新品种的表型变异与鉴定YARS2公司YARS2线粒体肌病、乳酸性酸中毒和铁粒细胞性贫血的突变

摘要

背景

线粒体酪氨酸tRNA合成酶的突变(YARS2公司)该基因此前已被确定为组织特异性线粒体呼吸链（RC）紊乱、肌病、乳酸中毒、铁粒细胞性贫血（MLASA）的病因。在这项研究中，对一组以贫血为特征的线粒体RC障碍患者进行了基因突变筛查YARS2公司.

方法

对12名患者进行筛查YARS2公司通过Sanger测序进行突变。比较临床数据。进行功能检测以确认新突变的致病性并研究组织特异性效应。

结果

致病的YARS2公司在筛选的12名患者中，有3名患者发现了突变。两名患者被发现是先前报道的p.Phe52Leu突变的纯合子，一名患者受影响严重，一名受影响轻微。这些患者具有不同的mtDNA单倍型群，这可能有助于观察到的表型变异。一名轻度受累的患者是两个新基因的复合杂合子YARS2公司突变，p.Gly191Asp和p.Arg360X。p.Gly191Asp突变导致YARS2催化效率损失38倍，p.Arg360X突变没有产生稳定的蛋白质。与成纤维细胞相比，p.Phe52Leu和p.Gly191Asp/p.Arg360X突变导致肌肉细胞中复合物I、III和IV的RC缺陷更严重，但YARS2蛋白水平相对正常。肌肉特异性RC缺乏可能与肌肉中对RC复合物的需求增加有关。患者细胞肌发生时线粒体DNA增殖失败，这可能会加重RC缺陷。患者肌肉中PGC1-α和TFAM水平升高，表明线粒体生物发生被激活，是一种潜在的代偿机制。

结论

在这项研究中，我们确定了新颖的YARS2公司YARS2 MLASA患者中的突变和显著表型变异，表型从轻度到致死不等，我们认为背景mtDNA单倍型可能是导致表型变异的原因。这些发现对MLASA和相关表型的诊断和预测具有指导意义。

背景

线粒体呼吸链（RC）疾病是最常见的先天性代谢错误之一，发病率约为1:8000[1]. 它们是由线粒体或核DNA突变引起的临床异质性疾病[2]. 线粒体RC功能需要线粒体和核编码基因的协调表达，以提供大部分细胞能量需求。呼吸能力根据组织的能量需求和主要的代谢条件进行调节[三]. 线粒体RC功能障碍时，线粒体增殖等代偿机制可能被激活[4]. 线粒体RC的动态性质可能是导致组织特异性表现以及线粒体RC疾病中常见的家族间和家族内表型变异的因素之一。这些因素使诊断和预测更加复杂[5].

许多线粒体RC疾病是由损害线粒体蛋白质合成的遗传缺陷引起的，线粒体tRNA、氨酰-tRNA合成酶、伸长因子和核糖体蛋白质发生突变[6]. 奇怪的是，这些并不会导致相同的表型，而是一系列的疾病。即使线粒体氨酰-tRNA合成酶（ARS2）家族中的蛋白质发生突变，也会导致不同的临床表型和离散的组织特异性参与。ARS2家族负责连接线粒体定位的tRNA及其同源氨基酸。DARS2号机组[7],EARS2号机组[8]和MARS2号机组[9]突变导致白质脑病；各自与其他基因特异性中枢神经系统相关；风险调整后资本收益2突变导致桥小脑发育不全[10];HARS2（HARS2）和警报2突变导致卵巢发育不良和感音神经性聋[11,12];AARS2号机组突变导致婴儿心肌病[13];SARS2标准突变导致婴儿高尿酸血症、肺动脉高压、肾功能衰竭和碱中毒[14];FARS2号机组突变导致线粒体脑病[15]; 我们最近发现了一个YARS2公司突变是线粒体RC疾病的新病因，以骨骼肌病、乳酸酸中毒和铁粒细胞贫血（MLASA）为特征[16]. MLASA也与PUS1型[17]. 线粒体氨酰基-tRNA合成酶突变导致多种症状的原因尚不清楚，但已发现一些细胞质氨酰基-tRNA合成酶类除了在蛋白质合成中的作用外，还具有其他功能，线粒体氨酰-tRNA合成酶的其他功能可能影响氨酰-tRNA合成酶紊乱的独特发病机制[18]. 受线粒体RC障碍影响的组织通常是能量需求较高的组织和/或对线粒体功能障碍更敏感的组织，在线粒体RC输出受损的情况下，这些组织无法维持功能。然而，这并不能解释为什么不同的患者可能表现出大脑、心脏或骨骼肌功能异常，而不是所有这三种需要能量的组织。很明显，线粒体RC疾病的发病机制比代谢需求的简单概念更为复杂，需要更好地理解组织特异性表现和表型变异的基础。

在本研究中，我们进一步定义了与YARS2公司在三个先证者中发现突变。我们确定了p.Phe52Leu突变，最初被描述为可能的创始突变[16]，在另外两个家庭。在p.Phe52Leu YARS2患者中观察到相当大的表型变异，这对诊断具有重要意义。我们认为，这种表型变异可能部分是由于患者之间mtDNA单倍型群的差异所致。此外，我们还发现了两部小说YARS2公司患者的突变并确定其生化特征和tRNA^提尔氨酰化功能障碍。我们还检查了YARS2线粒体肌病组织特异性表现的基础。

方法

临床信息

Westmead儿童医院的人类研究伦理委员会批准了这项研究。

选择了12名患者作为队列YARS2公司筛选。选择标准包括贫血、伴有或不伴有乳酸酸中毒（10/12名患者患有乳酸酸中毒）、伴有或未伴有骨骼肌病（6/12名患者表现为肌病/张力减退）以及经证实的呼吸链酶缺乏症。在接受筛查的12名患者中，有9名来自法国，一名来自意大利，另外两名来自黎巴嫩，与两个最初的家庭无关YARS2公司之前描述过突变[16]. 我们确定致病性患者的临床病史YARS2公司以下给出了突变（患者4、5和6），并回顾了以前报告的病例（患者1、2和3）。其他患者的临床特征见附加文件1.

患者1和2是近亲父母的兄弟姐妹，如前所述[16]. 简言之，在出生后的前3个月内，P1出现输血依赖性铁粒细胞贫血，并出现持续性乳酸血症和肥厚性心肌病。心肌病自行消退。他有逐渐增强的运动耐力，17岁时出现吞咽困难和急性呼吸困难，18岁时死亡。P2在婴儿期也出现输血依赖性铁粒细胞贫血，并出现持续性乳酸血症和进行性肌肉无力，与P1相似。15岁时，她出现吞咽困难，并进行了胃造口术。值得注意的是，在17岁时，P2表现出了肌肉力量和耐力的提高，不再需要输血（之前每六周输血一次）。她现在20岁。患者3[16]出生于近亲父母的孩子在7岁时出现运动里程碑延迟、铁粒细胞贫血以及乳酸血症。她的父母拒绝让她输血，她接受了补充治疗。24岁时，她患有轻度骨骼肌病、贫血和轻度外周肌无力。

患者4是黎巴嫩血统非血统父母的第二个孩子，与此处描述的其他患者没有亲属关系。没有产前担忧。她足月正常分娩，阿普加评分良好。她出生时体重不足2.7公斤，但没有立即出现产后问题。她吃配方奶吃得很好，在家里体重也在增加。

有一位姑母患有镰状细胞贫血的家族史。父母有一个健康的3岁女儿，在妊娠12周时曾有胎儿死亡史。

先证者在8周大时出现急性低血压性休克，需要进行心肺复苏，随后几天出现鼻漏、大便疏松以及相关的嗜睡和进食困难。停搏时的静脉血气显示pH为6.56，碳酸氢盐为4.2 mmol/L，BE-28.8，阴离子间隙为30，乳酸为27 mmol/L（正常范围为0.7–2.0）。脑部CT扫描正常。尿液代谢筛查显示乳酸和酮类增加。血浆氨基酸、甘油三酯、游离脂肪酸、尿酸、血铵和血清转铁蛋白亚型正常。血浆总肉碱水平稍低。

她遇到了多系统问题。这些包括显著的同心性左心室肥厚，回声结构改变，以及舒张功能异常。她最初有轻微的心包积液，后来需要进行心包引流。她还患有肝肿大，转氨酶升高和凝血病。她可能癫痫发作，用抗惊厥药物治疗。随后的脑磁共振成像/MRS显示大脑萎缩，光谱正常，没有乳酸峰。

她患有贫血，最低血红蛋白为42 g/L，需要间歇输注填充细胞。骨髓抽吸物显示红细胞生成减少，红细胞前体和环状铁粒细胞中存在明显的红细胞空泡。骨髓活检没有发现储存障碍的证据。

她不能忍受从机械通气中断奶。心输出量受损以及上述相关问题导致最终决定退出主动重症监护。她三个月大时去世了。

在检测到p.Phe52Leu YARS2突变后，他们有两次怀孕，并进行了产前检测，随后被终止妊娠，因为这两次妊娠均为突变纯合子。

患者5是黎巴嫩非血亲父母的四个兄弟姐妹之一（尽管他们来自黎巴嫩北部的同一个村庄）。她的姐姐在20多岁时在黎巴嫩被诊断患有铁粒细胞性贫血，大约10年来一直依赖输血。开始输血10年后，她最终死于铁超载导致的肝硬化。据报道，此人是一名健康的年轻女性，没有任何其他医疗问题。

患者5在23岁时患有贫血。据报道，在黎巴嫩进行的首次骨髓检查显示她患有一种难治性贫血，为此她进行了四次促红细胞生成素注射。随后，她回到澳大利亚，四年后的第二次骨髓抽吸显示出环状铁粒细胞。当时，她的乳酸升高到3.24 mmol/L，丙酮酸升高到0.13 mmol/L.一年后的回顾中，她的乳酸为5.10 mmol/Ls，血红蛋白低到104 g/L。肌酸激酶为30 U/L，处于正常范围的下限。

患者5在11岁时被发现患有脊柱侧凸，她继续植入钛棒，随后因感染而取出。她随后进行了脊柱融合。她还患有子宫内膜异位症。

她的6分钟步行时间缩短为353米。她的肺功能测试显示轻度限制性缺陷，FVC预测为70%，FEV1预测为70%；一氧化碳弥散肺容量（DLCO）正常。她的心电图和超声心动图也正常。

检查时，没有器官肥大，她的心血管和呼吸检查正常。她的脊椎上有一道愈合良好的长疤痕，右侧胸椎轻微脊柱侧凸。她有轻微的双侧髋屈肌无力，但她的力量却完好无损。深部肌腱反射和感觉正常。步态和平衡没有问题。智力正常。

患者6是法国血统非血统父母的孩子，在出生后的第一年因铁粒细胞性贫血需要输血，该贫血自行缓解。出生后第一年的骨髓检查显示存在巨核细胞、成红细胞异常增生的迹象和过多的铁粒细胞。淋巴细胞中检测到复合物IV的部分缺失（未进行肌肉活检），成纤维细胞的Blue Native-PAGE上观察到RC复合物I、III、IV和V的异常组装。3岁时，心肌出现离散性增厚，5岁时恢复正常。没有出现骨骼肌病，但她有眼球震颤和斜视。肝功能测试正常。5年时发现轻度但永久性乳酸血症（3 mmol/L）。6岁时还出现乳酸血症，她报告称长时间步行或爬楼梯时会感到疲劳，同时伴有腿痛和肌肉无力。没有贫血的证据。智力正常。

YARS2，PUS1和线粒体DNA测序

全部YARS2公司和公用事业单位1编码外显子由韩国Macrogen公司进行的gDNA和Sanger DNA测序PCR扩增。来自p.Phe52Leu YARS2患者的mtDNA在皇家珀斯医院洛特威斯特州立生物医学设施基因组学进行了测序。使用Haplofind分配mtDNA单倍型群[19].

克隆和氨酰化分析

生成重组YARS2突变体蛋白以评估其酪氨酸化活性。重组野生型和YARS2变异体从大肠杆菌如前所述[20].体外tRNA^提尔氨基酰化试验是使用前面描述的方法进行的[20]. 在5至27 nM YARS2（取决于变体）和天然的情况下，根据Lineweaver-Burk图确定表观动力学参数大肠杆菌tRNA^提尔（Sigma），浓度范围为0.28至2.1μM。k的实验误差_猫和K _米 变化最多20%。数值是至少两个独立实验的平均值。

自然肌生成和Myo-D强迫肌生成

将原代患者和对照成纤维细胞系在含有20%Amniomax（生命科学）和10%热灭活胎牛血清（FBS；体外技术）、青霉素（50μg/ml）和链霉素（50μg/ml；生命科学）的DMEM:F12（生命科学）中常规培养，20%羊水，20%FBS，在含有5%CO的加湿培养箱中₂并保持在37°C。如前所述，使用慢病毒MyoD载体转导和分化成纤维细胞[21]除了将细胞接种到涂有0.15 mg/ml鼠尾胶原蛋白（BD Biosciences）的平板上。成肌细胞在与成纤维细胞转分化相同的培养基中分化。分化第6天采集细胞进行酶分析、免疫印迹或DNA提取。

RC酶测定

如前所述测定呼吸链酶活性[22].

免疫印迹法

免疫印迹如前所述[16]，并进行了以下修改。在室温下用1:500抗OXPHOS（Abcam）或1:500抗YARS2（N末端，Abgent）、1:10000抗孔蛋白（Abcan）、1:1000抗丝裂原（Abcam）、1:500000抗α-肌动蛋白-2（遗传科哈佛医学院Alan Beggs教授给INMR的慷慨礼物）探测膜，1:500抗PGC1-α（Sigma）或1:500抗TFAM（Abcam）在4°C下过夜。如前所述进行密度测定[16]蛋白质水平正常化为孔蛋白水平。

DNA提取

使用QIAamp DNA迷你试剂盒（QIAAGEN）从患者成纤维细胞颗粒和骨骼肌组织以及性别和年龄匹配的对照组中分离DNA。使用组织破裂器（QIAGEN）均质组织。样品用核糖核酸酶A（QIAGEN）处理。

qPCR测定mtDNA/nDNA

线粒体编码基因(ND1号机组)相对于单个拷贝数核编码基因进行量化(β2百万) [23]以测定患者和对照成肌细胞、肌管和肌肉中的mtDNA含量。这些基因在含有40 ng总DNA、1单位Immolase™DNA聚合酶（Bioline）和1.5 mM MgCl最终浓度的单独反应中扩增₂每个底漆500 pM，2%二甲基亚砜和1 M甜菜碱。通过扩增已知量的pTOPO2.1/B2M或pTOPO2.1/ND1质粒生成标准曲线。循环条件为：95℃持续12分钟，（95℃持续15秒，60℃持续15秒钟，72℃持续20秒）×35个循环。引物序列为（5'至3'）：ND1_F–CATAAAACTTCACCAAAGAGCC；ND1_R–GGGTTCATAGAGAGCGA；β2M_F–TGCTGTCTCCATGTGTGTATCT；β2M_R–TCTCTGCTCCCCACCTTAAGT。

统计分析

使用单变量分析的广义线性模型（SPSS v.19，IBM）评估细胞类型（成纤维细胞、强迫性肌管）、样本（P2患者、P6患者、对照组）及其与正常化的复合物IV活性和正常化的复物IV/CS活性的相互作用。单变量分析的广义线性模型也用于评估细胞类型（成肌细胞、肌管）、样本（患者P2、对照）及其与相对mtDNA/nDNA的相互作用的影响。如果细胞类型和样品之间存在显著的相互作用，则独立分析影响。没有对多项统计分析进行调整。使用独立样本t检验（SPSS v.19，IBM）测试患者和对照肌肉之间相对mtDNA/nDNA的差异。

结果

其他p.Phe52Leu YARS2患者表现出显著的临床变异性

我们之前已经鉴定出p.Phe52LeuYARS2公司三名MLASA患者（P1、P2和P3；表1)谁证明了影响复合体I、III和IV的肌肉特异性RC缺乏[16]. 对另外两名具有类似临床特征的无关患者进行筛查，发现患者P4和P5也是错义突变c.156C>G的纯合子（p.Phe52Leu）。P4的非血性亲本显示，对于c.156C>G替换，两者都是杂合的。P5的父母DNA不可用。

表1YARS2患者的临床数据

尽管RC酶在肌肉中的结果相似，但患者的临床严重程度差异很大（表1). 患者P4表现出严重的表型，3个月时死于肥厚性心肌病。P1在婴儿期也有心肌病，但未经特殊治疗即可解决。P5直到成年才出现症状，特征是轻度肌病和输血非依赖性贫血。患者P2出生时患有中度肌病和输血依赖性贫血。值得注意的是，17岁时，她的临床状况自发改善，而她的兄弟姐妹P1则进行性肌肉无力，14年后被轮椅束缚，18岁时死于呼吸衰竭。四位老人YARS2公司p.Phe52Leu患者的认知功能均正常。所有5名纯合子p.Phe52Leu YARS2患者均为黎巴嫩血统的澳大利亚人，这与我们的建议一致，即p.Phe52 Leu代表一种罕见的创始突变[16].

mtDNA测序显示，尽管这些患者属于同一种族，但他们并不都具有相同的mtDNA单倍型群（表1; 请参阅附加文件2获取线粒体DNA变异的完整列表）。之前报告的3名患者（P1、P2和P3）均属于单倍型群K。P4是受影响最严重的患者，属于单倍形群T和P5，受影响最轻的患者属于单倍体群H。

YARS2公司筛查发现新突变

YARS2公司和公用事业单位1对10名患有RC酶缺乏症的法国或意大利患者进行突变筛查，这些患者还表现出贫血和至少一种其他MLASA特征，即乳酸中毒或肌病。一名患者，P6（表1)有两本小说码2突变、杂合错义突变c.572G>a（p.Gly191Asp）和杂合无义突变c.1078C>T（p.Arg360X）。患者P6YARS2公司在dbSNP（NCBI）、1000个基因组（browser.1000genomes.org）或ESP数据库（evs.gs.washington.edu）中均未发现变异。对亲本DNA的筛选表明，每一个亲本都携带一种或另一种突变。

患者P6（[p.Gly191Asp]；[p.Arg360X]）患有轻度乳酸中毒和肌病，仅在出生后的第一年需要输血（表1). 通过对淋巴细胞进行RC测试以及在成纤维细胞样本的Blue Native-PAGE上对复合物I、III、IV和V进行缺陷组装，证明复合物IV酶学受损（数据未显示）。

码2在另外两名患者（P7和P8）中发现了变异，但它们不太可能是致病性的。这些在附加文件中进行了描述1.没有公用事业单位1在这组患者中发现了突变。

p.Gly191Asp YARS2显示氨酰化活性降低

为了确定p.Gly191Asp YARS2突变对酪氨酸化能力的功能影响，在体外使用大肠杆菌tRNA^提尔作为基底。Gly191位于YARS2的催化域内[24]和蛋白质预测程序SIFT(http://sift.jcvi.org/)预测Gly191Asp变异具有破坏性。

氨酰化试验测定了[¹⁴C] 天然酪氨酸大肠杆菌tRNA^提尔通过重组YARS2。p.Gly191Asp突变对K _米 反应（表2)表明YARS2与tRNA相互作用^提尔显然没有受到影响。然而，催化速率（k_猫)受到干扰，导致酪氨酸化活性降低。p.Gly191Asp变体导致催化效率降低38倍（k_猫/K（K） _米 )与野生型酶相比，p.Phe52Leu突变的减少幅度更大（减少9倍）[16]. 该结果与SIFT预测的p.Gly191Asp蛋白功能变异的严重程度一致。

表2tRNA酪氨酸化的动力学参数 ^提尔 通过野生型和p.Gly191Asp YARS2重组蛋白

当RC复合物表达水平改变时，YARS2蛋白水平不受影响

通过患者P6成纤维细胞和肌管的免疫印迹研究YARS2和RC复合物的表达水平（图1a） ●●●●。由于YARS2 RC缺陷的肌肉特异性和P6肌肉样品的不可用性，肌管是通过使用表达MyoD的慢病毒载体的成纤维细胞转分化而生成的[21]，一种主要的调节性肌源转录因子。通过证明P2患者的线粒体RC表达水平通过天然和Myo-D强迫肌发生的类似诱导而验证了该模型，P2患者有成肌细胞系（附加文件三). 与对照组相比，患者P6成纤维细胞或MyoD强迫肌管中的YARS2蛋白水平没有显著改变，这表明YARS2蛋白质水平降低不是肌肉特异性表型的原因。这也是p.Phe52Leu YARS2（P2）的情况，如图所示用于比较（图1a） ●●●●。没有证据表明截断的YARS2蛋白可能是由P6的p.Arg360X突变引起的。P6 cDNA测序显示c.1078C>T（p.Arg360X）突变转录本不稳定，qPCR显示YARS2总mRNA水平约为对照的50%（附加文件4). 孔蛋白（VDAC）是一种线粒体外膜蛋白，α-肌动蛋白-2是一种肌肉特异性蛋白，用作负荷控制，并证明成纤维细胞转分化为肌管的功效（图1a） ●●●●。患者成纤维细胞样本的免疫印迹显示，RC复合物I和IV水平为对照水平的50-60%（图1a） ●●●●。与成纤维细胞相比，在MyoD强迫肌管中观察到的复杂I和IV缺陷更为严重（P2:25-50%的对照水平；P6:5-10%的对照水平），符合肌肉特异性表型。

图1

RC复合物缺乏在肌肉细胞中更为严重。YARS2患者成纤维细胞和MyoD-forced肌管中RC复合物和YARS2水平的免疫印迹（A）.C=对照，P2=[p.Phe52Leu]；【p.Phe52Leu】YARS2，P6=【p.Gly191Asp】；[p.Arg360X]YARS2。复合物IV活性相对于总蛋白进行测量（B）柠檬酸合成酶活性（C）对照组（C）和患者（P2和P6）成纤维细胞（Fib）和MyoD-强迫肌管（Myo）。实验至少进行两次，每次三次。对照成纤维细胞正常化至100%。数值为平均值±SD。

肌肉细胞中RC缺乏更严重

我们测量了来自MyoD的肌管中复合物IV的活性，这些肌管来自于YARS2公司患者P2（p.Phe52Leu）和P6（[p.Gly191Asp]；[p.Arg360X）证实RC复合物水平降低（图1a） 与RC酶活性降低相关。在正常对照组中，成纤维细胞向肌管的转分化导致复合物IV活性相对于总蛋白显著增加（P=0.002；图1b） 与Western blot检测到的线粒体RC亚单位相对水平增加一致（图1a和附加文件三). 相反，对于患者P2和P6细胞系，复合物IV活性相对于总蛋白均降低（P<0.001；图1b） 相对于柠檬酸合成酶（P≤0.005；图1c） ●●●●。与对照组成纤维细胞相比，患者P2成纤维细胞和患者P6成纤维细胞的复合IV/CS活性显著降低（分别为P=0.02和P<0.001；图1c） ●●●●。然而，MyoD-forced myogenesis显示复合物IV/CS活性不足，低于对照水平的50%，可以认为是诊断性的。这些结果与Western blot在患者肌管中观察到的复合物IV水平比成纤维细胞中严重降低一致（图1a） ●●●●。

YARS2患者的肌肉特异性表型可能与肌肉中RC复合物需求增加有关[25,26]. 因此，我们比较了10μg成纤维细胞、肌D肌管和骨骼肌总蛋白中线粒体RC表达水平的相对水平（图2). 在对照样品中，从成纤维细胞向肌管转分化的所有RC复合物的相对水平增加了约2倍，肌管和骨骼肌纤维之间的RC表达水平进一步增加了约两倍（图2). 然而，患者2的细胞未能通过成纤维细胞的强迫肌发生诱导线粒体RC复合物I和IV表达肌发生（图2)或成肌细胞的天然肌生成（附加文件三). 患者2的骨骼肌样本显示复合物I和IV严重缺乏，复合物II代偿性上调。因此，我们的结果表明YARS2公司突变可以在成纤维细胞中产生足够的RC复合物I和IV，但不能在需求增加的肌肉中产生。

图2

RC复合物水平在患者肌肉细胞的肌发生中失调。对照组（C）MyoD-强迫肌管（Myo）和肌肉（Musc）的RC复合物水平高于成纤维细胞（Fib），而患者（P2）MyoD强迫肌管和肌肉缺乏复合物I（CoI NDUFB8）和IV（CoIV II）。

与成纤维细胞相比，对照肌管和肌肉中的丝裂原和孔蛋白（VDAC）水平更高，表明肌发生的线粒体数量（或大小）更多（图2); 与增加的RC复杂程度一致。与对照肌肉相比，P2患者骨骼肌的丝裂原蛋白和孔蛋白水平更高，表明线粒体增殖受到RC缺陷的上调。没有证据表明患者肌肉中YARS2存在代偿性上调。

患者肌肉细胞线粒体生物发生改变

我们进一步研究了线粒体增殖在YARS2病理学中的作用。PGC1-α是一种促进线粒体生物发生的转录辅激活物[27]和TFAM控制mtDNA拷贝数和转录[28]. 与对照组相比，患者P2肌肉中PGC1-α和TFAM水平升高（图三a） 与线粒体增殖途径的诱导一致。有趣的是，与对照肌肉相比，患者P2肌肉中mtDNA/nDNA的相对水平没有显著升高（P=0.09；图三c） 尽管我们的生化证据显示线粒体结构蛋白的相对水平较高，并且PGC1-α和TFAM通路的诱导也较高。

图3

患者肌肉细胞中的线粒体生物发生发生改变。对照组RC复合物、PGC1-α和TFAM水平的免疫印迹（C）和患者P2肌肉（肌肉）（A）、成肌细胞（Myb）和肌管（Myt）（B）α-肌动蛋白-2水平显示为肌肉的负荷控制和肌管中肌发生的指示。通过qPCR测定对照组（C）和患者（P2）肌肉中的线粒体DNA拷贝数（C）以及成肌细胞和肌管（D）。实验进行了两次，每次三次。结果是相对于控制肌肉表达的（C）或成肌细胞（D）值为1。数值为平均值±标准偏差。ns=无显著差异。

接下来，我们评估了患者和对照成肌细胞中PGC1-α和TFAM与肌发生的相对水平。患者和对照组成肌细胞和肌管中的PGC1-α水平相似，并且随着肌发生而显示出约2倍的上调（图三b） ●●●●。TFAM的水平也随着肌发生而增加，但在患者成肌细胞和肌管中的表达水平是对照组的3倍（图三b） ●●●●。对肌肉发生过程中mtDNA/nDNA相对水平的分析表明，有强有力的证据表明细胞类型与样本之间存在相互作用（P<0.001），因此对样本内的细胞类型进行了比较。对照成肌细胞的肌发生诱导mtDNA/nDNA相对水平增加2倍（P<0.001）。然而，P2未观察到肌生成诱导的线粒体DNA增殖上调（P=0.22；图三d） ●●●●。在患者肌肉组织和细胞中观察到的TFAM水平升高似乎不会导致mtDNA水平升高。

讨论

在这里，我们完善了与YARS2公司线粒体RC障碍贫血患者队列的突变筛查。现已确定了来自四个家族的5名纯合p.Phe52Leu替代患者，揭示了铁粒细胞贫血和肌病发病年龄和严重程度的显著临床变异性。我们假设mtDNA背景可能有助于观察到患者的临床变异性。P4是婴儿期因肥厚性心肌病死亡的受影响最严重的患者，属于单倍型群T。单倍型组T与发展肥厚性心肌病的风险相关[29]，在优秀耐力运动员中发生频率较低，表明该单倍型群的线粒体容量下降[30]. 受影响最轻的患者P5属于单倍型群H。单倍型组H的杂交后代的线粒体蛋白质合成水平高于单倍型组U（单倍型群组K是其中的一个亚群）[31]和J[32]. 因此，单倍型群H可能对YARS2公司导致线粒体蛋白质合成减少的突变。其余3名患者也表现出疾病严重程度的差异，均为单倍型群K，这表明可能还有其他因素影响疾病严重程度。所有患者均为黎巴嫩血统的澳大利亚人，来自四个不相关的家庭，符合p.Phe52Leu是创始突变[16]. 最近，p.Gly46AspYARS2公司据报道，突变会导致类似的临床特征，即一名同样来自黎巴嫩的MLASA患者的复合物I、III和IV的肌肉特异性RC缺陷[33]. 因此，任何年龄段出现MLASA症状的黎巴嫩籍患者都应接受筛查YARS2公司突变。

一名在出生后一年内患有贫血、轻度乳酸酸中毒和肌病的患者被发现是两个新基因的复合杂合子YARS2公司突变，p.Gly191Asp和p.Arg360X。Gly191位于YARS2的催化域内，就在簇1之前，已知簇1与tRNA的碱基1-72相互作用^提尔受体茎[24]. 该位置的突变可能会干扰簇1α-螺旋的定位，从而对氨酰化反应产生不利影响。这已由确认在体外重组p.Gly191Asp YARS2的氨基酰化分析，与野生型酶相比，其催化效率损失了38倍，并预测会导致线粒体蛋白质合成减少，如p.Phe52Leu突变所示[16]. c.1078C>T（p.Arg360X）产生的mRNA转录物YARS2公司由于突变靠近内含子/外显子边界，该突变不稳定，很可能被无义介导的衰变降解。没有证据表明使用针对YARS2 N末端的抗体截短p.R360X YARS2蛋白。患者P6 YARS2蛋白水平保持不变，但这是功能较弱的p.Gly191Asp YARS2。我们认为P6患者的线粒体RC障碍是p.Gly191Asp和p.Arg360X YARS2突变共同作用的结果。

我们没有发现致病性码2或公用事业单位1其余9名患者的突变，没有一名患者具有致病性YARS2突变患者的所有临床特征（附加文件1). 致病性疾病患者的常见特征YARS2公司突变是肌肉中复合物I、III和IV的酶缺乏、铁母细胞贫血（尽管发病时间和持续时间可能因患者而异）、乳酸中毒、骨骼肌病和/或心肌病。然而，有可能YARS2公司未来可能会在具有替代表型的RC障碍患者中发现突变，因为我们的队列是根据贫血的存在来选择的。

与成纤维细胞或成肌细胞相比，YARS2患者RC复合物缺陷的肌肉特异性表现的基础是肌肉对OXPHOS成分的需求增加。肌发生后，线粒体增殖，导致RC复合物和mtDNA/nDNA水平增加[25]正如我们在对照组成肌细胞中观察到的。然而，随着肌发生，YARS2患者细胞无法诱导RC复合物I、III和IV水平的充分表达。孔蛋白和丝裂原水平增加，表明线粒体发生增殖，但由于突变型YARS2的氨酰化活性缺陷，YARS2患者细胞无法合成足够水平的RC复合物线粒体编码亚单位。这种缺陷影响线粒体DNA增殖和肌生成，可能是由于线粒体内ATP水平降低，因为线粒体DNA转录需要较高的ATP浓度[34]. mtDNA转录是mtDNA复制的先决条件，mtDNA转录和翻译也密切相关[35].

肌肉线粒体含量在分化和发育过程中建立，然后在一生中保持或改变[36]. P2肌肉中mtDNA/nDNA的水平与对照组相当，这表明随着时间的推移，线粒体增殖可能是对线粒体RC缺乏的一种补偿反应。与对照组相比，患者肌肉中观察到的PGC1-α和TFAM水平的增加与该假设一致。此外，在最近进行的P2肌肉临床改善前后的转录谱分析中，当患者表现出严重的临床特征并在临床改善后恢复正常时，TFAM和PGC1-α的mRNA水平显著高于对照组（数据未显示）。肌发生时TFAM和PGC1-α蛋白水平升高与线粒体增殖的启动相一致，表明线粒体增殖途径因线粒体DNA拷贝数低而受到压力。因此，可能是由于YARS2公司导致线粒体RC功能障碍和ATP产生减少的突变也会影响线粒体DNA的转录和复制，从而加剧RC缺陷。

总之，我们发现纯合子YARS2 p.Phe52Leu突变是黎巴嫩血统患者中MLASA的常见原因，患者表现出家族间和家族内表型变异。我们还确定了两个新的患者复合物杂合子YARS2公司突变（p.Gly191Asp和p.Arg360X）。我们完善了YARS2公司病理学包括复合物I、III和IV中的肌肉特异性缺陷，以及铁粒细胞贫血和骨骼肌病和/或心肌病。YARS2疾病的组织特异性作用与肌肉中对OXPHOS成分的更高需求有关。进一步的研究，包括转录组学研究，可能有助于揭示YARS2诱导的RC功能障碍所激活的代偿机制。