CXCR2和CXCR1小分子拮抗剂通过降低肿瘤细胞增殖、存活和血管生成抑制人类黑色素瘤生长

人类皮肤恶性黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤癌，预后极差。2008年，据估计，美国将诊断出62480例新的黑色素瘤病例，8420人将死于这种毁灭性疾病(1). 早期疾病的治疗主要是手术，辅以辅助治疗的益处很小；然而，对于晚期疾病没有有效的治疗方法(2–7). 这清楚地表明需要新的和有效的治疗措施，以及更好地理解疾病进展的基本分子机制。

G蛋白偶联受体CXCR1和CXCR2是恶性黑色素瘤的重要治疗靶点(8). CXCR1和CXCR2都与趋化因子CXCL-8结合，具有高亲和力(9–11). 先前的研究表明，CXCR1和CXCR2均由几种类型的正常细胞表达，如中性粒细胞、内皮细胞和各种肿瘤细胞(9, 12–14). 更重要的是，我们和其他人已经证明CXCL-8在恶性黑色素瘤中组成性表达，并作为自分泌/旁分泌生长、侵袭和血管生成因子发挥作用(15–18). CXCL-8-CXCR1/CXCR2轴在黑色素瘤发病机制中的多重功能暗示强调了其作为癌症治疗靶点的重要性。

我们实验室的早期研究表明，CXCR1和CXCR2的中和抗体抑制黑色素瘤细胞增殖和侵袭潜能(18). 对CXCR1具有亲和力的小分子抑制剂，如repertaxin或对CXCR2具有亲和力，如SB-225002或SB-332235，已用于治疗炎症性疾病(19–21). 然而，CXCR1和/或CXCR2拮抗剂在肿瘤生长和血管生成中的有效性尚不清楚。在本研究中，我们通过以下方法评估了CXCR2/CXCR1特异性抑制剂SCH-479833和SCH-527123的潜力在体外和体内实验。我们的数据表明，CXCR2/CXCR1小分子拮抗剂通过降低肿瘤细胞增殖、存活率、侵袭潜能和血管生成来抑制人类黑色素瘤的生长。

细胞系和CXCR2/CXCR1拮抗剂。A375SM是一种高度转移的人类黑色素瘤细胞系，在补充有5%胎牛血清（Mediatech）的DMEM（Mediatech）中保持培养，1%我-谷氨酰胺（Mediatech）、1%维生素溶液（Mediaech）和庆大霉素（Invitrogen）。从冷冻库存中恢复后，培养物保持≤4周。SCH-479833和SCH-527123（参考。22; 请参见中的结构表1)在先灵葆雅合成并用羟丙基-β-环糊精（HPβCD；Acros Organics）配制。根据IC计算CXCR1和CXCR2对SCH-479833和SCH-527123的抑制常数（Ki）₅₀使用Cheng-Prusoff方程（参考。23;表1).

体外细胞增殖。A375SM细胞以低密度（每孔1000个）接种在96个板中。隔夜贴壁后，将细胞与单独培养基或含有血清（1.25%）的培养基与SCH-479833、SCH-527123或HPβCD培养72小时。使用两种拮抗剂的四种不同浓度（1.0、0.1、0.01和0.001μg/mL）。MTT法测定细胞增殖(17, 24). 生长抑制计算为%=[100-(A类/B类)×100]，其中A类和B类分别是处理细胞和未处理细胞的吸光度。

细胞运动和侵袭试验。为了研究SCH-479833或SCH-527123对黑色素瘤细胞迁移的影响⁶在无血清培养基中，将每孔）的细胞放置在无涂层聚对苯二甲酸乙二醇酯膜（6孔插入物，孔径8μm；Becton Dickinson）的顶部腔室中，而在侵入试验中，将细胞（每孔1000个）放置在Matrigel-coated Transwell腔室（24孔插入物；孔径8μm；Corning Costar）和培养基（无血清）上。底部腔室包含1.0 mL无血清培养基，加入或不加入CXCL-8（10 ng/mL）和SCH-479833、SCH-527123（10 ng/mL）或HPβCD。将细胞在37°C下培养过夜，并去除未迁移的细胞。按照制造商的说明，使用Hema 3试剂盒（Fisher Scientific）对通过膜孔的细胞进行染色。细胞在10个随机区域（×200）中计数，并表示为每个视野的平均细胞数。数据表示为三个独立实验的平均值。

蛋白质印迹分析。细胞在Triton X-100缓冲液[1%Triton X-100,50 mmol/L TBS（pH 7.4），10 mmol/LEDTA和蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics）和磷酸酶抑制剂（5mmol/L NaF和5mmol/LNa）中溶解_三VO（旁白）₄; 西格玛）]。对于蛋白质表达分析，通过SDS-PAGE解析50μg裂解物（8-12%）。主要抗体是针对磷酸化胞外信号调节激酶（ERK）1/2和ERK1/2（1:1000；兔多克隆；细胞信号技术）和GAPDH（1:1000，兔单克隆；细胞信息技术）的。二级抗体（圣克鲁斯生物技术公司）是辣根过氧化物酶偶联物，使用1:2000稀释液。

肿瘤生长试验。雌性裸鼠（6-8周龄）购自美国国家癌症研究所。在小鼠身上进行的所有程序均符合机构指南，并得到内布拉斯加州大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。对于体内注射后，用0.02%EDTA中0.25%的胰蛋白酶短暂暴露细胞。用含培养基的血清停止胰蛋白酶化，用HBSS冲洗细胞两次。仅使用存活率>90%至95%的单细胞悬液（通过台盼蓝排除试验测试）进行注射。小鼠注射1×10⁶细胞/0.05mL HBSS/动物进入侧翼皮下。肿瘤细胞注射后24小时，小鼠(n个=6/组），SCH-479833或SCH-527123拮抗剂，每日100 mg/kg体重，口服0.2 mL 20%HPβCD，持续21天。对照组小鼠口服0.2 mL溶媒（20%HPβCD）。每周用卡尺监测两次肿瘤生长，并在动物奄奄一息时处死。肿瘤体积按以下公式计算：体积=π/6×（较小直径）²×（较大直径）。在第50天处死动物，采集肿瘤组织并进行免疫组织化学分析。

免疫组织化学分析。如前所述进行免疫组织化学分析(25). 简言之，6μm厚的切片被脱蜡，非特异性结合被抗体稀释液（BD Pharmingen）培养所阻断。然后使用小鼠单克隆抗增殖细胞核抗原（PCNA；1:40；Santa Cruz Biotechnology）或小鼠生物素化GS-IB4（从单叶灰树; 1:50; 向量实验室）。按照制造商的说明，使用ABC Elite试剂盒和DAB底物（Vector Laboratories）检测免疫反应性。细胞质中的红棕色沉淀物表示阳性反应。阴性对照包括所有试剂，除了一级抗体。微血管的数量使用5×5分划格（Klarmann Rulings），使用×400物镜（总面积250μm）在显微镜下定量。

根据制造商的说明，通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析鉴定肿瘤样本中的凋亡细胞(现场细胞死亡检测试剂盒，荧光素；罗氏）。凋亡细胞的数量通过以双盲的方式在放大×200倍的条件下对10个任意选择的视野中的阳性（棕色染色）细胞进行计数来评估，并表示为每个视野中的平均细胞数。

统计分析。所有值均表示为平均值±SE。使用非配对双尾比较各组之间的差异t吨测试。体内使用Mann-Whitney进行分析U型显著性检验。P（P）<0.05被认为是显著的。所有统计分析均使用SPSS软件（SPSS）进行。

口服活性CXCR1和CXCR2拮抗剂抑制人类黑色素瘤生长。为了检测拮抗剂对肿瘤生长的影响，我们将人黑色素瘤A375SM细胞皮下注射到裸鼠体内，24小时后，单独口服100 mg/kg SCH-479833或SCH-527123拮抗剂（HPβCD或HPβCD），每日一次，共21天。与对照组相比，SCH479833和SCH527123治疗组动物的肿瘤尺寸均显著减小(图1). 服用SCH-479833和SCH-527123拮抗剂后(P（P）< 0.05; 与HPβCD治疗的动物相比，肿瘤体积减少了2.9至4.5倍。与SCH-479833和SCH-527123治疗组注射后9天相比，对照组在注射后6天内开始出现肿瘤。

接下来，我们分别通过PCNA和TUNEL免疫染色检查肿瘤生长抑制是否是由于黑色素瘤细胞增殖和/或生存率降低所致。PCNA是一种细胞周期相关蛋白，是一种常用于测量肿瘤组织增殖活性的重要生物标志物(26)而TUNEL是检测凋亡信号级联导致的DNA片段的常用方法(27). 肿瘤切片的PCNA免疫染色显示SCH-479833和SCH-527123治疗组的PCNA阳性细胞显著减少(图2A). SCH-479833和SCH-527123治疗的肿瘤中PCNA阳性细胞的平均数量分别为43.5±3.22和34.9±2.74，而对照治疗的肿瘤中PCNA阳性细胞的平均数量为94.0±6.97(图2B). 肿瘤切片的TUNEL染色显示SCH-479833和SCH-527123治疗组的凋亡细胞显著增加(图2C). 在SCH-479833和SCH-527123治疗的肿瘤中，TUNEL阳性细胞的平均数量分别为91.3±2.93和99.3±2.08，而在对照肿瘤中为48.5±1.97(图2D).

SCH-479833或SCH-527123拮抗剂治疗的动物肿瘤血管生成减少。大多数实体瘤，包括黑色素瘤，都需要新的血管形成才能生长到直径超过几毫米(28). 在以前的研究中，有报道称CXCL-8是CXCR1和CXCR2的配体，起到血管生成因子的作用(16–18). 因此，我们研究了SCH-479833或SCH-527123拮抗剂对人类黑色素瘤生长的抑制是否涉及对血管生成的影响。肿瘤组织新生血管的显微镜检查显示SCH-479833或SCH-527123拮抗剂治疗组的微血管数量显著低于对照组(图3;表2). 平均而言，SCH-479833和SCH-527123治疗导致血管数量减少35%和45%(图3;表2).

SCH479833和SCH527123治疗降低了人类黑色素瘤细胞的趋化性和侵袭性体外试验。肿瘤的整体生长取决于肿瘤细胞与宿主微环境的相互作用。在以前的研究中，有报道称趋化因子信号不仅有助于内皮细胞的迁移，从而促进血管生成，而且有助于肿瘤细胞的运动和侵袭(29). 因此，我们研究了CXCR2/CXCR1拮抗剂治疗是否会影响肿瘤细胞的趋化性和侵袭性。我们的数据显示(P（P）与对照处理细胞相比，SCH-479833或SCH-527123处理细胞对CXCL-8诱导的趋化性的抑制（减少2.8至5.0倍）(图4A和B). SCH-479833或SCH-527123处理的细胞也显示出显著的抑制作用(P（P）与对照组相比在体外侵入试验(图4C和D).

SCH-479833和SCH-527123治疗以剂量依赖的方式抑制黑色素瘤细胞增殖，并抑制ERK1/2信号通路。用增加剂量的SCH-479833和SCH-527123拮抗剂（0.001-1.00μg/mL）处理人类黑色素瘤细胞后，MTT检测到其增殖逐渐受到抑制在体外增殖试验(图5A和B). 在1μg/mL剂量的SCH-479833和SCH-527123拮抗剂下，观察到黑色素瘤细胞增殖抑制率分别为33%和31%。

接下来，我们研究了拮抗剂治疗对ERK1/2磷酸化的影响，ERK1/2是一种重要的信号通路，参与生长信号的控制、细胞存活和侵袭(30). 用1μg/mL的SCH-479833或SCH-527123治疗人类黑色素瘤细胞，可显著降低ERK1/2的磷酸化，表明这是SCH-478833和SCH-527223的抗增殖、抗侵袭和抗血管生成活性的机制(图5C).

在本研究中，我们发现在裸鼠体内口服CXCR2/CXCR1拮抗剂（SCH-479833或SCH-527123）可以抑制植入的人类黑色素瘤的生长。此外，我们的研究表明，SCH-479833和SCH-527123的抗肿瘤功效是由于细胞增殖和血管生成减少以及细胞凋亡增强所致。此外，我们还观察到，经拮抗剂治疗后，人类A375SM细胞的趋化性和侵袭性降低。

小分子抑制剂的使用是一种有吸引力的靶向治疗方法。以前，我们发现CXCL-8合法的黑色素瘤生长是通过趋化因子受体CXCR1和CXCR2介导的(18). 因此，靶向这些受体似乎是一个显而易见的选择。我们的体内该研究中，小鼠口服SCH-479833或SCH-527123拮抗剂，与对照组相比，治疗组的肿瘤体积减少。这一发现清楚地表明了SCH-479833和SCH-527123拮抗剂作为新的黑色素瘤治疗药物的潜力，并且与我们之前关于CXCR1和CXCR2与黑色素瘤侵袭性的相关性的观察结果一致(25).

肿瘤的整体生长体内取决于几个因素，包括肿瘤细胞增殖率、生存率、肿瘤组织血管化以及肿瘤细胞的侵袭能力(31, 32). 在评估SCH-479833或SCH-527123拮抗剂对增殖和凋亡的影响时，我们观察到来自治疗小鼠的异种移植物与PCNA和TUNEL免疫染色检测到的细胞增殖减少和凋亡增加相关。这个在体外研究也支持上述发现，因此显示了CXCR2/CXCR1拮抗剂SCH-479833和SCH-527123的抗增殖作用。这些结果进一步支持了我们之前的工作，即在CXCR1和CXCR2的中和作用下抑制黑色素瘤细胞的增殖(18).

CXCR1和CXCR2也与黑色素瘤细胞的趋化性迁移和血管生成反应有关(33–35). 尽管如此，Addison等人的一份报告(33)描述了CXCR2在介导血管生成中的重要性。与对照组相比，我们观察到CXCR2/CXCR1拮抗剂治疗动物的肿瘤新生血管生成受到显著抑制。我们早期的数据表明，内皮细胞表达CXCR1、CXCR2和CXCL-8可以提高其生存和增殖(36). 在我们的拮抗治疗组中，血管密度的降低可能是由于血管生成因子的低表达或内皮细胞的凋亡所致。我们观察到CXCR2/CXCR1拮抗剂治疗后，CXCL-8诱导的内皮细胞存活率降低。^三

以前，内皮细胞表达CXCL-8可以通过CXCR1诱导黑色素瘤细胞的趋化反应(37). 同样，尽管CXCL-8对CXCR1和CXCR2的亲和力相似，表达水平相似，但中性粒细胞的趋化性主要由CXCR1介导(38, 39). 尽管这些研究表明CXCR1和CXCR2具有某种不同的功能，但我们观察到，在使用这两种拮抗剂的治疗中，黑色素瘤细胞的趋化性受到抑制；SCH-527123的效果更明显。与CXCR1相比，SCH-527123和SCH-479833对CXCR2具有相当的选择性（74倍和100倍）。它们的主要区别在于对CXCR2的亲和力，SCH-527123的效力是前者的3倍以上。因此，SCH-527123活性的提高可能是由于CXCR2的Ki较低。

有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路控制各种细胞功能，如生长、增殖、侵袭和分化(40). 越来越多的证据表明ERK1/2通路的激活可能与黑色素瘤细胞的致癌行为和侵袭潜能有关(30, 41). 我们发现，在使用任何一种拮抗剂进行治疗时在体外，A375SM细胞ERK1/2磷酸化显著降低。因此，这一发现可能表明ERK通路在CXCL-8-CXCR1/2信号传导中在黑色素瘤细胞增殖和侵袭中的作用。

在结肠癌小鼠模型中也观察到这些拮抗剂抑制肿瘤生长和血管生成，⁴

总之，我们的数据表明CXCR2/CXCR1拮抗剂对黑色素瘤模型有效。这些拮抗剂的抑制作用是由于黑色素瘤细胞的增殖、存活和侵袭减少所致。此外，血管生成也被抑制，这对维持肿瘤细胞的营养和氧气供应极为重要。基于这些临床前发现，SCH-479833和SCH-527123代表了潜在的治疗人类恶性黑色素瘤的新型药物。

没有披露潜在的利益冲突。

我们感谢Ajay P.Singh博士（内布拉斯加州大学医学中心）仔细阅读本文。