谷氨酰胺酶抑制剂CB-839对三阴性乳腺癌的抗肿瘤活性

肿瘤细胞使用多种致癌和环境驱动的代谢途径来满足快速持续生长的生物能量和生物合成需求(1, 2). 氨基酸谷氨酰胺是许多癌症生长的关键营养素之一，是血浆中最丰富的氨基酸(3, 4). 谷氨酰胺利用的一个关键步骤是线粒体谷氨酰胺酶将其转化为谷氨酸(5, 6). 谷氨酸和谷氨酸衍生代谢物反过来支持许多关键的细胞途径，包括三羧酸（TCA）循环、氧化还原平衡和氨基酸合成。

抑制广泛表达形式的谷氨酰胺酶（由基因编码GLS公司)与小分子抑制剂或通过基因敲除对多种肿瘤类型具有抗肿瘤活性，包括淋巴瘤、胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和肾癌(6–14). 此外GLS公司表达与高级别和转移性乳腺癌相关(15). 尤其是三阴性乳腺癌（TNBC）原发肿瘤和细胞株GLS公司mRNA；这与谷氨酰胺消耗量高和/或生存对外源性谷氨酰胺的依赖性增强有关在体外(14, 16). 总之，这些观察结果强调了肿瘤生长和谷氨酰胺利用之间的关键联系，并表明谷氨酰胺酶抑制剂可能在治疗多种癌症（包括TNBC）方面提供治疗益处。

已经报道了几种小分子谷氨酰胺酶抑制剂(6, 17–19). 谷氨酰胺类似物，6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸、氮杂丝氨酸和阿维辛，与许多谷氨酰胺利用酶（包括谷氨酰胺酶）的活性位点不可逆地结合(20). 这些化合物的临床研究表明其抗肿瘤活性有限，但其发展受到严重毒性的限制，这可能是由于多种谷氨酰胺利用酶和转运蛋白的广泛拮抗作用所致(17). 最近，报道了两种谷氨酰胺酶的变构抑制剂，化合物968和BPTES（双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚），其作用机制不同(6, 18, 21). BPTES（和BPTES类似物）的变构机制需要通过一对同型二聚体之间的界面上两个抑制剂分子的结合形成一个无活性的谷氨酰胺酶同型四聚体(18, 22, 23). 一些研究小组报告了BPTES在淋巴瘤、乳腺、胶质瘤、胰腺、肺和肾肿瘤类型中的抗肿瘤活性(7, 9, 11–13, 24). 然而，BPTES的中等效力、较差的代谢稳定性和低溶解度限制了其临床开发潜力。

我们在这里报道了CB-839的发现和特性，它是一种有效和选择性的谷氨酰胺酶抑制剂。展出CB-839在体外对一组TNBC细胞系的抗增殖活性，但对雌激素受体（ER）或HER2无活性⁺细胞株，这种抗肿瘤活性与许多细胞参数相关，这些细胞参数可以为鉴定敏感肿瘤提供临床有用的工具。此外，CB-839促进了肿瘤特异性药效反应体内在乳腺癌异种移植模型中的疗效，无论是作为单一药物还是与标准药物紫杉醇联合使用。总之，这些结果支持这样的观点，即谷氨酰胺利用是TNBC的关键生长和生存途径，使用CB-839抑制谷氨酰胺酶可能对TNBC和其他谷氨酰胺依赖性肿瘤患者提供治疗益处。

BPTES的编制如前所述(25). CB-839的合成与化学表征(图1A)参考文献中进行了描述(26)，其中称为#670。

在用NADPH依赖性酶谷氨酸脱氢酶监测谷氨酸生成的耦合生化分析中，通过改进先前描述的方法，测定了BPTES和CB-839对重组人GAC（rHu-GAC）的抑制活性(15)，详见补充方法。为了测量抑制的时间依赖性，在用耦合分析法测量谷氨酰胺酶活性之前，将rHu-GAC与抑制剂预先孵育。rHu GAC和抑制剂预孵育90分钟后，通过在Zeba Spin脱盐柱（Thermo Scientific）上通过凝胶过滤分离游离抑制剂后的不同时间点测量谷氨酰胺酶活性来确定从抑制中恢复。按照补充方法中的描述，使用耦合分析法测量从肿瘤细胞系和小鼠组织制备的匀浆中的谷氨酰胺酶活性。

乳腺细胞系BT-20、BT-549、Hs578T、HCC38、HCC1806、MCF-10A、HCC70、MDA-MB-231、MDA-MB-436、HMC-1–8、HCB1395、HCC1187、Hs739.T、MDA-MB-468、HCC1954、MCF-7、Hs343.T、HCC1428、DU4475、AU-565、T47D、Sk-Br-3和MDA-MB-175-VI均来自美国型培养物收集中心（ATCC）。JIMT-1和MX-1细胞系分别来自德国微生物和细胞培养物收集中心（DSMZ）和德国细胞系服务中心（CLS）。复苏后，所有细胞株传代不到6个月。通过短串联重复序列（STR）分析验证ATCC、CLS和DSMZ细胞系。在添加2 mmol/L谷氨酰胺和10%FBS的RPMI-1640中，在37°C和5%CO的条件下，维持并分析活性、代谢物、谷氨酰胺酶活性和Western blot分析的细胞系₂除MCF10A外，其按照上述要求进行维护(27). 对于培养基消耗和Seahorse分析，HCC1806和T47D是从MD Anderson Characterized Cell Line Core中获得的[使用AmpF/STR Identifier kit（Applied Biosystems）进行验证]，并在Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）中培养，37°C，5%FBS，5%CO₂大气。

对于生存能力分析，所有细胞系在双孔中以指示浓度用CB-839处理72小时，并使用cell Titer Glo（CTG；Promega）分析抗增殖作用。对于除MDA-MB-175、SUM149PT、Hs343.T、HCC38和BT20外的所有细胞系，所呈现的结果代表了至少两个独立实验的平均值。集成电路₅₀使用四参数曲线拟合（Graphpad Prism）计算值。在1μmol/L CB-839存在或在无谷氨酰胺介质中，通过比较在时间点测得的CTG信号来确定相对细胞丢失或增殖(t吨)=在实验条件下72小时（CTG_{实验_72})CTG信号均为t吨=72小时（对于载体（0.5%二甲基亚砜）处理的细胞（CTG）_{二甲基亚砜-72})和CTG信号在t吨=0，添加CB-839或退出谷氨酰胺（CTG）的时间₀)，使用以下公式：%电池损耗（当CTG_{实验_72}<CTG₀)=100×（CTG_{实验_72}−CTG₀)/CTG公司₀;% 细胞增殖（CTG时_{实验_72}>CTG公司₀)=100×（CTG_经验72−CTG₀)/（CTG公司_{二甲基亚砜-72}−CTG₀).

从细胞颗粒制备裂解物，并如补充方法中所述对蛋白质量进行定量。通过在SDS样品缓冲液中煮沸使裂解蛋白（20μg/lane）变性，在7%的Tris-醋酸盐凝胶上溶解（连同Novex sharp预处理分子量标准；Life Technologies），并转移到硝化纤维素膜上。用识别GAC和KGA形式的谷氨酰胺酶（1:5000；AB156876，Abcam）、谷氨酰胺合成酶（1:1000；HOOOO2752-M02，Abnova）、谷氨酸酶-2（1:1000，NBPI-76544，Novus Biologicals）和β-肌动蛋白（1:10000；A5441，Sigma-Aldrich）的抗体来检测固定化的硝基纤维素蛋白质其次是辣根过氧化物偶联抗兔或抗鼠抗体（1:5000；NA934V和NA931V，GE Healthcare）。通过化学发光（Thermo Scientific）显示条带，并使用FluorChem HD2系统（Protein Simple）捕获图像。补充方法中提供了用于蛋白质印迹的谷氨酰胺酶抗体和检测到的条带的流动性的进一步验证。

细胞系或小鼠组织在含有10μmol/L的甲醇：水（80:20）中均质¹³C类₅,¹⁵N-谷氨酸作为内标物，并使用SCIEX API4000（应用生物系统）通过液相色谱-串联质谱（LC/MS-MS）分析代谢物水平。除了使用50 nmol/L卡马西平作为内标外，还使用类似的方法分析了小鼠组织匀浆中的CB-839水平。

对于量化组织培养基中代谢物消耗或产生的实验，将细胞在含有5mmol/L葡萄糖和0.5mmol/L谷氨酰胺（无血清）的DMEM中孵育6小时。使用YSI 2900生化分析仪（YSI Life Sciences）定量葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸的培养基浓度。

为了量化耗氧率，将细胞接种在XF96 V3 PET板（Seahorse Biosciences）上的DMEM（5%FBS）中（8000到10000个细胞/孔）。在贴附细胞过夜后，用DMEM（5 mmol/L葡萄糖，含或不含0.5 mmol/L-谷氨酰胺，无FBS，无碳酸氢盐）交换培养基。立即将平板加载到Seahorse XF96生物分析仪（SeahorseBiosciences）上，以量化耗氧率（OCR）。为了确定它们对OCR的影响，依次添加化合物（CB-839或DMSO、1μg/mL寡霉素和1μmol/L抗霉素）。

在乳腺脂肪垫中植入HCC1806细胞（2.5×10）的雌性Scid/Bg小鼠（Charles River Laboratories；年龄6-9周，17-23 g）切除的肿瘤和组织中测量CB-839和代谢物水平⁶细胞/小鼠；肿瘤体积～500 mm^三（给药时）口服200 mg/kg CB-839或溶媒4小时后。该载体由25%（w/v）羟丙基-β-环糊精（HPBCD；Roquette）在10 mmol/L柠檬酸盐中组成，pH值为2。将CB-839配制成20 mg/mL（w/v）的溶液；各组剂量均为10mL/kg。

在两种异种移植模型中进行肿瘤生长研究：（i）患者衍生的TNBC模型，将一名53岁高加索女性乳腺组织中分离出的肿瘤碎片（Champions肿瘤学模型CTG-0052）植入雌性nu/nu小鼠皮下（4-6周龄，19-26 g）；Harlan Laboratories）和（ii）细胞系模型，其中JIMT-1细胞以1×10的剂量植入皮下⁷雌性CB.17 SCID小鼠（年龄8-12周，17-23克；Charles River Laboratories）侧面的每只小鼠的细胞数。在两种模型中，当肿瘤达到约100–150 mm时^三，小鼠服用载体（如上所述）或200 mg/kg CB-839(n个=10/组），每天两次口服，每12小时一次，持续28至35天。对于JIMT-1模型，另外两组患者分别服用5%乙醇/5%克雷莫波尔EL中制备的紫杉醇，每隔一天静脉推注10 mg/kg，单独服用5次，或与口服两次的200 mg/kg CB-839联合服用。每周测量两次肿瘤体积和体重。

小分子BPTES先前被描述为一种变构谷氨酰胺酶抑制剂，对两种剪接变异体GLS公司基因，GAC公司和KGA公司（据报道Ki在0.2至3μmol/L之间），但不是肝脏形式的谷氨酰胺酶，由GLS2级基因(18, 19, 21, 22). CB-839型(图1A)是一种新型谷氨酰胺酶抑制剂，在生物化学和细胞分析中表现出低纳米效力，并且具有良好的口服生物利用度。在重组人GAC（rHu-GAC）生化检测中，CB-839的效价和动力学行为与BPTES不同。与BPTES不同，CB-839表现出时间依赖性(图1B和C)和缓慢可逆动力学(图1D). 集成电路₅₀与rHu-GAC预孵育≥1小时后，CB-839对谷氨酰胺酶的抑制值小于50 nmol/L，至少比BPTES低13倍。此外，去除游离抑制剂后，BPTES的rHu-GAC活性恢复较快（<3分钟），而CB-839的恢复较慢(t吨_1/2=25°C下45分钟）。这种改变的动力学行为也与抑制模式的变化有关。BPTES显示出一种主要的无竞争机制，其特征是两种药物的剂量依赖性降低V（V）_最大值和K（K）_米谷氨酰胺（补充图S1A）和随着谷氨酰胺浓度的增加而向更大效力方向转变（补充图S-1C），与之前的报告一致(18, 21). 相比之下，CB-839主要作为非竞争性抑制剂发挥作用V（V）_最大值但对K（K）_米（补充图S1B），并显示与谷氨酰胺浓度无关的效力（补充图S1D）。CB-839抑制小鼠组织匀浆中天然谷氨酰胺酶的能力也使用耦合生化分析进行了测量（见材料和方法）。处理肾和脑组织制备的匀浆，这两种组织表达GLS公司基因产物(28, 29)CB-839作用1小时，导致谷氨酰胺酶抑制（IC₅₀=20–30 nmol/L），与rHu-GAC所得结果相当(图1E). 相反，对主要含有GLS2级基因产物(28, 29)与CB-839结合后，未检测到谷氨酰胺酶抑制。该结果与报告的BPTES对GLS公司结束GLS2级基因产物(18, 22). 综上所述，这些结果表明，尽管CB-839和BPTES具有相似的变构结合机制和选择性特征，但CB-839具有更强的效力和独特的动力学行为，表现出慢开/慢关机制。

据报道，TNBC原发性肿瘤和许多细胞系具有谷氨酰胺酶的高表达(GLS公司基因产物）和谷氨酰胺合成酶的低表达(GLUL公司基因产物），一种从谷氨酸中产生谷氨酰胺的酶(14, 16). 这种表达模式与高谷氨酰胺消耗和TNBC细胞系生长对外源谷氨酰胺的依赖性有关，表明TNBC对谷氨酰胺酶抑制敏感。为了验证这一假设，在两个TNBC细胞系HCC1806和MDA-MB-231以及一个ER中检测了CB-839抑制谷氨酰胺酶的代谢后果⁺/HER2型⁻线路，T47D。CB-839治疗对两种TNBC细胞系（IC₅₀与>100 nmol/L时的细胞丢失有关，但对T47D细胞的活力没有影响(图2A和补充图S2A和S2B）。BPTES在两个TNBC细胞系上也表现出选择性抗增殖活性（补充图S2B），但具有IC₅₀≥2μmol/L，与生化分析中的较弱效力一致。为了证实1μmol/L CB-839治疗抑制了谷氨酰胺的代谢，对HCC1806和T47D细胞株的谷氨酰胺消耗率和谷氨酸生成率进行了量化(图2B). 正如对谷氨酰胺酶抑制剂的预期，这两条生产线的谷氨酰胺消耗率都降低了。重要的是，CB-839完全抑制了HCC1806细胞相对较高的基线谷氨酰胺消耗率，表明谷氨酰胺酶活性在该细胞系中代谢谷氨酰胺的绝对需求。相反，T47D细胞中谷氨酰胺的消耗仅被部分抑制，这表明这些细胞能够通过谷氨酰胺酶非依赖性途径代谢谷氨酰胺。

与谷氨酰胺消耗率一样，CB-839处理后HCC1806细胞的谷氨酸生成率也显著降低。几乎相同的CB-839 IC进一步强调了该细胞系中谷氨酰胺消耗和谷氨酸生成之间的谷氨酰胺酶依赖性联系₅₀值(图2C). T47D细胞没有观察到这种关联；未经处理的谷氨酸生成率低于HCC1806细胞，但CB-839没有显著改变（图2B）。这些结果表明，谷氨酰胺酶代谢的谷氨酰胺是HCC1806中谷氨酸生成的主要来源，但在T47D细胞中不是。两种细胞系的葡萄糖消耗量和乳酸生成率均未受到实质性影响，这支持了CB-839效应的谷氨酰胺特异性，以及谷氨酰胺酶被抑制时糖酵解缺乏潜在的代偿性变化（补充图S2C）。

在这些细胞系中还检测了谷氨酰胺酶抑制对细胞内代谢物水平的影响。除了对谷氨酰胺（底物积累）和谷氨酸（产品消耗）的预期影响外，CB-839还在4小时内降低了谷氨酸下游的一些关键代谢物的浓度(图2D)并将这些效果保持24小时（补充图2D). 相反，细胞葡萄糖水平没有变化。受CB-839影响的下游代谢物包括：（i）天冬氨酸（通过天冬氨酰转氨酶与谷氨酸相连）；（ii）谷胱甘肽（谷氨酸是其关键前体）；和（iii）TCA循环中间产物富马酸、苹果酸和柠檬酸（通过谷氨酸在生成TCA循环中间体α-酮戊二酸中的镇痛作用）。重要的是，在所有情况下，CB-839对下游代谢物的影响在TNBC细胞系（HCC1806）中比在ER中更大⁺细胞系（T47D），与TNBC中对谷氨酰胺酶的更大依赖性一致。其他TNBC细胞系MDA-MB-231也获得了类似的结果（补充图S2E和数据未显示），其中EC₅₀谷氨酰胺积累和IC₅₀谷氨酸消耗量与HCC1806中谷氨酰胺消耗量和谷氨酸生成量密切相关。在一组乳腺癌细胞系中，CB-839提高谷氨酰胺水平和降低谷氨酸水平的能力对于TNBC细胞通常大于受体阳性细胞（补充图S2F和S2G）。这些对细胞内代谢物池的影响与之前描述的谷氨酰胺酶siRNA敲除和BPTES的影响一致(7, 8, 11). 强调源自谷氨酸的代谢中间产物的功能重要性，TCA循环中间产物的细胞渗透形式（草酰乙酸和α-酮戊二酸）和谷胱甘肽部分或完全逆转了CB-839介导的TNBC细胞活力抑制（补充图S2H）。然而，由于这些试剂的潜在代谢相互转化，需要进行额外的研究来确定哪些途径对维持细胞活力最为关键。

TCA循环中间产物的细胞内浓度降低表明，线粒体功能可能因CB-839治疗而受损。为了验证这一假设，使用Seahorse生物分析仪对培养基中不同营养成分组合（葡萄糖和/或谷氨酰胺）的HCC1806和T47D细胞系的CB-839治疗的耗氧率进行量化。对于含有谷氨酰胺、ATP合成酶依赖性耗氧量（OCR）的培养基_OLG公司)用CB-839治疗80分钟后减少(图2E). 与生长抑制和其他代谢反应的测量一样，最显著的OCR_奥尔格对HCC1806细胞有反应。线粒体功能受损与谷氨酰胺消耗减少有关，如类似IC所示₅₀值(图2C和F). 重要的是，CB-839的作用与选择性谷氨酰胺酶抑制作用一致；OCR降低_OLG公司依赖于培养基中谷氨酰胺作为底物的存在(图2E和F).

总的来说，CB-839对细胞代谢的影响支持了靶向作用机制和高度TNBC选择性。CB-839对谷胱甘肽水平的差异影响尤其显著。这可能反映了这样一个事实，即谷氨酸通过系统x促进谷胱甘肽产生，既作为直接前体，又作为半胱氨酸（另一种谷胱甘酮前体）输入的辅因子_c（c）-谷氨酸/胱氨酸反转运蛋白(30). 重要的是，HCC1806中谷胱甘肽浓度降低，但T47D中没有降低，这表明来自谷氨酰胺的某些代谢物可能独立于内质网中谷氨酰胺酶的功能⁺癌症。有趣的是，在HCC1806细胞中，谷氨酰胺酶从谷氨酰胺中生成的大量谷氨酸在培养基中得到了回收，这可能是因为这些TNBC细胞对半胱氨酸的需求很高(14). 额外的代谢物流量研究将有助于更准确地阐明CB-839对谷氨酰胺下游代谢途径的影响。

扩大乳腺癌各亚型谷氨酰胺代谢基因的差异表达(14, 16)，我们研究了谷氨酰胺酶亚型的表达(GAC公司和KGA公司拼接形式GLS公司加GLS2级)和胶水来自癌症基因组图谱（TCGA）的乳腺浸润癌数据集和癌症细胞系百科全书（CCLE；参考文献。31, 32). 比较TNBC和受体阳性亚型（包括ER）的表达水平⁺/HER2型⁺，呃⁺/HER2型⁻和ER⁻/她⁺)对于TCGA数据集，还包括正常乳腺组织（补充图S3A和S3B）。这些大型数据集产生的表达模式与之前的报告一致(14, 16)，包括高架GLUL公司在主ER中⁺肿瘤。重要的是GLS公司Kung及其同事报道的TNBC中的表达(16)似乎主要是由于GAC公司拼接变体，与最近的报告一致(14). 平均GAC公司相对于正常乳腺组织和受体阳性肿瘤亚型，TNBC原发肿瘤的表达升高。相比之下，在千克TNBC与正常组织的表达。GAC公司和KGA公司与TNBC肿瘤或正常组织相比，受体阳性肿瘤的表达均较低。这些数据表明GAC公司在TNBC中协调下调GLS公司受体阳性肿瘤中的剪接变体。与原发肿瘤数据集一样，CCLE数据集中的TNBC细胞株GAC公司GLUL表达低于受体阳性细胞系。尽管GLS2级与正常乳腺组织和受体阳性肿瘤相比，原发性TNBC肿瘤的表达较低GLS2级在细胞系中含量较低，与受体状态无关。

为了确定这些基因表达模式是否反映在蛋白质水平上，通过Western blot分析一组乳腺细胞系的GAC、KGA、GLUL和GLS2的表达(图3A). 与mRNA表达一致，与受体阳性细胞系相比，大多数TNBC细胞系表达高水平的GAC和KGA。有趣的是，例外情况是JIMT-1和HCC1954，两者都是类似于基底的ER⁻/HER2型⁺细胞系(27, 33)与最近的观察结果一致，分子亚型也可以区分谷氨酰胺酶的表达模式(14). GLUL和GLS2的表达变化较大，在TNBC和受体阳性细胞系之间没有明显区别。与GAC和KGA mRNA和蛋白表达水平一致，与受体阳性细胞相比，TNBC细胞系中相同乳腺癌细胞株制备的裂解液中磷酸活化谷氨酰胺酶的特异性活性升高(图3B和补充图S4A）。

TNBC中检测到的谷氨酰胺酶水平升高表明，该乳腺肿瘤亚群可能对CB-839抑制谷氨酰胺酶的敏感性增强。为了验证这个假设，CB-839对28个乳腺癌细胞株（20个TNBC，4个ER）的抗增殖作用⁺/HER2型⁻和4 ER⁻/HER2型⁺)已评估。有效的抗增殖IC₅₀在大多数TNBC细胞系中观察到CB-839的值（2–300 nmol/L），而除两个受体阳性细胞系外，所有细胞系都有IC₅₀>1μmol/L(图4A). 同样，用1μmol/L CB-839处理72小时后，通过细胞生长或细胞丢失的程度（即细胞数量相对于化合物添加时间的减少）来衡量，TNBC细胞系表现出更高的敏感性(图4B和补充图S4B）。在大多数TNBC细胞系中观察到细胞损失；剩余的TNBC细胞系和碱性HER2⁺与二甲基亚砜对照组相比，细胞系的细胞增殖降低。在其他受体阳性细胞系中未观察到细胞丢失，尽管其中两个细胞的增殖减少了40%至55%。在TNBC细胞系中，细胞丢失与诱导凋亡有关，如caspase-3/7激活所证明的（补充图S5），这与在部分乳腺细胞系中谷氨酰胺停药后诱导凋亡一致(14).

为了确定乳腺癌细胞株对CB-839的敏感性是否与其对谷氨酰胺的依赖性相关，在乳腺癌细胞系小组中测试了谷氨酰胺停药的效果。TNBC细胞系对谷氨酰胺的总体依赖性更强(图4C和补充图S4C），如前所述(14, 16)大多数TNBC细胞系在缺乏谷氨酰胺时出现细胞丢失(图4C). 重要的是，在这个细胞系小组中，CB-839对谷氨酰胺酶抑制的敏感性与谷氨酰胺依赖性高度相关(图4D)，表明谷氨酰胺主要通过其谷氨酰胺酶介导的向谷氨酸的转化来支持TNBC细胞的活力。

我们假设，将TNBC与受体阳性肿瘤和正常组织区分开来的基因特征可用于识别对CB-839治疗敏感的肿瘤。事实上，在整个乳腺癌细胞系小组中，对CB-839增殖或生存能力的更高敏感性与更高的GAC公司表达式(图5A). 虽然CB-839抑制了GLS公司，CB-839敏感性与KGA公司观察到表达，支持了GAC公司TNBC细胞株谷氨酰胺利用和依赖性中的剪接变异体。尽管GLS公司剪接变异体尚待确定，活性、调节或定位的潜在差异可能使GAC更有效地支持转化表型(6, 15, 22, 23). 为了支持这种可能性，非小细胞肺癌中的siRNA敲除研究表明GAC公司拼接变体GLS公司，但不是KGA公司具有支持肿瘤细胞生长的重要作用(10).

为了扩大这种遗传相关性，在整个乳腺癌细胞系小组中评估了CB-839敏感性与谷氨酰胺酶功能测定之间的关系。评估的功能标记包括谷氨酰胺酶的特异性活性（参见图3B)细胞内谷氨酸与谷氨酰胺的基线比率（作为谷氨酰胺酶活性潜在替代物的产物与底物比率），以及1μmol/L CB-839促进细胞内谷氨酰胺积累或细胞内谷氨酸钠消耗的程度（如图2D). 更高的CB-839敏感性与更高的谷氨酰胺酶比活性（最直接的功能读数）密切相关(图5B). 与TNBC细胞对谷氨酰胺的更大利用一致，相对于受体阳性细胞系，TNBC细胞系中每个基于代谢的功能标记物都显著升高（补充图S4D–S4F和S6A–S6C）。因此，较高的CB-839敏感性与较高的基线细胞谷氨酸/谷氨酰胺比率相关(图5C)，CB-839诱导的细胞谷氨酰胺积累增加(图5D)以及CB-839诱导的细胞谷氨酸消耗增加(图5E). 综上所述，这些观察结果表明，在乳腺癌细胞系中，对CB-839的敏感性与这两种基因相关(GAC公司谷氨酰胺利用的功能标记（谷氨酰胺酶活性、谷氨酸：谷氨酰胺比率）。重要的是，在临床肿瘤活检中对这些CB-839敏感性生物标记物的评估可用于选择最有可能对CB-839治疗产生反应的患者。

这个体内CB-839的效用最初在药效学研究中进行了评估。将CB-839以200 mg/kg的剂量口服给患有原位移植HCC1806肿瘤的scid/米色小鼠。给药4小时后收集肿瘤、血浆和选定组织，以测量CB-839水平、药效学标记物（谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸）和谷氨酰胺酶活性（仅肿瘤）。血浆和肿瘤CB-839浓度分别达到>1.5μmol/L或nmol/g，表明系统暴露良好(图6A). 这种暴露水平与通过抑制谷氨酰胺酶活性测量的肿瘤中的强大药效反应有关(图6B)谷氨酰胺增加，谷氨酸和天冬氨酸减少(图6C)在肿瘤裂解物中。此外，CB-839在大多数小鼠组织中广泛暴露(图6D). 例外的是大脑，其暴露量比肿瘤或其他组织低7倍以上，表明CB-839不能有效地跨越血脑屏障。全身CB-839暴露与血浆和所有组织中谷氨酰胺的增加有关，但脑和肝除外，脑和肝的暴露可能是有限的，肝中CB-839不敏感形式的谷氨酰胺酶，GLS2级，表示为(图6D). 然而，尽管CB-839暴露水平较高，但血浆和组织中谷氨酰胺的增加（脾脏中最多为2.3倍）不如肿瘤中的谷氨酰胺增加（>5倍）显著。同样，在大多数组织中，CB-839未能降低谷氨酸或天冬氨酸水平；在谷氨酸和天冬氨酸减少的两个组织（肺和脾）中，它们的作用不如肿瘤中的明显。总之，这些结果表明，CB-839的药效学影响在很大程度上是肿瘤选择性的，这可能是由于肿瘤中谷氨酰胺酶途径的流量较大或正常组织中的有效代偿机制所致。

CB-839的抗肿瘤活性在两种乳腺癌异种移植模型中进行了测试，一种是原发性患者来源的TNBC异种移植，另一种是使用HER2的细胞系异种移植⁺基底样细胞系JIMT-1。主要患者衍生的TNBC模型是根据高GAC公司相对于一组其他乳腺肿瘤和其他实体瘤，具有高表达、高谷氨酰胺酶活性和高谷氨酸与谷氨酰胺比率（数据未显示）。皮下植入肿瘤达到150 mm后，每天两次以200 mg/kg的剂量给药CB-839^三由于小鼠的CB-839清除率相对较高（补充图S7A），因此需要每天两次给药以保持持续的靶向覆盖。在该模型中，研究结束时，单药CB-839相对于载体对照组抑制了61%的肿瘤生长(P（P）= 0.0029;图6E).

在JIMT-1异种移植模型中，通过治疗已建立的肿瘤（125mm^三在给药开始时），将CB-839作为单一药物，并与紫杉醇（治疗TNBC的标准化疗药物）联合使用。选择紫杉醇方案（研究开始时每隔一天服用5次，剂量为10 mg/kg），以提供次优疗效，确保有一个窗口来评估联合治疗的潜在影响。在研究结束时，与溶媒对照组相比，单独口服CB-839（200 mg/kg，每天两次）可产生54%的肿瘤生长抑制（TGI）(P（P）= 0.004;图6F). 单剂紫杉醇导致JIMT-1肿瘤的初步消退，随后快速再生，在研究结束时，相对于载体对照，TGI为73%(P（P）= 0.0002). CB-839与紫杉醇联合使用在很大程度上抑制了肿瘤的再生，导致研究结束时TGI相对于载体控制为100%(P（P）<0.0001与车辆和P（P）=0.0025 vs.紫杉醇）。这些体内先前发表的在淋巴瘤和肾癌模型中使用其他谷氨酰胺酶抑制剂的疗效结果(6, 9, 13, 19).

在这两项异种移植物研究中，CB-839耐受性良好（即使与紫杉醇联合使用），各组之间的体重增加没有差异（补充图S7B和S7C），也没有明显的毒性迹象。与肿瘤相比，该耐受性曲线可能反映了CB-839在正常组织中的温和药效(图6D)提示该药在临床上可能具有良好的治疗指标。

我们在这里报道了CB-839的发现和特性，它是一种有效和选择性的谷氨酰胺酶抑制剂。CB-839能够抑制支持大分子合成、ATP生成和细胞氧化还原平衡的关键谷氨酸衍生代谢中间产物，显示出靶向细胞活性。我们的工作表明，TNBC细胞的生长和生存特别依赖谷氨酰胺，并且通过CB-839抑制谷氨酰胺酶的活性来阻断这一途径在两种情况下都具有抗肿瘤活性在体外和体内模型。这种活性与GAC公司谷氨酰胺酶的剪接变异体和谷氨酸与谷氨酰胺（产物与底物）的高基线比率，这两个标记物可用于临床试验中对反应性患者进行富集。总之，这些结果表明，CB-839通过选择性地阻断肿瘤细胞使用谷氨酰胺作为营养物质的能力，可能对TNBC和其他谷氨酰胺依赖性癌症患者有治疗益处。

没有披露潜在的利益冲突。

概念和设计：M.I.Gross、S.D.Demo、J.B.Dennison、L.Chen、B.Goyal、G.J.Laidig、E.R.Lewis、A.L.MacKinnon、F.Parlati、E.B.Sjogren、T.F.Stanton、M.K.Bennett

方法论的发展：S.D.Demo、J.B.Dennison、T.Chernov-Rogan、J.R.Janes、E.R.Lewis、A.L.MacKinnon、F.Parlati、J.Yang

数据采集（提供的动物、采集和管理的患者、提供的设施等）：M.I.Gross、S.D.Demo、J.B.Dennison、T.Chernov-Rogan、J.R.Janes、E.R.Lewis、J.Li、A.L.MacKinnon、F.Parlati、M.L.M.Rodriguez、P.J.Shwonek、T.Wang、J.Yang、F.Y.Zhao

数据分析和解释（例如统计分析、生物统计学、计算分析）：S.D.Demo、J.B.Dennison、E.R.Lewis、A.L.MacKinnon、F.Parlati、M.L.M.Rodriguez、M.K.Bennett

撰写、审查和/或修订手稿：M.I.Gross、S.D.Demo、J.B.Dennison、T.Chernov-Rogan、A.L.MacKinnon、F.Parlati、M.K.Bennett

行政、技术或物质支持（即报告或组织数据、构建数据库）：S.D.Demo、J.R.Janes、J.Li、F.Parlati

研究监督：J.R.Janes、F.Parlati、M.K.Bennett

作者感谢Norman P.Curthoys博士（科罗拉多州立大学）赠送的抗KGA兔多克隆抗体和有益的讨论，以及Terri Davis和Barbara Frauman在手稿准备方面的帮助。

J.B.Dennison得到了葛兰素史克TRIUMPH博士后奖学金、美国癌症协会以及Joe and Jessie Crump医学研究基金博士后研究员的支持。所有其他工作均由Calithera Biosciences，Inc.资助。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，必须在此标记此物品广告根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。