人类乳腺癌中SNAT1/SLC38A1的激活：与p-Akt过度表达的相关性

摘要

背景

SNAT1是氨基酸转运系统a的一个亚型，被认为在癌症的发展和进展中发挥潜在作用，但其在乳腺癌中的作用尚不清楚。在本研究中，我们检测了SNAT1在乳腺癌中的表达，并探讨了其促进乳腺癌发生的潜在机制。

方法

采用RT-PCR和Western blotting分析乳腺癌细胞系和新鲜组织中SNAT1的转录和蛋白水平。构建了包含从210名患者获得的乳腺癌标本的组织芯片块。使用免疫组织化学研究分析这些标本中SNAT1的表达。SNAT1-shRNA下调乳腺癌细胞中SNAT1的表达，并测定其功能意义。

结果

SNAT1在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中上调。SNAT1过度表达127例（60.5%）。SNAT1的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、晚期疾病、Ki-67和ER状态显著相关。内源性SNAT1的抑制导致细胞生长抑制、细胞周期阻滞和4T1细胞凋亡，并降低Akt的磷酸化水平。在人类乳腺癌样本中，SNAT1表达与p-Akt表达显著相关。

结论

Akt信号和SNAT1之间的相互作用可能在乳腺癌的发展和进展中发挥关键作用，为乳腺癌患者治疗中新的诊断标志物和新的有吸引力的靶点提供了重要的分子基础。

背景

乳腺癌是全世界女性中诊断最常见的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因[1]. 由于早期发现、治疗策略的进展以及我们对乳腺癌分子机制的理解的进步，治疗效果提高，患者生存期延长。不幸的是，全球乳腺癌发病率正在上升，大多数患者不可避免地死于癌症复发和转移[2]. 因此，有必要揭示肿瘤进展的潜在机制，并制定有效的治疗策略。到目前为止，几种致癌激酶信号通路被认为是癌症治疗的潜在靶点。在这些途径中，PI3K/Akt/mTOR信号已被证明调节细胞增殖、生长、迁移和能量代谢[三–5]. Akt的激活及其在人类乳腺癌中的临床价值已被广泛报道[4–7]. 最近，研究人员表明，氨基酸载体在各种细胞生命活动中发挥着重要作用，包括能量代谢、解毒、中子传递，最重要的是哺乳动物细胞的恶性转化。例如，L型氨基酸转运体1（LAT1）在各种人类实体瘤中被广泛研究，LAT1的表达增加与肿瘤大小、疾病晚期和Ki-67标记指数有关，因此与患者预后不良有关[8–10]. 鉴于Akt通路和氨基酸转运蛋白在肿瘤细胞营养和能量代谢中的重要性，我们假设Akt活化可能与氨基酸转运蛋白的上调有关[11].

在这些氨基酸转运体中，系统A被发现在包括胶质瘤在内的人类实体癌中过度表达[12]，肝细胞癌[13]和肝门部胆管癌[14]. 系统A氨基酸转运蛋白有三个成员：SNAT1、SNAT2和SNAT4（以前分别称为ATA1、ATA2和ATA3），由SLC38基因家族编码(Slc38a1系列,Slc38a2系列、和第38页) [15–17]. 在这三个成员中，肝细胞癌和胆管癌中SNAT1显著升高[13,14]. 敲除内源性SNAT1抑制HepG2细胞增殖[13]. 此外，SNAT1的表达与长绒癌患者的肿瘤复发和不良预后显著相关[14]. 然而，SNAT1的表达模式及其在乳腺癌发展中的作用尚未得到充分证明。

在本研究中，我们试图确定SNAT1在乳腺癌和细胞中的表达谱，并研究其与p-Akt的相关性。体外，我们进一步证实了SNAT1表达与Akt活化之间的关联，Akt激活控制细胞活力和集落形成。

方法

材料

重组小鼠EGF购自PeproTech Inc.（新泽西州落基山）。phospho-Akt（Ser473）抗体购自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）。抗-SLC38A1抗体来自英国剑桥Abcam公司。肌动蛋白和Ki-67抗体来自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）。

细胞系和培养条件

乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和4T1购自中国科学院细胞中心。MCF-7、MDA-MB-231和4T1用10%胎牛血清（FBS）保存在DMEM中（Invitrogen Corp.，Grand Island，NY）。细胞系在含有95%空气和5%CO的37°C湿化空气中培养₂.

组织样本和组织微阵列构建

2007年至2011年，来自中国江苏省昆山市第一人民医院附属医院的70名乳腺癌患者和2008年至2011年间来自中国上海市长征医院肿瘤科的140名乳腺癌病例被纳入本研究。苏木精和伊红（HE）染色切片由两位病理学家（Y.C.和G.Y.）制备和审查，以确保组织块的质量。回顾患者的病历以获取数据，包括诊断年龄、肿瘤大小、淋巴结转移和疾病分期。表中列出了这些患者特征1所有这些患者均未接受任何术前治疗，无论是放疗还是化疗。

表1乳腺癌SNAT1和p-Akt表达与临床病理因素的关系

使用手动阵列器（美国威斯康星州太阳草原Beecher Instruments公司）制作了五个石蜡包埋组织芯片块，这些石蜡包藏组织芯片块来自这些患者的正常组织和肿瘤组织标本。45例患者有一个1.5毫米的非肿瘤组织核心和两个1.5毫米原发肿瘤组织核心。其他病例只有两个1.5毫米的原发肿瘤组织核心。此外，用4个新鲜乳腺癌组织和匹配的新鲜非肿瘤组织检测SNAT1 mRNA和蛋白的表达水平。伦理审查委员会（江苏大学附属昆山第一人民医院机构审查委员会和上海长征医院机构审查理事会）批准使用所有组织和临床信息（KS2008-01和CZEC2001-01）。

RNA制备和反转录聚合酶链反应

使用AB基因总RNA分离试剂（Advanced Biotechnologies Ltd.，Epsom，Surrey，UK）从乳腺癌细胞系和均质乳腺癌样品中分离出总RNA。通过分光光度法测定RNA浓度和质量（WPA UV 1101，英国剑桥生物技术光度计）。cDNA是从每个RNA样本的1 ug中生成的，并使用转录试剂盒进行反向转录（日本京都高原市）。用特异性寡核苷酸引物对SNAT1（意义：CCAGTGCTATAGCTGGTACCAC和反义：TCCCCAGCGAAGTTGACTCAGAC）评估SNAT1的mRNA水平；作为内部对照，我们使用了β-肌动蛋白引物（义：GCTGTCACCTTCACCCGTTC和反义：CCATCGCCAAAT）。

免疫组织化学分析和免疫染色评价

制备并处理4μm石蜡包埋组织微阵列块切片，用于SNAT1（稀释1:50，ab59721；Abcam，Cambridge，UK）和p-Akt（稀释1:50736E11；CST，Beverly，MA）蛋白质染色。使用S-p试剂盒（kit-9710；中国福州梅辛）对载玻片上的抗体结合进行可视化。用苏木精进行反染色。所有切片均在不知道另一标记物表达的情况下进行评估。两名患者（C.Y.和G.Y.）在奥林巴斯CX31显微镜下（奥林巴斯，中心山谷，宾夕法尼亚州）评估了210例患者中SNAT1和p-Akt蛋白的表达。

使用半定量评分系统评估蛋白质的表达。染色等级为0–2（0=阴性染色[无任何肿瘤细胞染色]，1=弱表达[染色<25%的肿瘤细胞]，2=高表达[染色≥25%的肿瘤肿瘤细胞]）。只有2分被认为是过度表达[18]. 染色由两名对对方的发现视而不见的人独立评分。

蛋白质印迹分析

制备乳腺癌细胞系、乳腺癌标本和匹配的非肿瘤组织用于蛋白质印迹分析。使用兔抗人SNAT1（1:1000）和p-Akt（1:1000₂从驴子（阿默舍姆）身上获得的碎片。通过用抗β-肌动蛋白抗体探测相同的膜过滤器来监测相等的蛋白质样品装载量。

质粒和转染

shRNA-SNAT1和非特异性的加扰shRNA质粒购自中国上海Genechem公司。转染前24小时，1×10⁵细胞接种在六孔板中。根据制造商的说明，使用Lipofectamine™2000试剂（Invitrogen，Karlsruhe，Germany）和每孔4 ng shRNA质粒进行shRNA转染。

细胞增殖试验

转染后12小时，细胞被消化，5000个细胞接种在96周的平板中，并在含有10%FBS的培养基中培养。在24小时、48小时和72小时，进行CCK8分析（日本熊本Dojindo Kumamoto）以测量最终结果。实验独立重复三次。

集落形成分析

转染后24小时，细胞被消化并接种在6孔板中，一式三份，密度为500个细胞/孔，在37°C下持续14天。菌落用甲醇/丙酮（1:1）固定，并用结晶紫染色。对每个菌落中细胞数超过50个的菌落进行计数。

流式细胞术分析

如前所述，进行流式细胞术分析，以确定SNAT1-shRNA对细胞周期分布和凋亡的影响[19,20]. 简单来说，4T1细胞，生长在6孔板（2×10⁵细胞/孔），用基础培养基饥饿24小时后在G1/S边界同步，然后用SNAT-shRNA或shRNA载体转染48小时。在指定的时间，通过胰蛋白酶法收集细胞，并用70%乙醇固定，并按照制造商的方案（KEY GEN，中国南京）进行测量。通过流式细胞仪（FACSCalibur，BD Biosciences，Bedford，MA）分析细胞周期分布和凋亡。

统计分析

使用Microsoft Windows的SPSS 16.0统计软件程序进行统计分析。分类数据采用χ分析²统计测试。适当时，使用皮尔逊R相关系数或斯皮尔曼相关系数评估连续变量和顺序变量的组内相关性。使用Kaplan-Meier方法估计生存率，并使用对数库检验评估组间生存差异。通过使用Student t检验（双尾）确定体外结果的重要性。双面P（P）值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

乳腺癌患者SNAT1的表达

为了分析SNAT1在乳腺癌中的表达模式，我们首先检测了其在乳腺癌细胞系、乳腺癌标本和匹配的非肿瘤组织中的mRNA和蛋白水平。如图所示1与非癌组织相比，肿瘤细胞系和癌症中SNAT1 mRNA的水平较高。同样，与非癌症样本相比，对乳腺癌细胞系和癌症中SNAT1蛋白水平进行了评估（图1A2和B2）。免疫组织化学进一步证实了这一结果。

图1

SNAT1在乳腺癌细胞系和人类乳腺癌标本中的表达模式。（A1）与正常乳腺组织（SN）相比，SNAT1 mRNA在MCF-7、MDA231和4T1细胞系中过度表达；（A2）与正常乳腺组织（SN）相比，SNAT1蛋白在MCF-7、MDA231和4T1细胞系中过度表达；（B1）SNAT1 mRNA在人乳腺癌组织（T）和匹配的非癌组织（N）中过度表达；（B2）与匹配的非癌组织（N）相比，在人类乳腺癌组织（T）中观察到SNAT1蛋白的过度表达。

免疫染色显示SNAT1阳性染色优先定位于细胞质。正常乳腺样本中的上皮显示SNAT1呈阴性或弱表达（图2A） ●●●●。然而，在肿瘤细胞中观察到SNAT1表达显著增加（图2C） ●●●●。有趣的是，与来自同一样本的相邻非癌乳腺上皮相比，肿瘤细胞中SNAT1的表达上调（图2D） ●●●●。与mRNA数据一致，该分析显示乳腺癌中SNAT1蛋白水平显著高于正常邻近上皮。

图2

人类乳腺癌和邻近正常组织中SNAT1表达的分析。（A）SNAT1阴性表达的正常（非肿瘤）乳腺上皮；（B）乳腺癌组织中SNAT1的阴性表达；（C）乳腺癌组织中具有代表性的SNAT1阳性表达；（D）肿瘤细胞SNAT1高表达（T），非肿瘤性乳腺上皮SNAT1低表达（N）；A1、B1、C1、D1、D2：从一,B类,C类,D类分别是。原始放大倍数一,B类,C类,D类: 100×; A1、B1、C1、D1-2的原始放大倍数：400×。

SNAT1表达与乳腺癌临床病理特征的相关性

根据SNAT1的表达，将乳腺癌患者分为两组：SNAT1阴性表达者（n=83）和SNAT1阳性表达者（n=127）。表1总结了乳腺癌中SNAT1过度表达与临床病理参数之间的关系。SNAT1的表达与年龄、HER2和PR的表达无明显关系。然而，SNAT1的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、疾病分期、Ki-67和ER之间存在统计学意义上的相关性。SNAT1在大乳腺肿瘤（侵袭到T3-T4水平）中的激活率（94.4%）高于小乳腺肿瘤（T1-T2水平）（53.4%）；P（P）<0.001），区域淋巴结转移的乳腺癌（93.2%）比N0期肿瘤（42.6%；P（P）<0.001). 就TNM分期而言，SNAT1的过度表达与晚期疾病显著相关：III/IV期为97.6%，I/II期为50.6%(P（P）<0.001). 此外，SNAT1上调与Ki-67过度表达显著相关(P（P）=0.003）（附加文件1：图S1）和ER阴性表达(P（P）=0.002).

shRNA敲除SNAT1通过阻断Akt磷酸化诱导乳腺癌细胞生长抑制和凋亡

鉴于SNAT1的表达在乳腺癌中被显著激活，我们进一步评估了SNAT1在乳腺癌中的功能意义和潜在机制。如图所示三A、 在4T1细胞中，SNAT1-shRNA转染导致转染后48小时SNAT1蛋白表达急剧下降。我们还发现，与对照组相比，SNAT1敲低降低了4T1细胞中Akt的磷酸化水平。当用50 ng/ml EGF处理时，SNAT1和p-Akt蛋白水平均增加，而EGF增加的p-Akt-蛋白被SNAT1-shRNA部分逆转（图三B） ●●●●。SNAT1的敲除显著抑制了细胞活力（图三C） 以及菌落形成（图三D） 4T1单元。同时，与shRNA空载体转染的乳腺癌细胞相比，SNAT1-下调导致细胞周期阻滞在G0/G1，4T1细胞的凋亡增加（图三E、 F）。这些结果表明，SNAT1-shRNA对4T1细胞的抑制作用部分是通过阻断Akt磷酸化实现的。

图3

SNAT1的敲除通过抑制Akt的磷酸化诱导细胞生长抑制、细胞周期阻滞和乳腺癌细胞凋亡。（A）SNAT1-shRNA转染4T1细胞48小时后SNAT1和p-Akt表达的Western blot分析；（B）SNAT1-shRNA抑制EGF诱导p-Akt磷酸化.用SNAT1-shRNA转染4T1细胞，并加入或不加入50 ng/ml EGF。（C）在指定时间（24、48和72小时）用SNAT1-shRNA或打乱shRNA-转染细胞（sc-shRNA）转染4T1细胞，并进行细胞增殖试验；（D）转染SNAT1-shRNA和sc-shRNA的4T1细胞在6孔板中培养2周。用1-D凝胶定量软件quantity ONE计算细胞集落数；（E）用SNAT1-shRNA和sc-shRNA转染细胞48h，收集细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率；（F）转染48 h后，收集4T1细胞，用流式细胞仪分析细胞周期分布*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001认为与sc-shRNA组相比具有统计学意义。

p-Akt免疫染色为细胞质或细胞核定位。在正常乳腺样本中发现p-Akt呈阴性或弱表达（图4A） 而64.3%（135/210）的患者p-Akt表达增加。如表所示1p-Akt表达与肿瘤大小、淋巴结转移、疾病晚期和ER阴性表达之间存在显著相关性。p-Akt表达与年龄、HER、Ki67和PR状态之间没有显著关系。

图4

人类乳腺癌和邻近正常组织中p-Akt表达的分析。（A）正常（非肿瘤）乳腺上皮；（B）乳腺癌组织中p-Akt的阴性表达；（C）,D）乳腺癌组织中具有代表性的p-Akt阳性表达；A1、B1、C1、D1：从一,B类,C类,D类分别是。原始放大倍数一,B类,C类,D类: 100×; A1、B1、C1、D1-2的原始放大倍数：400×。

p-Akt和SNAT1在乳腺癌组织中的共表达

表2提出SNAT1表达与p-Akt表达显著相关（r=0.780，P（P）<0.001). 120例（57.1%）肿瘤中p-Akt和SNAT1共表达，68例（32.4%）肿瘤中两者均不表达。如图所示5在同一标本中，SNAT1表达与p-Akt表达共存。

表2乳腺癌中SNAT1与p-Akt表达的相关性

图5

具有代表性的图片显示SNAT1和p-Akt在相同患者的人类乳腺癌中的共同表达。大图片的原始放大倍数：100×；小图片的原始放大倍数：400×。

SNAT1和p-Akt过度表达对乳腺癌患者生存的影响

该队列由210名女性患者组成，中位年龄为49岁（范围为28-81岁）。这些患者的临床随访结果可用（中位随访时间为38个月；范围为19-51个月）。到随访结束时，210例患者中只有12例死于癌症。在12例患者中，11例显示SNAT1过度表达，10例显示p-Akt过度表达。SNAT1过表达肿瘤患者的中位生存期（48.8个月）明显短于非SNAT1过度表达肿瘤患者（50.8个月）(P（P）= 0.025). 与没有p-Akt过表达肿瘤的患者（50.3个月）相比，p-Akt-过表达肿瘤患者的中位生存期（49.1个月）更短(P（P）=0.167; 图6).

图6

乳腺癌患者SNAT1和p-Akt表达的预后价值。（A）SNAT1阳性表达患者的生存期（中位生存期，48.8个月）明显低于SNAT1阴性表达患者（中位存活期，50.8个月；P（P）= 0.025).（B）p-Akt阳性表达患者（中位生存期49.1个月）和p-Akt-阴性表达患者（中位数生存期50.3个月；P（P）= 0.167).

讨论

在本研究中，我们发现SNAT1的上调与（1）肿瘤大小、淋巴结转移和晚期疾病阶段显著相关，这是乳腺癌治疗和预后的最重要临床决定因素；（2） Ki-67过表达和ER阴性表达是指导乳腺癌治疗和预后的最重要生物标志物；（3） Akt活性升高，由磷酸化Akt（p-Akt）的表达决定。此外，SNAT1的敲除阻断了Akt的磷酸化，从而抑制了细胞生长并诱导了人乳腺癌4T1细胞的凋亡。因此，我们提供了新的分子证据，证明SNAT1/Akt信号的激活可能在乳腺癌的发展和进展中发挥关键作用。

谷氨酰胺在哺乳动物细胞中具有多种重要功能，谷氨酰胺跨细胞膜转运已被广泛的生理学研究[21]. 谷氨酰胺转运体（ATA1/SNAT1/SAT1/SLC38A1）是系统a转运体超家族的成员，为谷胱甘肽合成提供代谢燃料或前体[22]. 生理上，这种载体主要分布在胎盘和脑组织中[21,23]. 最近，研究人员揭示了SNAT1在人类实体恶性肿瘤中的过度表达，包括肝癌和贲门癌[13,14]. 在本研究中，与正常组织相比，乳腺癌细胞和肿瘤标本中SNAT1的表达在mRNA和蛋白质水平上均增加，表明SNAT1在乳腺癌发生中的致癌作用。免疫染色进一步证实了这一结果，结果显示SNAT1在60.5%的癌组织中表达较高，而在11.1%的副肿瘤组织中表达较低。同时，SNAT1过表达与肿瘤大小、淋巴结转移、疾病分期、Ki-67和ER阴性表达密切相关，表明SNAT1对乳腺癌的进展尤为重要。有趣的是，SNAT1过表达患者的预后较差，这进一步支持了SNAT1在癌症发展中的潜在作用，并表明SNAT1是癌症治疗的良好靶点。然而，相对较短的随访时间限制了SNAT1作为乳腺癌生存率的独立预测指标的探索。

然后我们发现，特定shRNA敲低SNAT1会降低4T1细胞的生存能力。这种抑制可能是由于SNAT1下调导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。我们的数据与一项研究一致，该研究表明siRNA介导的内源性抑制自动变速箱A1降低HepG2细胞的活性[13]. 总之，这些siRNA或shRNA实验表明SNAT1分子对维持肿瘤生存至关重要。研究表明，大鼠的母体蛋白限制抑制Akt/mTOR信号传导并下调SNAT1蛋白表达[24]. 在本研究中，用SNAT1-shRNA转染4T1细胞后，p-Akt水平下调。特别是，EGF诱导的p-Akt增加也观察到这种抑制。这些结果为Akt和SNAT1之间的串扰提供了分子基础。

人类癌症中AKT的激活诱导多个下游级联，以促进细胞生存、肿瘤生长和进展。AKT信号的去调节广泛存在于包括乳腺癌在内的多种人类癌症中。以前的研究表明，在30%～80%的乳腺癌患者中发现p-Akt过度表达[4–7]. 同样，我们的数据显示，在64.3%的病例中观察到p-Akt过度表达，并且与肿瘤大小、淋巴结转移、疾病分期和ER阴性表达显著相关。有趣的是，我们发现在相同患者的肿瘤标本中，p-Akt表达与SNAT1表达共存。SNAT1（+）/p-Akt（+）主要见于120例患者，而SNAT1。最近的一项研究支持这一观点，该研究表明，孕妇长期输注全长脂联素可同时下调Akt/mTOR信号通路和氨基酸转运蛋白活性[25]. 其他研究也揭示了其他氨基酸转运体（SLC36A1和LAT1）与Akt信号通路之间的相互作用[26,27]. 综上所述，Akt和SNAT1之间的相互作用可能在细胞生长和肿瘤转移中发挥关键作用。然而，p-Akt表达减少是通过敲除SNAT1而抑制细胞生长的反馈，还是SNAT1的直接下游靶点，还需要进一步研究。

结论

总之，SNAT1在人类乳腺癌中经常被激活，其过度激活/过度表达与肿瘤晚期和淋巴结转移有关。进一步的体外研究表明，SNAT1的敲除通过阻断Akt的磷酸化来抑制细胞生长抑制、细胞周期阻滞和4T1细胞的凋亡。Akt信号与SNAT1之间的相互作用为乳腺癌患者治疗中新的诊断标志物和新的靶点提供了重要的分子基础。