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研究文章内分泌学 免费访问|10.1172/JCI79264号
1美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院医学系糖尿病科。
2匹兹堡大学医学院,美国宾夕法尼亚州匹兹堡。
三美国科罗拉多州丹佛市国家犹太卫生部儿科。
4代谢、内分泌和糖尿病,密歇根大学,美国密歇根州安娜堡。
通信地址:美国马萨诸塞州伍斯特市种植园街368号麻省大学医学院糖尿病科Laura C.Alonso,邮编:01605,电话:774.455.3640;电子邮件:Laura.Alonso@umassmede.du.
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4代谢、内分泌学和糖尿病,密歇根大学,美国密歇根州安娜堡。
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1美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院医学部糖尿病科。
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2015年9月21日出版-更多信息
尽管干细胞群可以介导皮肤、血液和肠道等快速更新组织的再生,但对于某些更新较慢的组织,如胰岛,还没有发现干细胞库。尽管缺乏可识别的干细胞,但小鼠胰腺β细胞数量随着胰岛素需求的增加而增加。血统追踪显示,新的β细胞是由成熟、分化的β细胞增殖产生的;然而,这些成熟细胞感知全身胰岛素需求并启动增殖反应的机制尚不清楚。在这里,我们确定了β细胞未折叠蛋白反应(UPR),它感测胰岛素的产生,作为β细胞增殖的调节器。利用遗传和生理模型,我们确定在β细胞群中,那些具有活跃UPR的细胞更有可能增殖。此外,阈下内质网应激(ER应激)通过激活ATF6驱动胰岛素需求诱导的β细胞增殖。我们还证实,UPR调节人类β细胞的增殖,表明治疗性UPR调节有可能扩大糖尿病风险人群的β细胞质量。总之,这项工作定义了一个独立于干细胞的组织稳态模型,其中分化分泌细胞使用UPR传感器来调整器官大小以满足需求。
当胰岛β细胞由于失去β细胞质量和功能而不能满足胰岛素需求时,就会发生糖尿病(1,2). 在导致糖尿病的终末期螺旋中,β细胞的质量和功能通过失代偿内质网应激(ER应激)联系在一起。过度工作的β细胞更容易死亡,导致β细胞质量损失;β细胞的损失增加了对剩余β细胞的压力,损害了它们的功能(三–7). 对于1型和2型糖尿病,一个重要的治疗目标是找到再生β细胞的工具,以恢复内源性胰岛素生产能力。
一些小鼠菌株因胰岛素需求增加而显著增加β细胞数量(8). 胰岛中没有发现局部干细胞群,造血干细胞也不参与β细胞扩增(9). 血统追踪研究表明,在成年小鼠中生成新β细胞的主要方法是完全分化成熟β细胞的增殖(10,11). 事实上,据报道,所有的β细胞都具有生成新β细胞的同等能力,这意味着一种不同的组织稳态模型,其中增殖库由完全分化的细胞组成(12,13). 由于β细胞的增殖速度受到宿主代谢环境的强烈影响(14–16)在某些情况下胜过胰岛固有因子(17,18)该领域的工作模式是循环因子调节β细胞增殖。已经提出了许多不同的信号来驱动β细胞增殖以响应胰岛素需求,主要是营养素(14,15,19,20)和生长因子(8,21–23). 然而,没有循环信号可以解释所有的观察结果,而远距离器官感应胰岛素需求并引导β细胞增殖的模型是复杂的间接模型。
在这里,我们提供了支持一个更简单假设的证据:β细胞本身通过激活未折叠蛋白反应(UPR)分泌肽合成传感器来感知未满足的胰岛素需求,从而触发增殖反应。当需求增加时,β细胞会增加胰岛素原的合成,激活UPR(三,7). 我们发现,具有活跃UPR的β细胞更有可能增殖,轻度的额外内质网应激会增加高糖环境下的增殖,并且在几种不同的模型中,UPR激活是驱动增殖所必需的。我们追踪增殖信号至ATF6途径,并验证UPR也调节人类β细胞的增殖(所有ATF6实例均指ATF6α)。总之,这些发现概述了胰岛素需求调节β细胞数量的机制,并提出了一种独立于干细胞的组织内稳态模型,其中分泌细胞利用UPR机制感知需求,并在需求超过容量时增加细胞数量。
蛋白质组学筛选以确定体内β细胞增殖的驱动因素,揭示UPR激活而无失代偿。高血糖增加胰岛素需求。在小鼠中,通过直接静脉输注葡萄糖适度提高血糖可增加β细胞增殖(15,24,25). 为了确定驱动β细胞增殖的新途径,在正常或升高血糖下暴露4天后分离胰岛(补充图1; 本文的在线补充材料;数字对象标识:10.1172/JCI79264DS1)并进行了基于凝胶的二维蛋白质组学筛选(图1A和补充表1). 大多数表达改变的蛋白质与肽合成和分泌途径有关,包括ER驻留蛋白和经典UPR指示剂BiP(也称为GRP78,最初发现是在葡萄糖饥饿期间诱导的;参考文献。26)PDIA3-ERp57是内质网应激反应激活的另一个敏感早期指标(27). RNA分析证实,在体内葡萄糖暴露期间,胰岛中的UPR活性增加商业保险,附件6、和拼接Xbp公司(个)Xbp公司) (图1,B–E). 与该模型中的低β细胞死亡率一致(15,24),印章作为失代偿内质网应激的标志物,没有升高(图1D). 输注后分离的胰岛的免疫印迹也显示体内高血糖激活了UPR,真核细胞起始因子2α(p-eIF2α)和sXBP的转录磷酸化增加,以及增殖标记物PCNA(图1F和补充图1,D–F). 透射电子显微镜证实,在体内暴露于轻度高血糖后,β细胞中缺乏失代偿内质网应激的形态学证据(图1,G–J). 因此,体内中度持续高血糖(刺激β细胞增殖的条件)也会导致UPR激活而不失代偿。
增殖状态下胰岛的蛋白质组学筛查显示UPR激活而ER未失代偿。(A类)体内高血糖4天后对胰岛进行蛋白质组学筛选,提示分泌途径肽合成和UPR激活。(B类–E类)体内葡萄糖暴露后胰岛RNA分析证实UPR激活(商业保险,附件6,秒Xbp公司)无失代偿(CHOP;n个= 4–8). (F类)免疫印迹证实增殖(PCNA)增加,sXBP和p-eIF2α蛋白水平增加(n个= 4). 在p-eIF2印迹中可以看到PCNA带,因为PCNA是首先被探测到的,并且膜没有被剥离。免疫印迹定量补充图1. (G公司–J型)输注后的胰腺透射电镜显示,高血糖小鼠β细胞中的粗面内质网正常,未分化,证实没有失代偿内质网应激(典型图像;n个=3只葡萄糖注射小鼠[Glu]和n个=评估了4个对照[Sal])。香港,家政基因。数据表示为平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01(按学生)t吨测试。Un,未插片;Sp,拼接。比例尺,500 nm。
为了便于测试UPR和增殖之间的关系,建立了一个体外模型,其中新鲜分离的初级分散的小鼠胰岛细胞在低或高糖中培养。体外葡萄糖暴露概括了蛋白质组学筛选中检测到的肽折叠、ER相关降解和分泌途径成员的体内诱导(补充图2A). 根据BrdU测量,葡萄糖治疗增加了增殖(图2,A和B),Ki67号机组、和太平洋航空公司(图2、C和D). 葡萄糖也可诱导UPR,如增加的商业保险和钙网蛋白(图2E),秒Xbp公司(图2F),p-eIF2α,ATF6(图2、G和H),以及ATF6和XBP的已知转录靶点(图2,I和J),同时减少失代偿标志物CHOP(图2K; 这些免疫印迹的定量和其他数据见补充图2,B–K、和补充图3). 因此,胰岛对体内或体外高血糖引起的胰岛素需求增加作出反应,激活增殖和UPR而不失代偿。
体外增殖葡萄糖治疗激活胰岛细胞UPR而不失代偿。(A类–K(K))将小鼠胰岛分散并培养在无涂层玻璃上(A类和B类)或塑料(C类–K(K))72小时(A类,B类,D类,G公司、和K(K))或48小时(C类,E类,F类、和H(H)–J型). 用BrdU掺入法测定15 mM葡萄糖中β细胞增殖增加(A类和B类;n个=3)和增殖标记物Ki67和PCNA的丰度(C类;n个=3)或免疫印迹(D类). 箭头输入A类表示BrdU阳性β细胞。增殖胰岛细胞培养中UPR标记物BiP和钙网蛋白(CalR)增加(D类免疫印迹;E类、qPCR、,n个= 3). 所有3条经典UPR通路在15 mM葡萄糖中均被激活:sXbp公司(F类; RNA分析,n个=3),p-eIF2α(G公司、免疫印迹)和ATF6(G公司免疫印迹;H(H)、qPCR、,n个=3),以及ATF6和XBP转录靶点(我和J型,n个= 3). 失代偿标记物CHOP在5 mM葡萄糖中最高(K(K)). 免疫印迹D类,G公司、和K(K)是以下方面的代表性示例n个=5-9个独立重复;量化D类,F类,G公司、和K(K)在中找到补充图2.HK,持家基因。中的图像A类在×200放大倍数下采集。(A类–K(K))数字5、7.5和15表示葡萄糖浓度。数据表示为平均值±SEM*P(P)<0.05和**P(P)<0.01(按学生)t吨测试。
具有活跃UPR的β细胞更有可能增殖。胰岛包含混合的细胞群,包括β细胞本身的巨大异质性。在β细胞群中,我们假设一些细胞可能会因胰岛素生成增加而激活UPR,而不同的亚群可能会因增殖而产生反应。为了以细胞为单位评估UPR激活,对胰腺切片进行BiP免疫染色。胰岛素阳性细胞中BiP表达不均匀,体内高血糖暴露增加了BiP高表达β细胞的比例(图3,A和B). 体外葡萄糖治疗也增加了含有高水平BiP的β细胞的数量(图3C). 为了确定具有活跃UPR的β细胞与增殖的β细胞是相同的还是不同的,对胰腺切片进行胰岛素、BiP和PCNA的联合免疫维护。令人惊讶的是,肉眼观察表明许多PCNA阳性的β细胞也有高BiP表达(图3,D–G). 定量证实,在暴露于高血糖的小鼠中,有证据表明活性UPR的细胞中β细胞增殖实际上更频繁(图3H). 在未应激的正常血糖小鼠(生理盐水输注,图3H). 为了了解这一观察结果是高血糖环境所特有的,还是可能是胰岛素需求增加的一个特征,我们在第二种β细胞适应模型,即高脂饮食喂养小鼠(HFD喂养小鼠)中重复了该实验(28). 在这些小鼠中,UPR活性细胞中的β细胞增殖也更频繁(图3I)尽管血糖正常(对照组饮食144±8 mg/dl,高脂饮食127±11 mg/dl),但提示UPR活跃的β细胞增殖增加可能是胰岛素需求补偿的一般特征。
在胰岛素需求增加期间激活UPR的β细胞更有可能增殖。(A类和B类)β细胞BiP在葡萄糖灌注小鼠胰腺切片中的表达不均匀;高血糖增加了BiP高表达的β细胞数量。代表性图像显示自n个=3(盐水)和n个=4只(葡萄糖)小鼠。(C类)在体外,葡萄糖增加了BiP高表达的原代小鼠胰岛细胞(门控胰岛素[+])的数量。(D类–G公司)在高血糖小鼠的胰腺切片中,PCNA染色经常出现在BiP高表达的β细胞中(箭头),而在BiP低表达的β电池中较少出现(箭头)。(H(H)和我)高血糖胰腺切片(H(H))或高脂肪饲料(我)小鼠,含有高BiP的β细胞更有可能是PCNA阳性(n个= 3–5). (J型和K(K))体外,通过流式细胞术,葡萄糖增加了原代小鼠β细胞BrdU掺入量和细胞数量(n个= 3). (L(左)–N个)在葡萄糖刺激下,BiP高的小鼠β细胞更有可能是BrdU阳性(n个= 3). (O(运行))相反,在过度表达cyclin D2的原代小鼠β细胞中,BrdU掺入并不局限于高BiP表达细胞。(A类和D类–G公司)放大倍数为200倍的图像。中的图像D类–G公司和中的流量图C类,L(左),M(M)、和O(运行)代表n个=3-5个实验。数据表示为平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)方差分析结果<0.001(H(H),我、和N个)或学生的t吨测试(J型和K(K)).
我们证实了活性UPR与体外原代分散小鼠β细胞增殖之间的相关性。在15 mM葡萄糖中培养小鼠胰岛细胞增加了β细胞增殖和总细胞数(图3、J和K). 在这些培养物中,BiP水平高的细胞更有可能合并BrdU(图3,L–N). 为了测试UPR激活是否是准备进入细胞周期的结果,我们评估了通过直接操纵细胞周期诱导增殖的β细胞中的BiP水平。在过度表达cyclin D2的β细胞中,许多含有BrdU的细胞具有中或低水平的BiP,这与BiP与增殖之间的相关性是由于增殖过程中BiP的诱导这一解释相矛盾(图3O). 总之,我们得出结论,具有活性UPR的β细胞比没有活性UPR的β细胞更有可能增殖。
轻度UPR激活可在高糖环境下促进体外β细胞增殖。尽管文献中有大量证据表明失代偿内质网应激会导致β细胞死亡(三–7)观察到的UPR和增殖之间的相关性使我们考虑到适度的UPR激活实际上可能促进β细胞增殖的假设。为了验证这一点,通过干扰内质网钙处理(thapsigargin,Tg)或糖基化(tunicamycin,Tm),用不同机制诱导内质网应激的小分子培养原代小鼠胰岛细胞。由于这些药物的通常浓度(Tg为1μM,Tm为1–10μg/ml)会导致失代偿性内质网应激和细胞死亡,因此我们应用了广泛的浓度范围,从比通常剂量低2–3个数量级开始。通过免疫印迹检测CHOP或caspase 3评估失代偿内质网应激,我们证实这些药物在正常浓度下会导致小鼠原代胰岛细胞严重内质网紧张和细胞死亡(图4,A和B、和补充图4). 通过PCNA免疫印迹,高糖诱导增殖,符合预期。有趣的是,低剂量的Tg或Tm进一步增加了在15 mM葡萄糖中培养的胰岛细胞中PCNA的丰度,在一个突然的剂量阈值上,PCNA消失,CHOP和caspase 3被诱导。为了确定混合胰岛细胞群中PCNA丰度增加是否代表β细胞增殖增加,用低剂量Tg或Tm处理培养物,并通过BrdU掺入分析增殖情况。值得注意的是,在15 mM葡萄糖中,这两种药物都比载体对照增加了小鼠β细胞的增殖(图4,C–E、和补充图5和6). 尽管分散的胰岛BrdU增殖试验从一个胰岛制剂到下一个制剂产生不同的最大增殖,尽管采取了多种预防措施来标准化该试验(见方法),但Tg和Tm的促增殖作用是一个一致的发现。增殖效应取决于葡萄糖浓度:在5 mM葡萄糖(通常的胰岛培养基)中,低剂量Tg和Tm可诱导明显的毒性,细胞丢失且无增殖,而在10–15 mM葡萄糖中可观察到增殖效应。考虑到该领域的担忧,即BrdU掺入并不总是表明细胞增殖,我们进一步证实了PCNA免疫印迹和BrdU免疫染色,即有丝分裂的标记物磷酸-胆固醇H3(pHH3)免疫染色。Tg和Tm都增加了pHH3的β细胞染色百分比(图4,F和G). 为了测试直接应激ER是否能增加β细胞增殖,用表达腺病毒的小鼠胰岛细胞转导2英寸C96Y型(秋田)。秋田胰岛素原表达也增加了β细胞BrdU掺入(图4H). 除了对增殖进行组织化学评估外,我们还假设增殖增加会增加培养孔中的细胞数量。通过流式细胞术,在15mM葡萄糖中培养,与5mM对照相比,胰岛细胞和β细胞的数量增加,但α细胞的数量没有增加(图4,I–K、和补充图6和7). 低剂量Tg和低剂量Tm,而不是高剂量Tg,增加了培养孔中的β细胞数量,再次支持了增殖效应。比较细胞计数包括一些样品中增殖细胞的增加和其他样品中死亡细胞的丢失,例如在5 mM葡萄糖条件下(见下文)。虽然我们不认为低剂量Tg和Tm暴露会导致细胞死亡,因为CHOP和激活的caspase 3水平较低(图4,A和B),我们通过Annexin V/碘化丙啶染色直接测量细胞死亡(图4L和补充图8). 正如预期的那样,阳性对照组(高剂量Tg)中检测到强烈的细胞死亡,但暴露于增殖剂量Tg的原代胰岛细胞中的细胞死亡较低,与15 mM葡萄糖对照组相当。在5 mM葡萄糖条件下,细胞死亡增加,这可能解释了在低葡萄糖条件下对Tg和Tm的敏感性明显增加,并导致5 mM和15 mM葡萄糖之间的细胞数在流量计数上的差异。最后,为了排除BrdU掺入是DNA损伤的假象的可能性,对培养物进行BrdU和γ-H2AX的共免疫染色。用葡萄糖或增殖剂量的Tg或Tm治疗后,大多数BrdU阳性细胞核的γ-H2AX为阴性(补充图9). 综上所述,这些数据表明,通过干扰2种不同的内质网维持系统,诱导轻度的非补偿内质网应激足以在体外诱导β细胞以葡萄糖依赖的方式增殖。
体外激活轻度UPR可增加β细胞增殖和β细胞数量。(A类和B类)在原代小鼠胰岛细胞中,低剂量Tg(2–20 nM)或Tm(10–100 ng/ml)可进一步增加由15 mM葡萄糖诱导的PCNA。明显存在明显的药物剂量阈值;在较高剂量的Tg或Tm下,PCNA突然丢失,失代偿标记物CHOP(A类)和激活的caspase 3(B类)被诱导。波段以下的数字是平均波段强度量化n个=5-7个免疫印迹;平均值图见补充图4. *P(P)<0.05 vs.15 mM车辆。(C类–E类)低剂量Tg或Tm处理的小鼠胰岛细胞在高糖下增加增殖(n个= 3). (F类和G公司)磷酸化氢istone H3证实细胞增殖(n个= 3). (H(H))秋田胰岛素原的表达促进β细胞增殖(n个= 5). (我–L(左))流式细胞仪定量细胞计数显示低剂量Tg和Tm处理的培养物中β细胞数量增加(n个= 5–7). (J型和K(K))低剂量Tg不会诱导细胞死亡(n个= 4). (C类和F类)放大倍数为200倍的图像。数据表示为平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)<0.001,以及†P(P)方差分析结果<0.0001。P(P)中的值A类,B类,G公司、和我–L(左)是相对于15mM载体。
体内内质网应激在失代偿前诱导β细胞增殖。由于体外实验表明,适应性UPR激活可促进增殖,因此我们询问内质网应激是否会在体内推动β细胞增殖。我们首先研究了瘦素受体缺陷分贝/分贝C57BLKS基因背景的小鼠。这些小鼠是一个成熟的β细胞内质网应激模型,这是由于胰岛素抵抗导致的胰岛素需求增加和C57BLKS基因影响的结合,而C57BLKS基因容易导致β细胞内质网应激和失败(29–32). 4周大时,分贝/分贝小鼠的体重和血糖仍接近正常,但通过BiP免疫染色检测,它们显示出UPR激活(图5,A–D). 与早期或轻度UPR促进增殖的假设一致,β细胞增殖在数据库/数据库4周龄的小鼠在成年后肥胖、糖尿病以及胰岛β细胞丢失时下降到与对照组相同的水平(图5,A–E). 因此,在分贝/分贝-β细胞应激的C57BLKS模型,β细胞增殖早期增加(当UPR存在但强度较低或持续时间较短时),但当失代偿发生时(当应激强度较大或持续时间较长时),增殖后期消失。
体内内质网应激在失代偿前增加β细胞增殖。(A类–E类)分贝/分贝/当存在UPR但胰岛失代偿前,BLKS小鼠的β细胞增殖增加。(A类和B类)年体重和血糖接近正常分贝/分贝小鼠在4周龄时,但在11-14周龄时出现肥胖和糖尿病(成年;n个= 3–5). (C类–E类)4周大时,UPR已经活跃(D类)β细胞增殖增加(n个= 4–6;C类和E类). 成人分贝/分贝小鼠β细胞失代偿明显(高血糖、胰岛形态丧失;n个= 6–10). (F类–K(K))内质网应激直接作用于β细胞足以增加体内β细胞的增殖。(F类–H(H))杂合秋田小鼠在2周龄和3周龄时血糖和体重正常,但在4周龄时出现高血糖(n个= 4–22). 胰腺切片显示2周大时UPR已经激活。(我–K(K))在2周龄和3周龄时,即UPR活跃但失代偿开始前,BrdU掺入升高(n个= 3–5). (K(K))使用PCNA染色证实2-3周龄Akitaβ细胞的增殖(n个= 5–11). (D类,E类,H(H)、和我)放大倍数为200倍的图像。数据表示为平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)<0.001(学生)t吨测试。
为了确定直接作用于β细胞的内质网应激是否会增加体内β细胞的增殖,我们研究了杂合子2英寸C96Y型/+(本文称为秋田)小鼠,其中一个突变的胰岛素原(4个胰岛素等位基因中的1个)由于不正确的二硫键形成而导致β细胞内质网应激(32,33). 这些小鼠出生时糖耐量正常,但成年后由于内质网应激诱导的β细胞衰竭而成为糖尿病小鼠(34,35). 在我们的群体中,秋田幼犬在2周龄和3周龄时体重和血糖正常,在4周龄时出现糖尿病(图5,F和G). BiP免疫染色显示,早在2周龄时UPR就活跃,3-4周龄时出现异常的β细胞形态(不均匀的胰岛素染色)(图5,H和I). 再次与我们的假设一致,通过BrdU掺入测量并通过PCNA染色证实,β细胞增殖在2周时增加,在3周时减少,并且在4周时不再升高,此时严重应激明显(图5,I–K). 因此,两组中的β细胞增殖均升高分贝/分贝和秋田小鼠在内质网应激开始后早期,但在胰岛失代偿时消失。总之,4种不同的内质网应激源——干扰内质网钙处理、阻止内质网蛋白糖基化、β细胞内质网紧张敏感背景中的瘦素受体缺乏以及内质网中错误折叠的胰岛素原的负载——都导致了β细胞增殖增加。这些数据与轻度或早期UPR促进β细胞增殖的假设一致。
胰岛素需求诱导的体外和体内β细胞增殖需要UPR激活。为了了解体外培养的β细胞对葡萄糖的增殖反应是否需要UPR激活,我们将两种化学伴侣——牛磺脱氧胆酸(TUDCA)和4-苯丁酸(PBA)应用于胰岛细胞培养,这两种药物可以减少内质网应激。这两种化学伴侣降低了胰岛培养中葡萄糖诱导的内质网应激,同时降低了p-eIF2α、p-IRE1和ATF6(图6A). PCNA的免疫印迹表明,这两种伴侣也降低了葡萄糖诱导的胰岛细胞增殖(图6、B和C). 使用免疫荧光法评估伴侣对β细胞增殖的特异性影响,我们证实,添加任一伴侣都可以阻止葡萄糖诱导的β细胞增殖增加(图6、D和E). 为了排除药物非特异性抑制细胞分裂或掺入BrdU标签所需的某些机制的可能性,我们在通过过度表达细胞周期蛋白D2激活细胞周期的同时重复了该实验。伴侣蛋白再次阻断了葡萄糖诱导的增殖,但对过度表达cyclin D2的胰岛细胞中BrdU掺入没有影响,这表明该结果不是由于非特异性毒性所致(图6,F和G).
葡萄糖诱导的β细胞体外增殖需要UPR激活。(A类)化学伴侣TUDCA和PBA通过15 mM葡萄糖降低小鼠胰岛细胞UPR激活。(B类和C类)伴侣TUDCA和PBA可降低PCNA的葡萄糖诱导。免疫印迹A类和B类代表n个=3-4个独立实验。(D类和E类)用TUDCA或PBA缓解内质网应激可阻止葡萄糖诱导的小鼠β细胞增殖(n个= 4). (F类和G公司)TUDCA和PBA都没有减少过表达细胞周期蛋白D2诱导的增殖,反对对BrdU摄取或增殖的非特异性毒性作用(n个= 3). 数据表示为平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)方差分析结果<0.001。
为了测试胰岛素需求诱导的体内β细胞增殖是否需要内质网应激,在安乐死前2天,对β细胞内质网负荷增加的小鼠模型进行对照或静脉注射TUDCA。胰腺切片的免疫荧光显示,TUDCA暴露降低了β细胞内质网应激标记物BiP的丰度(图7A). TUDCA治疗显著降低秋田β细胞增殖(图7、B和C),分贝/分贝-黑色(图7、D和E)和HFD喂养小鼠(图7,F和G),在这个时间段内不降低血糖(补充图10)或阻止肠道BrdU掺入(Rohit Sharma,未发表的观察结果)。需要注意的是,小分子抑制剂可能会对其他途径或组织产生非靶向效应,TUDCA可能会降低高需求状态下的代谢需求,例如HFD-fed或分贝/分贝老鼠(36)这些结果表明,体内胰岛素需求或内质网应激驱动的β细胞增殖可能需要UPR激活。
体内胰岛素需求诱导的β细胞增殖需要UPR激活。(A类)安乐死前2天每天两次静脉注射TUDCA可降低秋田和分贝/分贝-BLKS ER负荷模型。图像代表了n个=3个生物复制。(B类–G公司)每天两次静脉注射TUDCA两天可降低2周龄Akita小鼠的β细胞增殖(B类和C类;n个=3–5),4周龄分贝/分贝老鼠(D类和E类;n个=5–13),在喂食HFD的小鼠中(F类和G公司;n个= 5–8). 图像是在放大倍数为200倍的条件下采集的。箭头指向BrdU-阳性β细胞。数据表示为平均值±SEM*P(P)<0.05和**P(P)方差分析显示<0.01。
ATF6对于促进β细胞增殖是必要的,也是足够的。UPR反应由三条典型途径组成:PERK/eIF2α、IRE1/XBP1和ATF6(三,7). 在原代小鼠胰岛细胞培养物中,葡萄糖激活了所有3条通路(图2,F–J). 为了确定这些途径中的一条或多条是否介导β细胞中葡萄糖的增殖反应,使用小分子分别抑制了原代小鼠胰岛细胞中的每条途径(补充图3和11; 参考文献。37–39). ATF6和IRE1抑制剂均能降低葡萄糖诱导的增殖,但不受PERK抑制剂的影响(图8A). 相反,这些抑制剂都没有减少细胞周期蛋白D2过度表达引起的细胞周期进入,这与非特异性毒性相矛盾(图8A). 免疫印迹显示ATF6和IRE1抑制剂,而不是PERK抑制剂,也降低了原代胰岛细胞培养物中PCNA的丰度(图8B). 为了测试激活IRE1或ATF6通路是否诱导β细胞增殖,采用电穿孔法在原代小鼠胰岛细胞中过度表达IRE1、剪接(活性)XBP1或ATF6(图8,C–G、和补充图12). 令人惊讶的是,鉴于IRE1抑制剂降低了增殖,IRE1或sXBP1的过度表达也降低了15 mM葡萄糖中β细胞的增殖(图8、D和G). 然而,ATF6过度表达足以增加β细胞增殖(图8G). 为了测试葡萄糖诱导的增殖是否需要IRE1或ATF6,使用shRNA降低分散的胰岛细胞中的表达(图8,H–P). 与抑制剂实验类似,ATF6或IRE1表达的下调降低了葡萄糖诱导的BrdU掺入(图8,I和J). 然而,只有ATF6敲除显著降低PCNA丰度(图8,K–P). 总之,这些结果表明ATF6对于葡萄糖诱导的小鼠β细胞增殖是必要的,并且足够的,IRE1/XBP在任何方向上的扰动都会干扰增殖,但该途径不足以驱动增殖。
ATF6通路对于葡萄糖诱导的体外β细胞增殖是必要的和充分的。(A类)在原代小鼠β细胞中,ATF6和IRE1通路的小分子抑制剂显著降低了葡萄糖诱导的增殖,而PERK抑制剂则没有显著降低(n个= 3–4). 细胞周期蛋白D2过度表达直接激活细胞周期不受影响,这与非特异性毒性相矛盾。(B类)免疫印迹显示,ATF6和IRE1抑制剂均能降低葡萄糖诱导的胰岛细胞PCNA(n个= 3). (C类–G公司)IRE1过度表达(n个= 3,C类和D类),sXBP1(n个= 4,E类和G公司),或ATF6(n个= 4,F类和G公司)在小鼠胰岛细胞中,只有ATF6增加了β细胞的增殖。(H(H)–P(P))shRNA敲除小鼠原代胰岛细胞中的ATF6或IRE1表明,葡萄糖诱导的β细胞增殖需要ATF6和IRE1的最佳水平(n个= 3–6,我和J型)尽管只有ATF6敲除降低了PCNA丰度(n个= 3–5,K(K)–P(P)).H(H)显示击倒我;K(K)对于L(左)和M(M); 和N个对于J型,O(运行)、和P(P)所有实验的持续时间为72小时。数据表示为平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)<0.001,以及†P(P)通过方差分析,<0.0001(A类,B类,D类,G公司,我、和J型)或学生的t吨测试(L(左),M(M),O(运行)、和P(P)).
UPR调节人β细胞的增殖。鉴于小鼠和人类β细胞之间的重要差异(40,41),必须在人体样本中测试小鼠的发现,以确认潜在的医学相关性。我们测试了12名人类捐赠者的胰岛细胞(补充表2和3)观察UPR是否调节β细胞增殖。将分散的胰岛细胞培养在玻璃盖玻片上,加入7.5或15 mM葡萄糖以及UPR活化剂或抑制剂(图9,A–G). 当暴露于15 mM葡萄糖时,所有供体的β细胞增殖增加,尽管供体的基础增殖和增加程度差异很大(补充图13). 为了确定UPR激活是否会增加这些样品中的增殖,应用了Tg和Tm。Tg和Tm增加人胰岛细胞中BiP的丰度(补充图14). 当用低剂量UPR诱导剂处理时,大多数供体的β细胞增殖增加(图9、C和D). 由于人类胰岛制剂的显著可变性,结果被表示为在7.5 mM葡萄糖中的增殖率标准化(原始数据补充图13). 包括来自单个T2D供体的胰岛;这些β细胞对UPR激活无增殖反应。在人类胰岛培养物中很少检测到γ-H2AX,并且在低剂量Tg和Tm处理的培养物中没有与BrdU免疫荧光共存,这表明观察到的BrdU掺入不是由于DNA损伤(补充图15). 在接受TUDCA或PBA治疗的6名供体中,有5名受试者的β细胞显示出葡萄糖诱导的增殖减少(图9E和补充图13和14)提示UPR可能是葡萄糖诱导人β细胞增殖所必需的。为了确定ATF6是否介导对葡萄糖的增殖反应,用ATF6抑制剂或过表达人胰岛细胞进行培养ATF6型腺病毒感染。抑制ATF6降低15 mM葡萄糖中的增殖(图9F)和过度表达ATF6型在15 mM葡萄糖中增殖增加(图9G)表明ATF6促进人β细胞增殖。总之,这些结果表明,人类β细胞增殖可能通过调节UPR(一般)和ATF6活性来调节。图10阐述了β细胞应激治疗窗口的概念,该窗口可用于扩大β细胞质量以预防或治疗糖尿病。
UPR对于通过ATF6增加人类β细胞增殖是必要且充分的。(A类)将人胰岛分散在玻璃盖玻片上培养96小时,并在整个培养过程中向培养基中添加BrdU。箭头表示BrdU-阳性β细胞。比内分泌细胞核大的成纤维细胞核标记为F(B类)高糖状态下人β细胞增殖增加(n个= 12). 由于捐赠者之间的基线增殖差异很大,随后的小组显示数据标准化为7.5 mM的增殖率。每个准备的原始非标准化数据补充图13. (C类和D类)低剂量Tg(20 mM,C类)或Tm(10–100 ng/ml,D类)人β细胞增殖增强(n个= 6–12). (E类)TUDCA和PBA降低15 mM葡萄糖中的人β细胞增殖(n个= 6). (F类和G公司)在15 mM葡萄糖中,ATF6抑制剂的存在降低了人β细胞的增殖(n个= 7;F类)并且随着ATF6的过度表达而增加(n个= 4;G公司). (A类)放大倍数为200倍的图像。数据表示为平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)<0.001,以及†P(P)通过方差分析,<0.0001(C类–E类)或学生的t吨测试(B类,F类、和G公司).
模型:一种分泌细胞类型β细胞如何通过增殖将蛋白质合成需求与细胞数量增加联系起来。(A类)β细胞应力连续体。先前已知过多内质网负荷会导致β细胞功能障碍和死亡。目前的研究增加了一个新概念,即适度内质网负荷(已知可促进内质网容量的功能适应)也会通过增殖导致β细胞数量的组织适应。这一连续体说明了一个潜在的应激治疗窗口,可能以促进β细胞质量膨胀为目标。(B类)UPR如何激活β细胞增殖的示意图。
我们的观察结果将β细胞中的UPR激活与有充分记录的需求驱动的β细胞团增殖膨胀联系在一起。这里介绍的工作有几个优点。该假设来源于一个无偏见的基于蛋白质的筛查。使用多种工具通过不同机制影响内质网生物学,在体外和体内测试UPR和需求导向β细胞增殖之间的关系。利用小分子和体外基因实验,增殖信号追踪到UPR的ATF6分支。研究结果扩展到了人类胰岛。
综上所述,这些研究具有重要意义。首先,我们确定了经典UPR机制的一个新作用:促进分泌细胞类型组织内稳态的增殖。尽管癌症生物学家已将UPR通路与肿瘤细胞适应和扩散联系起来(42)据我们所知,这是第一份显示UPR在正常生理学中决定组织细胞数量的作用的报告。细胞生物学家已将UPR确定为一种策略,通过该策略,细胞可以调整资源以满足肽合成需求,同时将不必要的内质网体积降至最低(三,7). 为了实现这一功能,UPR检测分泌肽合成过载,并触发新的脂质和肽生成,以每细胞为基础扩大内质网容量。我们的数据表明,UPR负荷传感器可能通过增殖增加细胞数量,不仅在单个细胞水平上,而且在全组织水平上直接适应肽合成。因此,从生理学角度来看,UPR可能有助于确定器官大小。
事后看来,将UPR传感器与β细胞质量膨胀联系起来以响应胰岛素需求是解决β细胞质量调节难题的一个明显方法。通过精确的葡萄糖传感,最适合胰岛素需求的细胞类型是β细胞。未满足的胰岛素需求在RNA和蛋白质水平上增加胰岛素原的产生,胰岛素原的合成激活UPR通路(三,7,43). 由于β细胞的大规模扩张是由成熟β细胞的增殖引起的,解释β细胞增殖如何响应胰岛素需求的最简单模型将激活β细胞-胰岛素需求的内在传感器,如UPR。将UPR与增殖联系起来可以解释为什么干细胞不参与β细胞的稳态,因为未分化的细胞不会感知胰岛素需求。事实上,这一概念提出了一种新的需求驱动的组织内环境平衡模型,在该模型中,分化细胞感知到对其功能的未满足需求,并产生新的细胞来满足该需求。
医学观察表明,需求驱动的器官大小测定也可能适用于其他组织,并可能有助于某些疾病过程。当激素合成增加时,几种内分泌细胞类型增殖,包括胰岛α细胞以及甲状腺、甲状旁腺和垂体细胞(44–47). 在某些临床情况下,如甲状腺肿、纳尔逊综合征和甲状旁腺增生,增殖可能需要手术或其他干预,对患者有一定风险(45,48). 其他产生分泌途径肽的非内分泌细胞也可能采用这种机制。了解这些增殖性疾病的根本原因是找到治疗方法的第一步。
先前的观察表明,体内UPR激活可能促进β细胞增殖,尽管到目前为止还没有直接针对这一假设的研究。突变型胰岛素原或胰岛淀粉样多肽转基因过表达诱导UPR(49,50)或通过删除ER应激细胞死亡介质CHOP或DP5(30,51)增加胰岛大小或β细胞增殖。在成年小鼠中,减少PERK表达可增加β细胞增殖(52,53). 这与我们的观察一致,即PERK通路不负责促增殖UPR信号,并支持ATF6对PERK丢失作出反应,可能会驱动增殖。删除Xbp1型在β细胞中,导致胰岛素缺乏型糖尿病、胰岛素加工受损和ER扩张,表明ER应激失代偿;β细胞增殖减少(54). 发现IRE1通过XBP1促进前列腺癌细胞系增殖(55). 在我们的实验中,尽管IRE1抑制降低了β细胞的增殖,但IRE1和XBP1的过度表达也降低了增殖,这一难题与已知的IRE1与XBP作用的谨慎平衡一致(54)这需要进一步研究。整体式车身附件6-null小鼠在胰岛素抵抗状态下降低了胰腺胰岛素含量并加速了失代偿,这可能与β细胞质量损失一致(56); 然而,老鼠缺乏附件6β细胞发育正常(57).
迄今为止,对β细胞的体外研究尚未报道UPR激活的促增殖作用。这可能是因为许多研究人员在体外研究中使用转化细胞系,而转化超越了通常的稳态增殖机制。培养中常用的Tg和Tm剂量会导致失代偿和细胞死亡,而增殖效果取决于常规培养中不常用的葡萄糖浓度。原代胰岛组织的培养虽然更加繁琐和昂贵,但与体内环境更相关,至少在增殖研究方面如此。
这一作用机制的重要线索是,体外低剂量内质网应激源诱导的增殖严格依赖于培养基中的葡萄糖浓度,在高糖中可以观察到增殖,但在低糖中可以发现失代偿标记物和细胞死亡。对这一观察结果的可能解释包括应激反应参数的葡萄糖依赖性和细胞分裂的能量需求。所示的葡萄糖浓度是指实验开始时的条件;实验结束时的葡萄糖丰度没有测量出来,可能是由于利用率降低了。在低血糖状态下,诱导了综合应激反应(ISR)的一些特征,包括CHOP和细胞死亡,而ATF6没有增加(图4,A、B、L、和补充图4C). 我们的发现与先前的观察一致,即在2 mM和5 mM葡萄糖下,ISR在大鼠胰岛或小鼠min6胰岛β细胞系中激活,而UPR在高糖下激活(58,59). 葡萄糖浓度可能影响β细胞中ISR介导的翻译阻滞影响的转录物的程度、持续时间或身份(60). 有趣的是,在HEK293T细胞中,ISR优先减少MTOR调节基因的翻译(61); β细胞增殖严格依赖于MTOR的激活(62). β细胞之间的葡萄糖摄取可能是不均匀的,葡萄糖摄取的程度可能与UPR激活和增殖有关。
本文提出的工作建议了一种治疗性扩大β细胞团的可能方法。然而,β细胞对内质网应激很敏感,如果不能解决内质网的应激,则是自身免疫性糖尿病和肥胖相关糖尿病中β细胞丢失的主要原因(三,4,6,63–65). 将UPR作为决定β细胞数量的胰岛素需求传感器,可以解释这种敏感性升高的原因。利用UPR促进β细胞增殖的潜在疗法必须考虑到当前β细胞应激水平,并在狭窄的安全窗口内操作,以避免过载和细胞死亡。体外观察到的UPR诱导增殖的葡萄糖依赖性如何转化为体内条件尚待确定。这项工作还提高了以下可能性:将β细胞应力从失代偿范围降低到适应范围的药物可能会重置应力变阻器,以使轻度应力扩大β细胞质量。需要工具来测量和调节体内β细胞的应力水平。
将小鼠β细胞的发现转化为人体组织一直是一项挑战(40,41). 人类β细胞的基础增殖比小鼠低,对刺激的反应也不太好(40,41). 此外,糖尿病患者的胰岛显示有失代偿内质网应激的证据(31,64). 我们的发现是,大多数(但不是全部)供体的人β细胞在UPR反应中增殖,这为确定影响人β细胞质量增加的基因、表观遗传和后天因素提供了一个潜在的方法,以响应胰岛素需求。小鼠UPR通路激活受遗传影响(29). 结合测量和调节体内β细胞应激的方法,这一知识可能使患者特异性治疗能够增强β细胞质量。
剩余的不确定性领域包括激活UPR的精确信号的性质,适应性增殖反应是否能在慢性内质网应激条件下持续,以及这是否是由于胰岛素原合成的内质网肽负荷、内质网氧化还原状态、钙处理或其他损伤。ATF6在体内需求驱动的β细胞团中的作用尚未得到证实。推动扩散的ATF6靶点仍有待发现。然而,目前的工作代表着在理解β细胞数量如何适应胰岛素需求方面向前迈出了重要一步,它可能说明了一种将器官大小与生理需求联系起来的新范式。
老鼠。按照说明进行葡萄糖输注(15); 10至12周龄C57BL/6J雄性小鼠连续静脉输注生理盐水(匹兹堡大学医学院的患者在股静脉输注,麻省大学医学院患者在颈静脉输注)或50%葡萄糖,持续4天。然后他们被安乐死,进行胰岛分离或胰腺组织学检查。按照说明进行高脂肪喂食(28); 10至12周龄C57BL/6J雄性小鼠喂食对照周粮或60%猪油饮食(目录TD.06414,Harlan)7天。INS2(C96YAkita)小鼠或分贝/分贝-对C57BLKS小鼠(均来自杰克逊实验室)和同窝对照进行研究。雄性和雌性表现出相似的结果,并被合并。在TUDCA实验中,小鼠腹腔注射500μg/kg TUDCA或生理盐水(HFD喂养的小鼠)或PBS(秋田和分贝/分贝小鼠)每天两次,连续两天。为了测量增殖,对于HFD,小鼠每天两次(上午和下午)接受40 mg/kg BrdU静脉注射,连续2天注射TUDCA。秋田和分贝/分贝在安乐死前4小时和2小时,小鼠接受2次40 mg/kg BrdU的注射。最后一次注射两小时后,对小鼠实施安乐死,并对胰腺进行组织学检查。血糖测量由AlphaTRAK血糖仪(雅培)完成。
小鼠胰岛的分离、分散和培养。岛屿如前所述被隔离(24)通过胶原酶消化和ficoll-hypaque密度梯度分离。在所有原代胰岛细胞实验中,胰岛在胰岛完整培养基(ICM、含有10%FBS的RPMI、青霉素/链霉素和5 mM葡萄糖)中培养过夜。第二天,对胰岛进行手工挑选和胰酶消化(0.05%胰蛋白酶),并将单个细胞涂布在无涂层的盖玻片上进行免疫荧光,或涂布在未涂层的塑料上进行Western blots和RNA。为了将变异性降至最低,使用分散的胰岛增殖试验、单一供应商的FBS(大西洋生物制品公司)和批次;胰岛培养基散装混合,小量贮存;胰岛分散用胰蛋白酶在一次性试管中冷冻。对每个生物复制品进行控制,以尽量减少变异性对实验结果的影响。当一项实验需要的胰岛数量超过一只小鼠所能获得的数量时,将多只小鼠的胰岛汇集在一起以实现一次生物复制。治疗72小时用于免疫印迹和免疫染色(最后24小时用于BrdU),或6、24或48小时用于定量PCR(qPCR)。
蛋白质组学筛选。如上所述,将C57BL/6J 10至12周龄雄性小鼠注射生理盐水或葡萄糖4天。分离胰岛并在含有1%FBS的ICM中的冰上用手抓取。收集每种情况下4只小鼠的胰岛裂解液,用Cy3或Cy5(匹兹堡大学蛋白质组学核心)标记,结合,在固定pH 4-10等电聚焦条上聚焦至70000伏特小时(IPGphor电源,Bio-Rad),并用SDS-PAGE分离(66). 对凝胶图像(台风扫描仪、GE Healthcare)的光斑强度变化进行目视评估。凝胶用考马斯(Bio-Rad)进行后染色,并手动切除24种感兴趣的蛋白质(OneTouch,The Gel Co.)。在胰蛋白酶消化(trypsin Gold,Promega)后,将肽洗脱、脱水、溶于50%乙腈/0.3%三氟乙酸/1mM柠檬酸和等体积的饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸中,并在MALDI板上斑点(Applied Biosystems)。匹兹堡大学综合核心设施的ABI 4700质谱仪上进行的MALDI-TOF分析确定了18种独特的蛋白质(补充表1).
免疫印迹。用PBS洗涤胰岛细胞,并在直接添加到培养基中的125 mmol/l tris、2%SDS、1 mmol/l二硫苏糖醇、20μg/ml 4-氨基苯甲烷磺酰氟盐酸盐(APMSF)和蛋白酶抑制剂中溶解胰岛细胞。用切好的移液管尖端将细胞从塑料中分离出来,用30秒的脉冲对样品进行10分钟的声波处理,并在4度下进行30秒的休息。样品在SDS-PAGE加载缓冲液中煮沸5-10分钟。在SDS-PAGE上分离后,将蛋白质转移到PVDF膜上,然后用含有PBS和0.1%吐温-20的5%脱脂奶粉封闭膜1-2小时。用来自Abcam(p-IRE1,目录ab124945)、BD Biosciences(BiP,目录610978)、Cell Signaling Technology(sXBP,目录12782;CHOP,目录2895;活化caspase 3,目录9661;GRP94,目录2104;p-eIF2α,目录9721;PDI,目录2446;和IRE1(目录3294)、EMD Millipore(肌动蛋白,目录MAB1501;Cre,目录69050)、Imagenex(ATF6,目录IMG-273)、Novus Biologicals(ATF5,目录NBP1-40256)、Santa Cruz Biotechnology Inc.(PCNA,目录sc-56)和Sigma-Aldrich(Flag,目录F1804)。使用ECL、ECL prime(GE Healthcare)或SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Scientific)开发印迹。使用ImageJ(NIH)量化带强度。
RNA分离和qPCR。使用一体式RNA纯化试剂盒(诺根生物技术公司)从完整胰岛(体内葡萄糖输注)或分散胰岛(细胞培养实验)中分离出RNA。RNA质量和数量通过RNA完整性数和Nanodrop进行验证。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)从100–500 ng总RNA合成cDNA。在RealPlex 2和4循环(Eppendorf)上使用SYBR绿色检测进行qPCR。对于基于凝胶的Xbp剪接半定量分析,cDNA在98℃下扩增2分钟,在98℃29个循环中扩增30秒,在60℃下扩增30秒、在72℃下扩增50秒,最后在2%琼脂糖凝胶上延伸5分钟,并使用GelDoc(UVP LLC.)成像。引物来自文献(补充表4). 数据表示为ddCt(折叠变化)。对于XBP1型剪接,半定量PCR,琼脂糖电泳;使用ImageJ(NIH)对条带进行量化。
流式细胞术。培养处理后,用胰蛋白酶将分散的胰岛细胞从培养板上分离出来。悬浮液中的细胞要么没有固定(用于Annexin V/PI染色),要么用4%PFA在冰上固定20分钟。然后用冰镇PBS清洗细胞两次,并保持4度直到染色。染色当天,离心PBS中的细胞,并用BD细胞修复液/细胞壁缓冲液(BD Biosciences)在冰上再次固定5分钟。清洗后,将细胞重新悬浮在含有300μg/ml DNase的DPBS中,用于DNA消化以进行BrdU染色。细胞在37°C下培养1小时,然后用BD perm/wash缓冲液(BD Biosciences)清洗。使用抗胰岛素-488抗体(细胞信号技术)、BrdU-PE(BioLegend)和未结合的小鼠BiP抗体在冰上进行20-30分钟的染色。清洗后,添加抗鼠APC标记抗体20–30分钟。对于培养细胞计数,按照上述方法制备样品,不含DNAse,并使用与Zenon Pacific Blue(Invitrogen)偶联的小鼠抗胰高血糖素附加标签。在固定的时间内以相同的速度对每个样本的细胞进行计数,以评估相对细胞数。使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)和FlowJo软件对实验进行分析。根据制造商的方案(Millipore)进行Annexin V/PI染色,并使用BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)和Flowjo软件进行分析。
IHC和免疫细胞化学。胰腺和肠道在室温下用4%福尔马林(v/v)固定5小时,并包埋在石蜡中。使用下面列出的一级抗体和DyLight二级抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)封闭并标记5至7微米的切片。对于免疫细胞化学,将分散的胰岛细胞在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟。对于BrdU染色,在阻断步骤之前,将载玻片或盖玻片在37°C的1N HCl中预培养30分钟。用于免疫染色的抗体来自Abcam(BrdU,目录ab6326;胰岛素,目录ab7842)、BD Biosciences(BiP,目录610978)、Cell Signaling Technology(γ-H2AX,目录9718;pHH3,目录3377)和Santa Cruz Biotechnology Inc.(PCNA,目录sc-56)。使用尼康荧光显微镜采集图像,进行盲检和手动计数。在透射电子显微镜下,胰腺固定在2.5%戊二醛/2%多聚甲醛中,后固定在1%OsO水溶液中4,1%K三铁(CN)6。通过分级乙醇系列脱水后,将样品渗透到环氧丙烷/Polybed 812环氧树脂(Polysciences Inc.)的1:1混合物中,嵌入,在37°C下固化过夜,并在65°C下硬化2天以上。在200目铜网格上收集超薄(70 nm)切片,用2%醋酸铀酰在50%甲醇中染色10分钟,然后用1%柠檬酸铅染色7分钟。使用JEOL JEM 1011透射电子显微镜在80 kV电压下对切片进行成像,该显微镜配有侧装AMT数码相机(高级显微镜技术)。
转染和腺病毒感染。质粒取自Addgene(ATF6α、IRE1α和sXbp)或OriGene(sh-ATF6和sh-IRE1)。将胰岛分散到单个细胞中,并用PBS洗涤。加入质粒,并使用Neon转染系统(Invitrogen)在950mV下用20ms的2次电击对细胞进行电穿孔。电穿孔前后的存活率(补充图12)通过向悬浮在100μl PBS中的细胞添加1μl TO-PRO-3(Invitrogen)进行测量,然后在BD-LSRII上进行流式细胞术,并使用FlowJo软件进行分析。将分散的转染细胞涂布在塑料上进行Western blot,或涂布在盖玻片上进行免疫细胞化学,在治疗前24小时恢复。在接种后第二天,用表达小鼠细胞周期蛋白D2或对照(Vector BioLabs)的腺病毒在10 MOI下转染分散的胰岛细胞。
人类胰岛培养。从综合胰岛分配计划(IIDP)获得的人类胰岛可以在ICM中恢复24-48小时。除葡萄糖和药物治疗96小时外,胰岛被采摘、分散并盖在盖玻片上,治疗开始时加入BrdU。在对照组7.5 mM葡萄糖条件下,用DAPI染色法测定的细胞核总数除以胰岛素染色的细胞数,从而确定人类胰岛制剂中β细胞的百分比,实验图像如图9A将表达人ATF6或对照的腺病毒(Vector BioLabs)在10 MOI下用于转染接种后第二天分散的人胰岛细胞。96小时后,细胞固定并按上述方法染色。
化学制品。使用的化学品包括Tg(每文本剂量)、TUDCA(100 ng/ml)、PBA(250 nM)和Brdu(40 mg/kg)(均来自Sigma-Aldrich),以及Tm(每文本用量)、ATF6抑制剂AEBSF(100 nM)、PERK抑制剂GSK2606414(5 nM)以及IRE1抑制剂4μ8c(7μM)(均来源于EMD)。
统计。数据表示为平均值±SEMn个独立小鼠或独立胰岛制剂。使用Prism(GraphPad)进行统计分析。P(P)值由双尾学生的t吨用Sidak后验进行多重比较的检验或单因素方差分析;P(P)<0.05被认为是显著的。
研究批准。小鼠在麻省大学医学院或匹兹堡大学饲养。所有程序均由各自的机构护理和使用委员会批准。
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人类胰岛由NIDDK资助的IIDP在希望之城提供。我们感谢匹兹堡大学蛋白质组学核心、集成核心设施和生物成像中心的唐娜·斯托尔茨分别在蛋白质组学筛查和电子显微镜方面提供的帮助,并感谢麻省大学医学院国家小鼠代谢表型中心(由U24-DK093000支持)对杰森·金的支持。这项研究由美国国立卫生研究院资助:DK076562(给L.C.Alonso)、DK095140(给L.C.Alonso)和DK48280(给P.Arvan)。我们也非常感谢与我们的朋友和同事以及麻省大学贝塔细胞小组进行的许多重要讨论。
利益冲突:提交人声明,不存在利益冲突。
参考信息:临床投资杂志。2015;125(10):3831–3846. doi:10.1172/JCI79264。