老年小鼠大脑皮层基因转录对水迷宫训练的反应模式

摘要

背景

海马体介导空间记忆的获取，但记忆痕迹最终会转移到皮层。我们通过分析水迷宫训练后的基因表达，研究了老年小鼠大脑皮层中与认知功能相关的通路的转录激活。

结果

我们发现，相对于家庭笼子条件，在探针试验或重复游泳过程中，具有准确空间表现的老年小鼠中，存在差异反应的基因。与游泳者相比，有效的学习者表现出对几种途径的显著更大激活，例如丝裂原活化蛋白激酶和胰岛素受体信号途径。与游泳运动员和家庭笼子对照组相比，熟练学习者中编码活动相关细胞骨架蛋白（Arc）和脑源性神经营养因子（BDNF）的基因上调，而编码Rho GTPase激活蛋白32（GRIT）的基因下调。我们使用原位杂交在更详细的形态学细节中探索了Arc、BDNF和GRIT表达的调控。在探测试验期间，回想增强了水迷宫学习认知成分所涉及的多个皮层区域的Arc表达，而BDNF的表达在水迷宫训练的联想和感觉运动方面所涉及的皮层区域中更为均匀地上调。相反，GRIT的表达水平在所有被检查的皮层区域都均匀降低。

结论

这些结果表明，在表现出行为能力的老年小鼠中，皮层基因转录对学习有反应，并支持跨多个皮层区室的记忆存储的分布式假设。

背景

衰老伴随着各种认知领域的表现变化。许多研究表明，认知刺激可以防止神经元功能下降，并增强海马体的结构可塑性。例如，对海马依赖性任务的训练已被证明可以促进成年神经发生[1]海马树突棘密度增加[2]在幼小的动物身上。这些增强的潜在分子机制可能涉及突触可塑性和神经营养因子表达的变化。促进突触可塑性的脑源性神经营养因子（BDNF）[三]，还能增强成年动物的海马学习能力[4,5]. 增强BDNF表达的因素，如运动，也能提高老年动物海马依赖性任务的表现[6,7]. 然而，与认知相关的转录变化在海马体以外的中枢神经系统区域的研究较少。

寻找海马体外支持海马体依赖性记忆的机制似乎违反直觉。然而，皮层结构有助于高阶信息处理，并可能有助于莫里斯水迷宫的某些方面的性能。例如，内嗅皮层背外侧带的损伤会损害水迷宫的性能[8]. 此外，内嗅皮层中组成型活性形式的钙钙调蛋白激酶II（CaMKII）的表达也减少了水迷宫中空间记忆的形成[9]. 内嗅皮层细胞外信号调节激酶（ERK）活性的药理学破坏负调节水迷宫中海马依赖性学习[10]这表明与内嗅皮层突触可塑性相关的分子机制可能有助于水迷宫的表现。

皮层神经元活动与水迷宫学习之间的关系并不仅仅限于内嗅皮层。脾后皮质损害水迷宫功能[11,12]. 视皮层和顶叶皮层的损伤损害了水迷宫学习，但用可见平台进行的预训练消除了这种关系，这表明这些皮层区域参与了水迷宫策略学习，而不是空间记忆的形成[13]. 根据病变研究结果[8]、基因操纵[9]和药理操作[10]大脑皮层和海马体的突触可塑性可能有助于水迷宫的学习。

海马体与多个皮质区（包括内嗅皮质和脾后皮质）单突触相连[14,15]. 这些联系有助于信息处理和记忆，大脑皮层区域可能在认知刺激后显示出各种不同的转录谱。在本研究中，我们使用微阵列和功能通路分析揭示，目标导向的水迷宫学习在老年小鼠皮层中诱导与突触可塑性相关的转录物，这些转录物在水迷宫中有效地发挥作用。熟练学习伴随着Arc、BDNF和GRIT在水迷宫训练的认知和感觉方面涉及的多个皮层区域的表达的广泛变化。这些观察结果表明，在一组保持有效空间学习能力的老年小鼠中，记忆回忆招募了与皮层可塑性相关的转录网络。

方法

动物和实验设计

动物护理和实验程序遵循NIH指南，并得到国家老龄动物护理和使用委员会的批准，并尽一切努力减少疼痛或不适。20个月大的雄性C57BL/6小鼠被随机分为学习组（n=10）、游泳组（n=6）或笼子组（n=6）。将家鼠对照组小鼠直接从笼子中处死，而学习者在莫里斯水迷宫中接受为期五天的训练，第六天进行探针试验。对于学习者来说，只有参与目标导向搜索的小鼠被用于分析和随后的微阵列。每次试验的一半以上时间都在漂浮（定义为以低于每秒2.0厘米的速度移动）或进行触球运动（定义为停留在水池周边4.0厘米范围内）的小鼠不包括在本研究中。学习组中有4只小鼠符合排除标准；六只小鼠根据这些参数进行目标导向学习。游泳运动员在水迷宫中无目标游泳六天。在最后一次学习或游泳试验后90分钟，牺牲了6名学员、6名游泳运动员和6名家庭笼子控制者。该时间点是根据先前的实验选择的，实验证明学习后皮质Arc mRNA表达持续诱导[16]. 用异氟醚对小鼠实施安乐死，灌注0.9%的生理盐水，然后小心地将每只小鼠的大脑从颅骨中取出。对大脑的一半进行解剖，去除皮层进行RNA提取和微阵列。将对侧半脑浸入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中进行原位杂交。

所有涉及学习和游泳的行为实验都是由同一实验者平行进行的。在实验的所有步骤中，学员、游泳运动员和家庭笼子控制装置都是一起处理的，所有小鼠都是从同一供应商（美国缅因州巴尔港Jackson Laboratories）处获得后在室内进行老化处理的。我们通过测量血糖、3-羟基丁酸盐、甘油三酯、胆固醇、皮质酮和胰岛素浓度，以及通过肉眼检查腹腔和大脑来验证小鼠的健康状况，以确认没有肿瘤。血清化学分析的结果以前有报道[7].

水迷宫训练

水迷宫训练如前所述进行[7]. 简单地说，动物接受了五天的采集训练，包括每天四次试验，试验间隔约为10分钟。每次试验持续到动物找到平台，或最多持续60秒；在60秒内未能找到平台的动物由实验者引导到那里。在每一次试验中，小鼠都被放置在水池中，面朝墙壁，开始位置因试验和天数而异。在最后一次采集训练课程结束后的一天，在没有平台的情况下，对动物进行了一次60秒的探测试验。所有培训均在光照阶段进行，即上午8:00至下午12:00（早上6:00灯亮）。

RNA提取和微阵列

如前所述进行RNA提取和微阵列分析[7]. 使用用于动物组织的Qiagen RNeasy Mini Kit（加利福尼亚州巴伦西亚市Qiangen公司）分离RNA。使用安捷伦2100生物分析仪和RNA 6000纳米芯片检查RNA的质量和数量。使用Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒（Ambion；德克萨斯州奥斯汀，cat#IL1791），使用总RNA生成生物素标记的cRNA。将总共0.75μg生物素标记的cRNA在58°C下与Illumina的Sentrix MouseRef-8表达珠芯片杂交16小时（Illuminia，San Diego，CA）。清洗、封闭阵列，并用链霉亲和素Cy3染色检测标记的cRNA。使用Illumina BeadStation 500×Genetic Analysis Systems扫描仪扫描阵列，并使用Illum BeadStudio 3.0版软件提取图像数据。

微阵列数据分析

使用基于SAS JMP7.0系统的电子表格微阵列分析程序DIANE 6.0分析微阵列数据。如前所述，对原始微阵列数据进行过滤和Z归一化，并测试其显著变化[7]. 简单地说，样本质量通过散点图和基于基因样本Z评分的层次聚类进行分析，以排除可能的异常值。初始筛选确定了Z比率≥1.96的基因，Z比率由观察到的基因Z得分平均值之间的差异除以该特定比较的所有差异的标准偏差得出。过滤后，我们能够检测到大约20000个基因。然后，通过计算错误发现率（FDR）来精炼基因，该错误发现率控制了错误拒绝假设的预期比例，并且只包括那些FDR<0.05的基因。使用单向方差分析设计进一步分析这些数据，显著性设置为p<0.05。方差分析设计比较了不同的实验条件（家庭笼子、游泳或学习）。这使我们能够确定学习和游泳动物的不同强度的转录本。

生物信息分析

在确定了受学习和游泳小鼠不同经历显著调控的单个基因后，使用功能注释聚类分析基因列表，即基因本体（GO），信号通路分析（使用京都基因和基因组百科全书（KEGG）定义的通路(http://www.genome.jp/kegg/)和功能基因网络分析（Ingenuity Pathway analysis，网址：http://www.intenuity.com/). 使用WebGestalt进行GO和KEGG通路分析(http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/)Martin等人之前描述的基于网络的基因集分析工具包[17]. 此应用程序允许将实验集中特定基因的表达频率与WebGestalt维护的背景鼠基因集中的表达频率进行比较。使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）中的Network Explorer功能，根据所得基因网络的输入数据集的基因身份介导的人口百分比（通过网络合格的焦点分子）计算所述特定基因集的人口最多的基因网络。Calvano等人对网络算法的使用和重要性生成进行了全面概述[18]. 只有当已知这些基因与网络中的至少一个其他分子相互作用时，这些基因才被视为网络合格。在每种情况下，需要两个以上的基因才能以至少小于0.05的p值充分填充给定网络。

原位杂交

在冰冻切片机上以1:12的比例在冠状面上以40μm的厚度对大脑进行切片。切片保存在4°C的磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛中。对于Arc探针合成，我们使用了先前描述的质粒[19]包含Arc转录本的几乎全长cDNA（~3 kbp）。用EcoRI限制性内切酶（Promega）切割质粒，以暴露T7结合位点。通过凝胶电泳验证切割质粒的质量，并对探针进行苯酚/氯仿提取，并在-80°C的乙醇中沉淀。³⁵然后使用Maxiscript试剂盒（Ambion）生成S-UTP标记的核糖探针，然后在-80°C下进行另一轮酚-氯仿萃取。将最终探针重新悬浮在无RNase水中，并通过闪烁计数器测定比活性。

对于BDNF和GRIT核糖探针，我们生成了如前所述的探针模板[20]. 对于BDNF，右引物gtctgacgacatcactg，左引物ccatggattacactctc；对于GRIT，右底漆为acacttgagcaagcaac，左底漆为agggaggtaatcccag。PCR产物通过限制性内切酶消化验证，然后使用通过添加T7或SP6 RNA聚合酶结合位点修改的相同PCR引物进一步扩增。通过SVgel和PCR净化试剂盒（Promega）纯化含有T7和SP6延伸的PCR产物。然后使用Maxiscript试剂盒（Ambion）生成35S-UTP标记的核糖探针。按照上述Arc质粒的闪烁计数器对探针进行提取、再悬浮和计数。

按照Stranahan等人的描述进行原位杂交[20]. 单个探针的所有组织都在相同的反应中进行处理。将游离漂浮的组织切片在0.1M磷酸盐缓冲液中的0.75%甘氨酸中洗涤两次，然后在磷酸盐缓冲液中洗涤一次。然后将切片在37°C下暴露于含有1.0μg/mL蛋白酶K的蛋白酶K缓冲液中30分钟。然后在室温下用醋酸酐溶液（11.3%三乙醇胺、0.25%醋酸酐、0.04M乙酸）处理切片10分钟。然后在2×氯化钠/柠檬酸盐缓冲液（SSC缓冲液；20×浓度，3 M氯化钠，0.3 M柠檬酸钠）中清洗两次15分钟。接下来，将切片转移到含有20%甲酰胺、0.4×Denhardt溶液、4%硫酸右旋糖酐和1.6×SSC（添加0.25 mg/mL tRNA、0.33 mg/mL剪切鲑鱼精子DNA、100 mM DTT和1×10）的杂交缓冲液中⁷cpm/毫升³⁵S-UTP标记探针，用于60°C下的过夜反应。第二天，在60℃下用4xSSC/0.01M DTT和2×SSC/50%甲酰胺清洗切片，然后在37℃下用核糖核酸酶（20μg/mL）培养30分钟。在将切片安装在载玻片上之前，用逐渐降低的SSC浓度清洗切片。将载玻片干燥过夜，暴露在荧光成像仪屏幕上，并使用ImageQuant（GE Healthcare）进行量化。为了生成每只动物的平均光密度测量值，至少采集了三个解剖匹配截面的数字图像。一位对群体条件视而不见的研究人员用手勾勒出了感兴趣的区域。

解剖取样

根据帕西诺斯和富兰克林的地图集确定了皮层区域[21]. 对于前扣带皮层，我们将扣带皮层1区和扣带皮层2区与扣带/脾后皮层区（Bregma+2.34 mm至Bregma-0.82 mm）分组。为了分析听觉皮层，我们从第二听觉皮层的腹侧区域、第二听觉皮质的背侧区域和第一听觉皮层（Bregma-1.70 mm到Bregma-3.64 mm）取样。对于内嗅皮层，我们从内侧和外侧内嗅区域取样（Bregma-2.18 mm到Bregma-5.02 mm）。在运动皮层，我们结合了初级和次级运动皮层（Bregma+2.46 mm到Bregma-1.32 mm）。在分析躯体感觉皮层的过程中，我们取了包含初级躯体感觉皮层和次级躯体感觉皮层（Bregma+1.94 mm到Bregma-2.30 mm）的切片。当从脾后皮质取样时，我们结合了脾后无颗粒皮质和脾后颗粒皮质（胸骨-0.94 mm至胸骨-4.96 mm）。最后，当测量视觉皮层中的基因表达时，我们从初级视觉皮层和次级视觉皮层的外侧和内侧区域（包括内侧和内侧亚区）取样；视觉皮层的取样范围从Bregma-1.94毫米扩展到Bregma-5.02毫米。

统计

原位杂交数据采用单向方差分析（ANOVA）进行分析，然后进行Bonferroni事后测试，以比较学习者、游泳运动员和家庭笼子控制者特定皮层区域内的基因表达。为了比较与水迷宫学习的认知和感觉运动方面相关的皮层区域的基因表达，我们使用了2×3方差分析设计和Bonferroni的事后检验。使用单向重复测量ANOVA和Bonferroni的post-hoc比较学习者和游泳运动员的行为数据。对于所有分析，统计显著性设置为p<0.05。

结果

老龄小鼠的空间记忆能力

为了评估目标导向和非目标导向活动，我们采用了莫里斯水迷宫，既没有逃生平台（非目标导向；游泳），也有标准的隐藏逃生平台（目标导向；学习）。根据材料和方法中所述的行为标准，包括或排除学习组中的老年小鼠，并且仅使用熟练的学习者进行微阵列分析。在这方面，我们比较了经历了有效学习的老年小鼠、从事体育活动的老年小鼠和老年家庭笼子对照小鼠。

游泳组和选定的熟练学习者组在训练过程中都减少了他们的路径长度，有效学习者保持的路径长度始终比游泳运动员短（图1安培; F类_1,10=22.27，p=0.008）。经过反复训练，选定的熟练学习者也更快地逃到了平台上（图1B年)而游泳者却没有机会逃脱，游了整整60秒。游泳运动员在五天的训练中降低了游泳速度，而有效学习者的子集没有降低（图1摄氏度; F类_1,10=12.45，p=0.005）。尽管学习鼠年龄较大，但在第六天的探索试验中，它们对目标象限的空间偏向证明了它们具有学习任务的能力（图一维; F类_1,39=3.26，p=0.03）。游泳运动员没有空间偏见。

图1

学习者和游泳运动员在水迷宫中的行为表现. (A类)游泳运动员和学习者都通过反复接触迷宫来缩短游泳距离。(B类)，虽然学习者通过反复训练更快地找到平台，但游泳运动员在迷宫中没有平台的情况下游泳一分钟。(C类)，对于学会寻找隐藏平台的小鼠来说，游泳速度相当恒定，但对于在迷宫中没有平台的小鼠，游泳速度会降低。(D类)，在探针试验期间，经过训练寻找隐藏平台的小鼠对目标位置表现出空间偏见，而在没有平台的情况下游泳的小鼠则不表现出空间偏向。缩写：Rt-Adj，右相邻象限；L Adj，左相邻象限；Opp，对面象限。

学习或游泳对老年C57Bl6小鼠皮层转录的差异调节

为了比较游泳和学习对大脑皮层基因转录的影响，我们确定了学习者和游泳者之间的转录物表达水平与久坐的家养动物相比存在显著差异（图2安培). 学习者展示了355个基因转录本，其表达水平与游泳运动员显著不同（图2B型; 有关区分学习和游泳的成绩单的完整列表，请参阅附加文件1). 在上调基因中，与游泳运动员相比，学习者中的Arc（活动调节细胞骨架相关蛋白）增加最多。其他学习特异性转录物包括双特异性磷酸酶（Dusp1，GenBank ID:19252；Dusp6，GenBank-ID:67603）、Jun-B癌基因（Junb，GenBank-ED:16477）、syntatogmin 13（syt13，GenBank-AD:80976）和细胞色素b5还原酶4（cyb5r4，GenBank-UD:26669）。有趣的是，学习者脑源性神经营养因子（Bdnf，GenBank ID:12064）和诱导性神经生长因子（Vgf，GenBank ID:381677）的表达高于游泳者，这意味着学习比游泳更容易诱导生长因子的表达。大约三分之二对有效学习有反应的转录物被上调，如图所示的正Z分数所示（图2摄氏度).

图2

学习和游泳招募不同的基因表达谱. (A类)遗传热图图显示，与笼子里久坐的动物相比，皮质基因通过学习或游泳协议进行调节。红色表示上调，而绿色表示下调。(B类)维恩图显示了在学习和游泳协议之后，老年小鼠皮层中表达的特定转录物。学习诱导转录物代表学习和游泳后表达的基因子集。这表明皮层基因表达将学习相关基因划分为生理激活和唤醒相关基因。(C类)，学习与游泳方案分析的个体基因z比率的数据图。观察到指示相对基因调控双向的Z比率。

学习和游泳后的差异信号通路激活

我们使用京都基因和基因组百科全书（KEGG；图3A-B型; 表1). 对学习者与游泳者差异调节基因集的信号通路分析揭示了与突触结构相关的大量通路(肌动蛋白细胞骨架,焦点粘连)，能量调节(胰岛素信号)，神经元发育(Wnt信号)以及学习和记忆的两个关键组成部分(MAPK信号). 这些通路反复与海马体的学习和记忆调节有关[7,22,23]. 因此，在空间学习任务中表现出行为熟练的小鼠同时上调了皮层神经营养因子的表达，并增加了与长期增强相关的细胞信号通路的激活。

图3

基因转录谱揭示了老年小鼠皮层中学习和游泳调节的功能类别. (A类)在20个月大的雄性C57Bl/6小鼠中，通过学习和游泳进行差异调节的转录物类别。与学习有关的信号通路，如有丝分裂原激活的蛋白激酶信号级联，在这些转录物中很突出。(B类)学习和游泳后激活了功能通路。这些途径是通过使用京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库进行分析得出的。(A类)《灵巧路径分析》（Ingenuity Pathway Analysis）不偏不倚地将学习者的成绩单归类为主要与神经系统发育相关，而学习者上调了成绩单。(B类)与游泳运动员相比，来自学习者下调基因的网络主要与细胞死亡有关。

表1学习者和游泳运动员之间差异调节基因产生的大量KEGG信号通路

由于差异学习与游泳基因集对老年大脑皮层学习和记忆的分子机制提供了独特的见解，我们决定进一步研究大脑皮层中可能支持记忆形成的连贯调节的实际基因相互作用的性质。我们使用Ingenuity Pathway Analysis确定了上调和下调基因集中最可能的基因交互网络。上调基因中得分最高的网络主要与“神经系统发育'（IPA-网络分析术语）（图3C公司)而来自下调部分的得分最高的网络主要与“细胞死亡'（IPA-网络分析术语）（图三维). 这种下调的“细胞死亡”靶向网络显示了与神经病理学相关的基因的多种相互作用，包括：；p38丝裂原活化蛋白激酶、Jun N末端激酶（JNK）和NF-κB[24]. 相反，“神经系统发育”网络显示了已知的神经营养、保护和塑性相关因子之间的多种局部相互作用，包括BDNF、Homer、Vegf、Dusp1、JunB、Vgf和Arc[6,7,24–28]. 在这方面，我们对学习诱导的基因转录变化的分析揭示了细胞死亡相关通路的减少，以及衰老小鼠皮层神经发育信号程序的恢复或维持。

学习和游泳后Arc mRNA的皮层分布

在微阵列数据和基因网络分析中，编码Arc的基因成为学习的一个重要标志，我们利用原位杂交进一步表征了Arc在老年小鼠皮层的表达调控（图4A-B型). 学习后，前扣带回皮层的Arc表达增加（F_2,16=8.051，p=0.0047；事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=3.16，p=0.01）。与此同时，内嗅皮层对学习也有反应，Arc mRNA（F_2,16=19.75，p=0.0001，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=5.26，p=0.0004）。同样在边缘回路中，学习增强了Arc在脾后皮质的表达（F_{2, 16}=11.80，p=0.001，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=3.77，p=0.0036）。在感觉皮层中，学习增强了躯体感觉皮层中的Arc信号（F_2,16=18.77，p=0.0001，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=5.007，p=0.0005），视皮层（F_2,16=14.46，p=0.0004，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=4.61，p=0.001）和听觉皮层（F_{2, 16}=7.64，p=0.006，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=3.24，p=0.008）。无论是学习还是游泳都不会诱导运动皮层的Arc表达（F_2,16=2.55，p=0.11）。与非目标导向的游泳任务相比，在运动皮层外，目标导向的学习任务选择性地增强了Arc的表达。

图4

老年小鼠学习后皮层Arc的表达模式. (A类)，代表性热图，显示了在学习、游泳或家笼条件下，Arc mRNA在衰老小鼠大脑中的表达分布。(B类)密度分析显示，学习增加了Arc在前扣带回皮层（AC）、听觉皮层（Au）、内嗅皮层（Ent）、体感皮层（Ss）、脾后皮层（Rs）和视觉皮层（Vis）的表达。学习后唯一没有显示Arc表达增加的皮层区域是运动皮层（M）。星号（*）表示采用Tukey’s post-hoc进行单因素方差分析后，在p<0.05时具有显著性。中使用的缩写(A类)与中使用的相同(B类)和(C类); 有关皮质解剖取样的详细说明，请参见材料和方法。(C类)与感觉运动区相比，在家中笼子条件下以及在迷宫中没有目标的情况下游泳后，关联皮层的Arc mRNA水平较低。学习后，这种差异不再显著，表明大脑皮层网络活动模式发生了变化。

为了确定记忆网络相关区域与感觉运动功能相关区域的反应是否不同，我们比较了具有联想或感觉运动特征的皮层区域中Arc的表达。与感觉运动区（听觉、运动、体感和视觉皮层）相比，家庭笼子控制组和游泳运动员的结合区（前扣带皮层、内嗅皮层和脾后皮层）的Arc水平均较低。相比之下，学习后感觉运动和联想皮层的Arc表达水平相似（图4摄氏度). 这表明，学习能力通过改变感觉运动和联想区域的激活比率，改变了老年小鼠皮层的网络活动模式。

老年小鼠学习后皮层BDNF的均匀上调

在我们的微阵列分析中，皮层BDNF表达显著增加。我们使用原位杂交来验证这一观察结果，并进一步评估具有更大解剖特异性的皮层BDNF水平的变化。学习所有检测区域BDNF mRNA表达升高（图5A-B级)包括前扣带（F_2,16=6.11，p=0.01，事后比较，学习与家庭笼，t₁₀=2.71，p=0.02），听觉皮层（F_2,16=9.37，p=0.002，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=4.23，p=0.002），内嗅皮层（F_2,13=13.75，p=0.001，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=4.82，p=0.001），运动皮层（F_2,16=7.13，p=0.007，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=3.38，p=0.008），体感皮层（F_2,16=8.47，p=0.004，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=3.87，p=0.003），脾后皮质（F_2,16=8.48，p=0.004，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=4.08，p=0.002）和视觉皮层（F_2,15=9.92，p=0.002，事后比较，学习与家庭笼，t₁₀=3.86，p=0.004）。由于与水迷宫训练的不同组成部分相关的皮层模块中的类似上调，学习后感觉运动和关联皮层中BDNF mRNA表达的关系没有改变（图5摄氏度). 学习后皮层BDNF表达的均匀上调与BDNF对多个皮层回路可塑性的不同贡献相一致[27,28]. 由于BDNF被一致上调，而Arc表达则更加异质，因此在记忆电路和非记忆电路中，可能存在区域特异性机制将BDNF表达与Arc诱导分离开来。

图5

老年小鼠学习后皮层BDNF表达的均匀上调. (A类)，典型的热图显示了学习、游泳或家庭笼子条件下老年小鼠大脑中BDNF mRNA的表达模式。(B类)密度分析显示，学习增强了BDNF在前扣带回皮层（AC）、听觉皮层（Au）、内嗅皮层（Ent）、运动皮层（M）、体感皮层（Ss）、脾后皮层（Rs）和视觉皮层（Vis）的表达。星号（*）表示采用Tukey’s post-hoc进行单因素方差分析后，在p<0.05时具有显著性。中使用的缩写(A类)与中使用的相同(B类)和(C类); 有关皮质解剖取样的详细说明，请参见材料和方法。(C类)BDNF mRNA的水平在水迷宫训练的联想和感觉运动方面涉及的区域之间具有可比性。

水迷宫训练后，老年小鼠皮层GRIT mRNA表达减少

编码Rho GTPase激活蛋白32（GRIT）的基因通过调节肌动蛋白细胞骨架参与突触可塑性[29]. 多种证据表明，Rho催化活性（由多种Rho GTPase激活蛋白调节）与中枢神经系统动态细胞骨架重塑事件之间存在密切的功能关系[30–32]. 在微阵列分析中学习后，GRIT表达显著下调。我们使用原位杂交进一步表征GRIT在多个皮层区域的表达变化。与微阵列数据一致，学习者的前扣带回皮层编码GRIT的mRNA水平降低（F_2,14=7.27，p=0.008，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=4.15，p=0.003），听觉皮层（F_2,12=10.08，p=0.004，事后比较，学习与家庭笼，t₁₀=3.82，p=0.005），内嗅皮层（F_2,12=12.02，p=0.002，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=4.36，p=0.002），运动皮层（F_2,14=11.22，p=0.002，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=4.74，p=0.001），体感皮层（F_2,14=8.36，p=0.005，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=4.61，p=0.001），脾后皮质（F_2,14=5.99，p=0.016，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=4.43，p=0.002）和视觉皮层（F_2,14=25.38，p=0.001，事后比较，学习与家庭笼子，t₁₀=5.77，p=0.0004）（图6A-B型). GRIT在感觉运动和联想皮层中的下调程度相似（图6摄氏度)这表明抑制该转录物参与了水迷宫学习的多个方面。

图6

老年小鼠学习后皮层GRIT表达的广泛下调. (A类)，代表性热图显示了学习、游泳或家庭笼子条件下老年小鼠大脑中GRIT mRNA表达的分布。(B类)密度分析显示，学习抑制GRIT在所有检查的皮层区域的表达，包括前扣带回（AC）、听觉皮层（Au）、内嗅皮层（Ent）、运动皮层（M）、体感皮层（Ss）、脾后皮层（Rs）和视觉皮层（Vis）。星号（*）表示采用Tukey’s post-hoc进行单因素方差分析后，在p<0.05时具有显著性。中使用的缩写(A类)与中使用的相同(B类)和(C类); 有关皮质解剖取样的详细说明，请参见材料和方法。(C类)GRIT mRNA水平在学习后降低，与水迷宫学习的联想和感觉运动相关的皮层区域的GRIT mRNA水平相似。

讨论

我们进行了转录分析，以研究老年小鼠学习对皮层基因表达的调节。皮层转录谱及其相关信号通路表明，与突触可塑性增强相关的许多分子和细胞特性是在学习后诱导的。学习特异性特征诱导Arc和BDNF表达，并抑制衰老皮层多个区域的GRIT转录。对学习的广泛转录反应支持了心理活动在调节衰老大脑中支持突触功能的基因中的作用。

学习的转录反应主要由符合我们上调统计标准的基因组成。这与之前的观察相反，学习和游泳后的海马基因表达模式可归因于双向转录调节[7]. 这种差异可能反映了海马体和皮层转录机制对联想记忆形成的不同贡献。虽然海马体有助于水迷宫中空间记忆的获取，但平台位置的联想表示可能存储在皮层中。由于组织样本是在训练六天后采集的，当动物达到渐进表现时，我们在微阵列数据中观察到的转录上调趋势可能归因于跨多个皮层区域的分布式记忆存储。

我们的微阵列数据是大脑皮层不同区域发生的不同转录机制的总和。我们计划通过研究多个小尺度皮层区域转录活性的不同机制，包括对初级和次级感觉皮层的单独分析，最终开展进一步的研究，以巩固我们目前的发现。然而，从我们的原位杂交分析中可以明显看出，大多数皮层区域对六天训练的反应是Arc和BDNF表达增加，GRIT mRNA减少。在某种程度上，Arc、BDNF和GRIT可以作为突触可塑性的一般指标，然后，我们可以推测，大脑皮层的多个区域对学习的反应是突触功能的改变，正如我们对全球基因表达的网络分析所观察到的那样。在这方面，我们的原位杂交结果具有很强的解剖分辨率，与我们的微阵列结果一致，微阵列使用的是来自全球皮质RNA的样本。虽然我们的转录分析对学习活动的基因组反应产生了广泛的评价，单靠这些分析可能无法最清楚地了解学习活动的神经生理学反应。通过对类似行为范式的定量蛋白质组反应进行额外研究，可以获得此类神经生理学反应的更完整图片。因此，对这些行为范式的定量基因组和蛋白质组反应的互补分析，在未来可能会对空间学习中涉及的无数复杂和微妙的神经元过程提供最好的概述。

通过基因网络分析，我们进一步确定了老年大脑皮层学习特异性反应机制的关键因素。微阵列和原位杂交显示，电弧诱导对学习具有特异性。这表明某些基因（如Arc）可以区分目标导向学习和非目标导向游泳。对学习诱导的皮层变化的转录差异进行的更详细的检查表明，通过促进促神经营养因子的联系增加，同时减弱更具破坏性的功能机制，对目标任务的挑战做出了一致的反应。因此，使用学习下调基因集创建的最有可能的功能基因网络参与调节细胞死亡机制。在以学习特异性方式上调的基因中，最有可能存在统计学意义上的基因网络，具有强大的发育表型。该网络由多种神经营养和塑性相关因子组成，如BDNF、Vgf和Arc。Arc合成对于巩固海马LTP和水迷宫中空间记忆的形成是必要的[33]. 与游泳运动员相比，学习者大脑皮层电弧的广泛诱导与之前幼鼠的数据一致[34]这意味着水迷宫训练可能会在衰老小鼠皮层的多个区域诱导LTP。此外，根据学习者和游泳运动员BDNF和Vgf表达的差异，生长因子的表达似乎是由认知刺激诱导的，而不是在迷宫中没有目标的情况下游泳。

结论

认知刺激对健康老龄化至关重要。如当前研究所示，保持有效学习能力的老年小鼠在认知刺激后也会增加其塑性相关基因的表达。虽然皮层基因转录的变化在整个寿命中对学习的功能贡献仍有待确定，但了解转录对学习的反应可能为在衰老期间维持或增强认知功能的新疗法铺平道路。