可能受到γ-分泌酶突变的限制，因为在组织培养细胞中γ-分泌酶会受到抑制，从而导致CT片段的积累[52]. γ-分泌酶对Erb-B4的加工缺陷可能导致异常的内蛋白水解，从而解释了我们在WB中观察到的多种Erb-B4CT相关肽。有研究表明，aβPP和Erb-B4水解之间的失衡可能导致神经退行性变、记忆障碍和突触功能障碍，而不会产生淀粉样斑块[83]. 此外，Erb-B4的减少导致GFAP的上调，这可能会增强SAD中观察到的星形细胞增生[84].

结论

PSEN突变的早发性、形态和生化多样性与特定的突变位点和类型明显相关。SAD和PSEN突变都积累了Aβ，这表明AβPP和Aβ肽在大脑衰老中起着重要作用。此外，侧翼或位于Aβ序列内的FAD遗传形式中的AβPP突变强调了CT99和Aβ肽的潜在代谢重要性。这表明Aβ可能在不同的神经退行性病变中代表一种救援分子[85]. 应对PSEN突变家族的临床健康年轻携带者进行治疗干预，如Aβ免疫作为预防AD的场所，以评估预防Aβ沉积的效果，并临床评估Aβ在多大程度上导致AD中观察到的痴呆。

早老素突变虽然诱发早发性痴呆，总体上与SAD相似，但表现出一系列病理和临床表型。这种复杂性掩盖了简单的解释性假设，即aβ42的直接优先产生是唯一的潜在生化机制。对10例PSEN突变病例的系统检查表明，只有一半的病例显示Aβ42:Aβ40比率显著增加。这表明，Aβ42的生成增加或积累增加都不能解释大量PSEN功能改变所导致的病理效应范围。鉴于这些差异、受影响的多种底物、发病年龄和临床病程的早期以及不同治疗靶点的出现，PSEN突变导致的FAD可更好地归类为“早老性痴呆”，但需要更多信息来证明其脱离FAD。