联合应用SLC和Tregs去除是一种针对肝癌的有吸引力的策略

摘要

背景

次级淋巴组织趋化因子（SLC）是免疫细胞趋化性的关键CC趋化因子，已成为抗肿瘤治疗的候选药物。然而，在SLC招募的肿瘤免疫细胞中，CD25⁺Foxp3系列⁺调节性T细胞（Tregs）损害抗肿瘤作用。在本研究中，我们提出肿瘤内联合应用SLC和抗CD25单克隆抗体（mAbs）的联合治疗。我们假设瘤内注射SLC和清除Tregs对小鼠肝细胞癌（HCC）的进展具有更强的抑制作用。

方法

将小鼠肝癌细胞系皮下接种C57BL/6小鼠，对可见肿瘤的小鼠进行SLC、SLC加抗CD25单克隆抗体或对照抗体瘤内治疗。Tregs、效应器CD8的百分比⁺T细胞和CD4⁺定期检测肿瘤、淋巴结、脾脏和肝脏中的T细胞。检测肿瘤内IL-12、IFN-γ、IL-10和TGF-β1的水平。通过肿瘤体积和重量以及MMP2和MMP9的瘤内活性来测量最终的抗肿瘤效果。利用骨髓来源的树突状细胞探讨SLC体外诱导成熟的机制。

结果

我们的实验表明，联合治疗显著降低了Tregs的频率，并增加了CD8⁺T细胞和CD4⁺肿瘤部位的T细胞。这些改变伴随着IL-12和IFN-γ水平的升高，IL-10和TGF-β1水平的降低。出乎意料的是，我们观察到Tregs的百分比显著下降，CD8增加⁺T细胞和CD4⁺联合治疗后淋巴结、脾脏和肝脏中的T细胞。与单纯SLC相比，联合治疗也最大限度地抑制了HCC的生长和侵袭性。此外，我们证实SLC通过NF-κB p65诱导DC成熟，这种成熟将有利于联合治疗。

结论

我们的数据表明，肿瘤内联合应用SLC和抗CD25单克隆抗体是治疗肝癌的有效方法，这与肿瘤微环境的改变以及Tregs、CD8的系统优化百分比有关⁺T细胞和CD4⁺外周免疫器官中的T细胞。

背景

次级淋巴组织趋化因子（SLC，又称CCL21）是一种重要的CC趋化因子，可以招募树突状细胞（DC）和T细胞等多种免疫细胞[1]. 此外，我们小组和其他人最近的研究表明，SLC可以诱导DC成熟[2,三]. 这些特性使SLC成为抗肿瘤治疗的候选药物[4]. 事实上，几项研究表明，肿瘤内注射SLC可引起显著的肿瘤消退[5,6]. 我们还表明，肿瘤内上调肝细胞癌（HCC）中SLC的水平是阻止肿瘤进展的有效策略[三,7].

在肿瘤部位的免疫细胞中，存在一组调节性T细胞（Tregs），它们是肿瘤免疫抑制的关键成分。它们被广泛识别为CD4⁺高表达CD25和Foxp3的T细胞[8]. Tregs通过抑制其他免疫细胞的激活、增殖和功能发挥作用[9]. 越来越多的证据表明，Tregs在肿瘤微环境（TME）中积累，从而抑制抗肿瘤免疫[10–12]. 这可以解释抗CD25单克隆抗体（mAbs）治疗在动物模型中诱导肿瘤排斥反应的疗效[13–15].

根据这些结果，我们提出肿瘤内联合应用SLC和抗CD25单克隆抗体的联合治疗。在这项研究中，我们发现联合治疗降低了Tregs的频率，增加了CD8⁺T细胞和CD4⁺肿瘤部位的T细胞，IL-12和IFN-γ水平升高，IL-10和TGF-β1降低。重要的是，我们观察到Tregs、CD8的系统优化⁺T细胞和CD4⁺联合治疗后淋巴结、脾脏和肝脏中的T细胞。联合治疗最大限度地抑制了肝癌的生长和侵袭性。体外实验证实，SLC诱导的DC成熟是由NF-κB p65介导的，这有利于基于SLC的联合治疗。这些数据为肝癌的临床免疫治疗提供了有趣的线索。

结果

抗CD25单克隆抗体对小鼠肝癌模型Tregs的耗竭作用

首先，我们验证了在肿瘤中注射抗CD25单克隆抗体后Tregs耗竭的疗效。CD25的代表性数据⁺Foxp3系列⁺FAC和IHC显示了Tregs（图1A和B）。对所有治疗组和对照组小鼠的结果进行总结，并以曲线图形式提供。如图所示1C、 从治疗后的第1天到第9天，肿瘤内Tregs在SLC-抗CD25单克隆抗体治疗的小鼠中基本保持在显著最低的水平，而对照小鼠中的Tregs最高，呈线性增加。SLC组Tregs轻度增加，与对照组相似。有趣的是，从第7天到第9天，所有三组的Tregs都急剧增加（图1C和D）。

图1

SLC治疗小鼠中抗CD25单克隆抗体对Tregs的消耗。（A）CD25的代表性FAC图⁺Foxp3系列⁺CD4上的Tregs门控⁺治疗后第1-9天肿瘤中的T细胞。（B）Foxp3的代表性染色⁺肿瘤组织中的Tregs（深棕色）。（C）总结了所有治疗和对照小鼠的结果曲线图。（D）从第7天到第9天，Tregs的频率急剧增加。对照组：对照组；SLC：SLC组；SLC+抗CD25：联合治疗组。数值表示为平均值±SD；n=5只小鼠/组*对 < 0.05, **对 < 0.01与在第1天到第9天进行对照或指示比较。在三个独立的实验中获得了结果。棒材=50μm。

联合治疗肿瘤中CCR7和Foxp3的动态变化

CCR7在胸腺、淋巴结、脾脏、肝脏和Hepa 1-6肿瘤中检测到，但在Hepa 1-7细胞系中未检测到（图2A） ●●●●。因此，SLC的趋化作用可以通过肿瘤内CCR7的水平来衡量，Tregs的耗竭可以通过Foxp3的水平来定义。我们观察到，联合治疗组和SLC组在治疗后第1天到第7天表现出CCR7的稳定上调，但在第9天表现出明显下调，而对照组在同一时期保持CCR7基础水平（图2B和C）。相比之下，我们注意到联合治疗组在每个时间点的Foxp3水平最低，而所有3组在治疗后第1天到第9天的Foxp水平逐渐增加（图2B） ●●●●。

图2

肿瘤治疗后CCR7和Foxp3的动态变化。（A）CCR7在Hepa 1-6细胞、肿瘤和免疫器官中的表达。（B）治疗后第1-9天肿瘤中CCR7和Foxp3的表达。（C）治疗后第1-9天肿瘤中CCR7（深棕色）的代表性染色。对照组：对照组；SLC：SLC组；SLC+抗CD25：联合治疗组。β-actin作为定量对照。在每种情况下，密度计的定量都是相对于第一个数据集的（由值1表示）。所有数据均代表至少两个独立实验。棒材=50μm。

CD4频率改变⁺和CD8⁺肿瘤部位的T细胞

量化肿瘤浸润T细胞后，我们发现联合治疗组CD8水平最高⁺T细胞(对 < 0.01），而对照组显示最低水平(对 < 0.01）（图三A和C）。相反，SLC组表现出最高水平的CD4⁺T细胞(对 < 0.05和对 < 0.01），联合治疗组表现出适度增加(对 < 0.01）（图三B和D）。

图3

CD8的频率⁺T细胞和CD4⁺治疗后肿瘤中的T细胞。CD8的频率⁺T细胞（A）和CD4⁺T细胞（B）在治疗后第1-9天用淋巴细胞门控的FACs分析肿瘤中的。CD8的代表性染色⁺T细胞（C）和CD4⁺T细胞（D）IHC显示肿瘤（深棕色）。对照组：对照组；SLC：SLC组；SLC+抗CD25：联合治疗组。数值表示为平均值±SD；n=5只小鼠/组*对 < 0.05, **对 < 0.01与在第1天到第9天进行对照或指示比较。在三个独立的实验中获得了结果。棒材=50μm。

在TME中，IL-12、IFN-γ、IL-10和TGF-β1的细胞因子谱发生了倾斜

与对照组相比，两个治疗组的IL-12水平显著升高（图4A） 和IFN-γ（图4B） ，但免疫抑制介质IL-10水平显著降低（图4C） 和TGF-β1（图4D） 治疗后第5天，Tregs耗竭和肿瘤生长抑制的代表性时间点。然而，SLC组和联合治疗组之间的四种细胞因子水平没有显著差异。

图4

肿瘤微环境中四种细胞因子的水平。在治疗后第5天采集肿瘤样本，并测定肿瘤内IL-12水平（A），干扰素-γ（B），IL-10（C）和TGF-β1（D）通过ELISA进行评估。对照组：对照组；SLC：SLC组；SLC+抗CD25：联合治疗组。数值表示为平均值±SD；n=5只小鼠/组*对< 0.05, **对<0.01用于指示的比较。在三个独立的实验中获得了结果。

Tregs、CD8的系统优化⁺和CD4⁺淋巴结、脾脏和肝脏中的T细胞

接下来我们评估了Tregs，CD8的频率⁺和CD4⁺外周免疫器官和肝脏中的T细胞。在淋巴结中，IHC显示Tregs减少，CD8增加⁺和CD4⁺治疗后第5天，两个治疗组的T细胞（图5A） ●●●●。FACs结果显示，两个治疗组的Tregs频率低于对照组(对 < 0.01），特别是与SLC组相比，联合治疗组在第7天和第9天出现Tregs的频率较低(对 < 0.05）（图5D） ●●●●。两个治疗组的CD8水平较高⁺和CD4⁺第3至9天与对照组比较的T细胞(对 < 0.01); 在两个治疗组之间，联合治疗组的CD8水平显著高于对照组⁺第3天和第5天的T细胞，CD4水平显著升高⁺第5天的T细胞（图5D） ●●●●。IHC治疗后第5天脾脏的冷冻切片显示Tregs减少，CD8增加⁺和CD4⁺联合治疗组和SLC组的T细胞（图5B） ●●●●。定量结果证实，两个治疗组的Tregs百分比下降，CD8百分比增加⁺和CD4⁺T细胞与对照组比较；此外，联合治疗组的Tregs水平显著最低（第3-9天），CD8水平最高⁺（第1-9天）和CD4⁺T细胞（第1天和第5-9天）（图5E） ●●●●。两个治疗组显示出类似的Tregs模式，CD8⁺和CD4⁺肝脏中的T细胞：Tregs频率降低，CD8频率增加⁺和CD4⁺T细胞；然而，联合治疗组仅在第9天Tregs水平较低，CD8水平较高⁺与SLC组相比，第3天和第9天的T细胞（图5C和F）。SLC组CD4水平最高⁺第1-9天的T细胞(对 < 0.05）（图5F） ●●●●。

图5

Tregs，CD8的优化⁺和CD4⁺淋巴结、脾脏和肝脏中的T细胞。Foxp3的代表性染色⁺特雷格斯，CD8⁺T细胞和CD4⁺IHC显示淋巴结中的T细胞（A），脾脏（B）和肝脏（C）在治疗后第5天（深棕色）。Foxp3的定量分析⁺特雷格斯，CD8⁺T细胞和CD4⁺FACs检测淋巴结中的T细胞（D），脾脏（E）和肝脏（F）治疗后第1-9天。对照组：对照组；SLC:SLC组；SLC+抗CD25：联合治疗组。数值表示为平均值±SD；n=5只小鼠/组*对 < 0.05, **对 < 0.01与在第1天到第9天进行对照或指示比较。在三个独立的实验中获得了结果。棒材=50μm。

联合治疗对已建立HCC的抑制作用更强

通过监测肿瘤体积和重量来评估联合治疗的抗肿瘤效果。我们发现联合治疗对肝癌体积的抑制作用最大(对 < 0.01，第5天至第9天）（图6A） ●●●●。随着体积的减少，联合治疗也显著减轻了肿瘤重量（图6B） ●●●●。通过明胶酶谱分析肿瘤的侵袭性，我们发现在联合治疗的肿瘤中，MMP-2和MMP-9的前形式和活性形式都减少了（图6C） 治疗后第5天。

图6

联合治疗对已建立的HCC的最大抑制作用。治疗后第1-9天监测肿瘤大小（A）处死小鼠，称重整个肿瘤（B）明胶酶谱用于检测肿瘤内MMP-2和MMP-9的活性（C）.对照组：对照组；SLC：SLC组；SLC+抗CD25：联合治疗组。数值表示为平均值±SD；n=5只小鼠/组*对 < 0.05, **对 < 0.01与在第1天到第9天进行对照或指示比较。在三个独立的实验中获得了结果；

SLC通过NF-κB p65诱导DC体外成熟

研究表明，SLC的抗肿瘤作用可部分归因于SLC在肿瘤中诱导的DC成熟[6,16]; 然而，尚不清楚SLC诱导DC成熟的详细机制。我们通过基因阵列分析了SLC刺激后骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的表达谱。阵列数据显示，刺激后各种基因上调，例如PKC通路（Ca²⁺、MEK等）、PI-3激酶途径和NF-κB途径（表1). 在本研究中，我们重点研究了NF-κB通路，它对DC的成熟非常重要。我们发现，SLC和ELC刺激均诱导磷酸化NF-κB p65（p-NF-κ的B p65）的上调和NF-κ子B p65的下调，并且这些变化被PDTC阻断，PDTC是NFκB活化的特异性抑制剂（图7A） ，与阵列数据一致。表型评估表明，在成熟过程中，BMDC上调CCR7、CD80和CD86，而PDTC显著抑制了这一过程（图7B和C）。

表1骨髓间充质干细胞经SLC治疗1或12小时后上调基因

图7

NF-κB p65介导SLC下游DC的成熟。BMDC用PDTC预处理1 h，然后用SLC或ELC培养1、2、4、6、12、24 h。对全细胞裂解物、核裂解物和胞浆裂解物进行NF-κB p65和磷酸化NF-κ的B p65分析（A）和CCR7（B）BMDC用PDTC预处理1 h，然后用SLC培养24 h。通过FACs分析CCR7、CD80和CD86的表达（C）密度计定量与每种情况下的第一组数据有关（用值1表示）。

讨论

在这项研究中，我们证明了在小鼠HCC模型中，肿瘤内注射SLC加抗CD25单克隆抗体可最大限度地抑制肿瘤进展。据我们所知，这是第一份证明以SLC为基础的联合治疗对肝癌具有显著疗效的报告。

我们发现，在联合治疗组中，Tregs的频率最低。这一结果与之前的研究一致，这些研究确定了抗CD25单克隆抗体治疗对消耗Tregs的功效[13,17,18]. 由于成熟DC主要激活免疫反应，而不成熟DC则容易诱导Tregs，因此我们认为SLC诱导的DC成熟也有助于Tregs的减少。Foxp3的瘤内水平与肿瘤进展呈负相关[19,20]我们发现，在联合治疗中，Foxp3的水平在3组中仍然最低，这代表了一种有益的抗肿瘤作用。

同时，我们发现SLC组和联合治疗组肿瘤部位的CCR7水平均升高，这与SLC的趋化特性一致。我们还注意到，从第7天到第9天，SLC组和联合治疗组的CCR7急剧下降。我们认为，这可能是由于治疗持续时间和体内肿瘤进展所致，这也可以从其他研究中推断出来[6,17]. 为了支持这一点，我们发现Tregs的频率增加，而CD8⁺T细胞和CD4⁺从第7天到第9天，两个治疗组的肿瘤中的T细胞同时下降。这些观察结果为肝癌免疫治疗的时间窗提供了有用的信息。

我们观察到，联合治疗的CD8水平最高⁺T细胞和适度水平的CD4⁺T细胞。我们认为CD4比例降低⁺T细胞是由于CD4的耗竭⁺抗CD25单克隆抗体Tregs。至于增加的CD8⁺T细胞，我们推断出两种可能性：（1）TME中Tregs的耗竭引发了相对无抑制的环境，这促进了CD8的增殖⁺T细胞[21,22]; （2） 残余Tregs被抗CD25单克隆抗体灭活并重新编程[23–25]支持CD8的招募和生存⁺T细胞。这种变化代表了一种抗肿瘤作用。

在TME中，我们检测到两个治疗组的IL-12和IFN-γ水平较高（增强抗肿瘤免疫），TGF-β1和IL-10水平较低（抑制抗瘤免疫）。然而，SLC组和联合治疗组之间的四种细胞因子水平无统计学差异。当我们在第5天检测到这些细胞因子时，我们不确定这些细胞因子在其他时间点是否存在显著差异。需要更多实验来准确验证肿瘤进展过程中TME中的细胞因子谱。

出乎意料的是，我们发现了Tregs，CD8的频率模式⁺T细胞和CD4⁺T细胞在淋巴结、脾脏和肝脏的优化程度与TME相似，表现为Tregs减少，CD8增加⁺T细胞和CD4⁺T细胞。目前还没有报道基于SLC的局部治疗能够导致外周免疫器官免疫细胞的系统优化。目前尚不清楚这种系统优化是如何发生的。我们认为，TME中细胞因子的改变，如增加IL-12和IFN-γ，降低TGF-β1和IL-10，可能对外周器官产生一些影响。事实上，一些研究已经证实，TME含有许多可以影响远程免疫器官的成分，例如肿瘤衍生的微泡和TLR4配体，它们可以诱导T细胞凋亡[26,27]. 临床研究还发现，肝癌衍生的可溶性因子同时增加Tregs的数量并增强其抑制功能[28]; 通过手术切除肿瘤导致免疫细胞的系统性改变，例如Tregs和粒细胞减少，树突状细胞和CD4增加⁺T细胞[29,30].

通过肿瘤的生长和侵袭性评估联合治疗的疗效。我们发现，与对照组相比，联合治疗和SLC组的肿瘤生长明显减少。虽然单用SLC治疗可以减少肿瘤的生长，但联合治疗表现出更为深刻的抑制作用。这一结果证实了我们的假设，即联合治疗将提高疗效，与其他将SLC与不同佐剂联合的研究一致[5,31]. MMP2和MMP9是肿瘤进展和转移的重要介质[32]，在我们的实验中，我们观察到在三组中，联合治疗组的促和活性MMP2、MMP9的水平最低。因此，这些结果证明了联合治疗的疗效。

有趣的是，我们注意到，如体内和体外实验所示，与对照组和联合治疗组相比，SLC组表现出适度的改善。这些观察结果与我们实验室和其他实验室先前的研究一致，这些研究证明了SLC的抗肿瘤作用[三,7]. 重要的是，虽然在我们的初步实验中，我们没有发现抗CD25单抗治疗的抗肿瘤效果比SLC单抗治疗更强（数据未显示），但在本研究中，我们发现抗CD25-mAbs治疗大大提高了SLC的抗肿瘤作用，证明了联合治疗的疗效。

肿瘤部位的树突状细胞是抗肿瘤作用的关键成分，一组研究已经证实，不成熟的树突形细胞会严重抵消这些益处[33,34]. 研究表明，瘤内注射SLC可以诱导肿瘤部位DC的成熟，这种成熟是基于SLC的治疗引起的关键抗肿瘤作用之一[6,16]，这可以部分解释我们的结果。然而，对SLC-CCR7诱导成熟的详细机制知之甚少。我们的阵列数据表明SCL-CCR7轴导致NF-κB通路中基因的上调，这对DC的成熟很重要[35,36]. 事实上，我们发现SLC通过NF-κB p65在体外有效地诱导BMDCs成熟。这一发现与最近发表的关于CCR2通过NF-κB途径介导DC成熟的研究高度一致[37]. 此外，我们还证明了CCR7的两种配体SLC和ELC对BMDC具有相同的刺激作用。这些发现对于解释为什么CCR7的这两个配体表现出部分重叠的表达谱非常重要，Reinhold Fröster等人提出了这一观点[38]. 有趣的是，我们观察到SLC诱导的NF-κB p65磷酸化比ELC更有效，这可能解释为什么SLC是CCR7体内的优先配体[2]. 总之，这些结果验证了DC成熟背后的新回路。

结论

综上所述，我们的结果表明，瘤内注射SLC和抗CD25单克隆抗体是对小鼠肝癌模型的有效治疗。这种联合治疗不仅改变了Tregs、CD4的分布⁺T细胞和CD8⁺T细胞也影响肿瘤部位的细胞因子（IL-12、IFN-γ、IL-10和TGF-β1）。这些变化构成了TME的抗肿瘤环境。此外，联合治疗系统地优化了Tregs、CD4的分布⁺T细胞和CD8⁺外周免疫器官中的T细胞。这个在体外实验证实，SLC通过NF-κB p65诱导DC成熟，这对基于SLC的治疗很重要。这些结果为肝癌的免疫治疗提供了一种诱人的策略。

方法

动物和细胞系

C57BL/6 J（H-2b）雌性小鼠，6-8周龄，购自中国科学院，饲养于复旦大学上海医学院动物饲养设施。所有动物实验均按照复旦大学实验动物机构护理委员会的规定进行。Hepa 1-6是小鼠肝细胞癌细胞系（CRL-1830，ATCC，美国），在DMEM（法国Biowest）中与10%热灭活FBS（美国GIBCO-BRL）、0.1 mM非必需氨基酸、1μM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素、100单位/ml青霉素、50μg/ml庆大霉素和0.5μg/ml真菌酮一起培养。

小鼠肝癌模型的建立

Hepa 1–6荷瘤小鼠建立如下：共3×10⁶将稀释在200μl RPMI 1640（Biowest）培养基中的Hepa 1-6细胞皮下注射到小鼠右侧。接种后一周，对可见肿瘤的小鼠进行检查，以进行进一步的实验。

小鼠肝癌的治疗

接种后第8天，荷瘤小鼠被随机分为3组，接受不同的瘤内注射：（1）对照组：50μl大鼠IgG1（2.5μg/剂量生理盐水稀释液，美国eBioScience）；（2） SLC组：50μl重组小鼠SLC（0.5μg/剂量，PeproTech，美国）；（3） 联合治疗组：50μl重组SLC（0.5μg/剂）和大鼠抗小鼠CD25单克隆抗体（克隆PC61.5，2.5μg/剂量，eBioScience）。所有注射剂均注射三次，每隔一天注射一次。在最后一次注射后的9天内，每隔一天监测肿瘤的大小和重量。肿瘤体积的计算公式为：V（V）（单位：mm^三) = 0.4(ab公司²)，其中一是长直径b条是短直径。

IHC分析

肿瘤样本在液氮中快速冷冻前嵌入OCT化合物（日本樱花）中，并在−76°C下保存，直到执行免疫组织化学程序。制备系列5μm厚的冷冻切片，并用Foxp3、CCR7、CD4、CD8抗体进行染色（eBioScience）。

蛋白质印迹

治疗后第1至9天，用RIPA裂解缓冲液（中国Beyotime）均质肿瘤组织，并使用等量的变性蛋白与CCR7、Foxp3抗体（eBioScience）进行免疫印迹。用NF-κB活化的特异性抑制剂PDTC（100μM，Sigma）预处理BMDC 1 h，然后用SLC（200 ng/ml）或ELC（200 ng/ml，PeproTech）刺激1、2、4、6、12、24 h。细胞裂解物用CCR7、NF-κB p65、磷酸化NFκB p 65、β-actin（细胞信号技术）和Lamin B1（美国圣克鲁斯）抗体进行免疫印迹。使用Band Leader软件（Magnitec，以色列）量化波段强度。

流式细胞术

肿瘤、淋巴结、脾脏和肝脏通过机械分离产生单细胞悬浮液。然后用CD4、CD25、Foxp3、CD8抗体对细胞进行染色（eBioScience）。在PDTC存在或不存在的情况下，用SLC刺激的BMDC用CCR7、CD80和CD86染色（eBioscience）。使用同种匹配抗体作为对照。所有样品均在FACSCalibur（美国Becton Dickinson）上采集，并使用WinMDI 2.9（美国）进行分析。

细胞因子ELISA

在治疗后第5天收集肿瘤组织并进行均质化，使用上清液使用商用ELISA试剂盒（eBioScience）评估细胞因子（IL-12、IFN-γ、IL-10和TGF-β1）。数据以pg/mg肿瘤组织表示。

明胶酶谱

在治疗后第5天将肿瘤组织均质化，并加载到含有明胶（1 mg/ml，Sigma，德国）的酶谱十二烷基硫酸钠凝胶上。然后将凝胶在37°C下培养24小时。用考马斯蓝R-250染色凝胶，观察酶活性。

BMDC的生成和SLC/ELC刺激

如前所述生成小鼠BMDC（骨髓来源的树突状细胞）[三]. 简言之，骨髓细胞在含有10%FBS的RPMI 1640中与GM-CSF、IL-4和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）一起培养。收获非粘附细胞，并通过抗CD11c微珠（Miltenyi，德国）进行分选。流式细胞仪分析显示，BMDCs的纯度始终超过90%，表型特征为MHC II^高的CD86型^低的.等分2×10⁶细胞在含有10%FBS和HEPES缓冲液的RPMI 1640中培养30分钟，然后用SLC或ELC刺激。

G蛋白偶联受体信号传导PathwayFinder基因阵列

通过Trizol试剂（Invitrogen，美国）从SLC刺激1或12小时的BMDC中纯化总RNA。RNA由G蛋白偶联受体信号通路查找器基因阵列（SuperArray Bioscience Corporation，USA）排列。根据GeneChip®Expression Analysis-Data Analysis Fundamentals鉴定差异表达基因。阵列重复3次。本研究中使用的数据挖掘工具包括PubMatrix(http://pubmatrix.grc.nia.nih.gov)、基因图注释器和路径分析器2.0(http://www.GenMapp.org（英文）).

统计分析

为了比较各个治疗组，进行了方差分析和Bonferroni校正。所有统计分析均使用SPSS统计软件包（SPSS 20.0 for Windows，USA）进行。差异被认为具有统计学意义*对 < 0.05和高度显著**对 < 0.01.