p53癌苗联合化疗治疗晚期小细胞肺癌

小细胞肺癌（SCLC）是一种侵袭性肺癌，5年生存率<10%。广泛期（ES）疾病的诊断约占新发SCLC病例的三分之二，如果不治疗，这些患者的中位生存期仅为2至4个月，化疗后生存期增加至6至8个月。这种疾病对一线化疗非常敏感，常规观察的有效率>50%。然而，这些反应几乎总是短命的，并且在广泛期疾病患者中经常复发。复发或化疗无效后，患者通常会在几个月内死于疾病(1). 如果患者对铂有耐药性（即在含铂方案完成后3个月内发生疾病进展），复发性小细胞肺癌患者的治疗尤其具有挑战性，其中中位生存期为3.7至4.7个月。铂敏感患者的中位生存期为5.8至6.9个月(2).

很明显，需要新的治疗方法来改善这种疾病的结果。癌症疫苗可能代表了这样一种方法。尽管近年来进行的一些免疫治疗临床试验显示了令人鼓舞的结果，但大多数试验的临床反应非常有限(三). 这些试验的结果确定了癌症免疫治疗成功转化的主要挑战。癌症疫苗最重要的要素之一是合适的肿瘤相关抗原。理想的肿瘤相关抗原不仅会在很大一部分癌症患者中表达，而且肿瘤细胞的存活需要肿瘤相关抗原的持续存在。使用这种方法，不可能出现抗原缺失变体。抑癌基因，第53页具有理想肿瘤相关抗原的许多特征。它作为细胞生长和分化的调节器发挥着重要作用。这个第53页约90%的小细胞肺癌发生基因突变(4, 5). 野生型第53页蛋白质的半衰期很短，因此在正常细胞中含量很低，而突变的第53页半衰期显著延长，在肿瘤细胞中含量更高。正常细胞和恶性细胞之间蛋白质表达的这种差异水平可以为免疫疗法提供基础第53页蛋白质被认为是一种潜在的抗原靶点，可以通过免疫治疗策略进行开发（参考文献综述）。6). 突变肿瘤细胞的存活第53页在很大程度上取决于突变体的存在第53页.使用小鼠模型的临床前研究(7, 8)和一个体外人类文化模式(9)研究表明，抗p53 CTL反应的诱导选择性地杀死肿瘤细胞，并保护正常细胞。此外，抗p53 T细胞已被证明存在于癌症患者中(10–12).

癌症疫苗的另一个关键要素是，肿瘤相关抗原的载体应能激活初级免疫反应，并在必要时克服对自身蛋白的耐受。树突状细胞（DC）是最有效的抗原提呈细胞，积极用于癌症免疫治疗（参考文献综述）。13). 近年来，越来越清楚的是，基于DC的免疫治疗的成功取决于这些细胞的激活状态。腺病毒提供了激活DC的有效手段。DC的腺病毒转导导致细胞膜MHCⅡ类和DC上的共刺激分子上调，并增加促炎细胞因子如白细胞介素12的产生(14–16). 腺病毒还为基因递送到DC中提供了一种极好的工具，从而产生持续高水平的转基因蛋白质（参考文献综述）。17, 18).

本研究的目的是评估DC-Ad-p53疫苗对ES SCLC患者的免疫和临床效果。该试验的初步结果提供了临床证据，支持免疫治疗与化疗相结合可能对晚期癌症患者有益的假设。

临床方案。在登记患者之前，该方案经过了食品和药物管理局（BB-IND 9792）、NIH生物技术活动办公室重组DNA咨询委员会（OBA编号0205-538）、南佛罗里达大学机构审查委员会和南佛罗里达大学生物安全委员会的审查和批准。组织学诊断为ES SCLC的18岁或以上患者有资格参加。东部合作肿瘤组的表现状态为0到2，器官功能充足（WBC，>3000/mm^三; ANC，>1500/mm^三; 血小板，>100000/mm^三; 红细胞压积>25%；胆红素，<2.0 mg/dL；肌酐<2.0 mg/dL）。既往有自身免疫性疾病、免疫缺陷、严重持续感染或脑转移失控的患者不合格。

所有患者在接受试验疫苗之前均接受常规细胞毒性化疗。18名患者接受卡铂/VP-16治疗，8名患者接受顺铂/VP16治疗，3名患者接受顺铂/CPT-11治疗。化疗后病情进展的患者如果符合所有其他入选标准，则符合资格。在最后一次化疗后至少8周，这些患者进行了白细胞分离。生产疫苗，并在四个不同的部位进行皮内注射，这些部位会流入双侧腋窝和腹股沟淋巴结盆地。每两周重复三次。第三组疫苗接种两周后，患者重新接种。那些此时未表现出进展性疾病的患者接受了第二次白细胞分离程序，并额外接种了三套疫苗，这一次每4周接种一次。在第三次或第六次疫苗接种后出现进展性疾病的患者接受额外的细胞毒性化疗。

疫苗生产。用于产生DC的单核细胞在白细胞分离后获得，并保存在液氮中。解冻后，将细胞置于组织培养瓶中的X-VIVO-15培养基（马里兰州沃克斯维尔Biowittaker）中，浓度为1.3至1.7×10⁶细胞/厘米²可用的培养表面。培养2小时后，去除非粘附细胞，并用X-VIVO-15培养基重新填充烧瓶，该培养基补充有5ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Amgen，Thousand Oaks，CA）和5ng/mL白细胞介素-4（R&D Systems，Minneapolis，MN）。将烧瓶培养48小时，然后向烧瓶中添加额外的细胞因子补充培养基。然后将烧瓶再培养72小时。培养完成后，收集非粘附细胞和松散粘附细胞，以15000:1的病毒粒细胞比感染Ad-p53 2小时。在初步实验中确定了腺病毒的最佳剂量，该腺病毒可产生最高水平的人类p53表达，对树突状细胞的毒性最小。在2小时培养结束时，添加X-VIVO培养基，使最终细胞浓度达到10⁶细胞/mL，细胞在烧瓶中再培养46小时，然后收集、清洗和分析细胞。疫苗发布标准包括：(一)革兰氏染色阴性(b条)阴性支原体PCR分析检测(c（c）)最大内毒素浓度为5 EU/mL，以及(d日)通过流式细胞术分析证明细胞内p53表达的成熟DC表型。成熟DC表型被定义为谱系（CD3、CD14、CD19、CD20和CD56）阴性、HLA DR阳性和CD86阳性细胞。为了测定p53阳性DC，用“fix and perm”试剂（Caltag，Burling，CA）处理细胞。用p53特异性抗体染色，然后用藻红蛋白标记的抗尿液免疫球蛋白抗体染色。在洗去多余的抗体后，用FITC-结合单克隆抗体对谱系标记进行表面染色，用藻红蛋白结合单克隆抗对HLA-DR进行表面染色。通过流式细胞术分析最终产物。

ELISPOT分析中IFN-γ产生细胞的分析。分别于接种前、第三次接种完成后2～3周（接种后时间点）和2个月后采集患者外周血单个核细胞。样品保存在液氮中的小份中。同时对每个患者的样本进行解冻和分析。ALVAC-p53是一种含有全长野生型p53的重组金丝雀痘病毒，从加拿大多伦多的Aventis Pasteur获得。单核细胞在无血清培养基中感染ALVAC-p53或ALVAC-对照（空载体）2小时，每细胞感染4个斑块形成单位。感染后，将细胞分成四份接种在添加白细胞介素-2（1×10）的完整培养基中⁵细胞/孔），预涂有抗IFN-γ抗体并培养36小时。如前所述，使用自动ELISPOT阅读器（CTL）评估产生IFN-γ的细胞数量(9, 19). 来自HLA-A2阳性患者的单核细胞与10μg/mL p53衍生HLA-A2结合肽（LLGRNSFEV）或对照PSA-衍生肽（FLTPKKLQCV）平行孵育36小时。如前所述，在ELISPOT分析中评估IFN-γ产生细胞的数量(19).

四聚体染色。四聚体HLA-A-0201/LLGRNSFEV由Yerkes地区灵长类动物研究中心的国家过敏和传染病研究所MHC四聚体核心设施生产。用抗原提呈细胞结合抗CD8抗体和藻红蛋白结合四聚体（1:100稀释）在4°C下对单核细胞染色60分钟。作为对照，我们使用了一种含有来自黑色素瘤抗原gp100（KTWGQYWQV）的HLA-A2肽的四聚体。CD8中四聚体阳性细胞的比例⁺计算T细胞数量。

体液免疫反应评估。使用至少四种系列稀释液在ELISA中评估抗p53和抗腺病毒抗体（IgG和IgM）的水平。制造商提供的内部控制被用来建立一个“临界”水平。样品分析总是一式两份。在波长为450 nm的分光光度计上，对照620 nm的参考过滤器读取吸光度，以补偿微量滴定板材料的差异。p53自身抗体Elisa^加号该试剂盒（加州圣地亚哥Calbiochem）用于测量人类血清样本中针对p53的循环抗体。腺病毒IgG/IgM ELISA试剂盒购自IBL免疫生物学实验室（德国汉堡）。

T细胞和DC的表型和功能。解冻后，将单核细胞在添加10%FCS的完整培养基中培养过夜。使用FACSCalibur流式细胞仪和从Becton Dickinson（新泽西州富兰克林湖）获得的单克隆抗体，通过多色流式细胞术评估细胞表型。

为了评估T细胞增殖，单核细胞（1×10⁵)在0.1μg/mL破伤风类毒素或5μg/mL植物血凝素（西格玛，密苏里州圣路易斯）存在下，在U底96-well培养板中培养三份。这些浓度是在初步测试后选择的。^三在第3天加入H-胸苷（1μCi），18小时后收获细胞。使用液体闪烁计数器评估胸苷掺入。刺激指数计算为有刺激与无刺激时细胞增殖的比率。

为了评估DC功能，使用T细胞富集柱（R&D系统）从对照供体中分离出反应性T细胞。T细胞（10⁵/well）与从癌症患者中获得的单核细胞在U型底部96 well板中培养。使用单核细胞比率为1:1至1:8的T细胞。所有实验均一式三份。^三第3天加入H-胸腺嘧啶核苷（1μCi），18小时后收获细胞。使用液体闪烁计数器评估胸苷掺入。每个单核细胞样本与至少两个不同捐赠者的T细胞进行测试，并使用最大结果。

统计分析。我们使用SAS（SAS，Inc.v.9.2.，Cary，NC）和GraphPad Prizm软件进行统计分析。采用描述性统计分析p53特异性免疫应答。采用Wilcoxon Mann-Whitney检验确定两组连续变量之间的关系。考虑到样本量较小，通过Fisher精确检验分析了应答者频率和群体之间的单变量关联。在这项探索性研究中，没有尝试调整到多次测试。任何似乎具有统计意义的结果都需要进一步确认。采用Kaplan-Meier方法，利用从首次接种疫苗到随访结束的持续时间来估计总生存率。所有计算均采用双面测试。所有分析的统计显著性由P（P）< 0.05.

患者特征和治疗总结。2003年1月至2005年6月期间，29名患者接受了疫苗治疗。所有患者在接种时均患有ES SCLC（17例新诊断ES疾病，12例复发疾病；表1). 中位年龄为63岁（39-76岁）。20名患者仅在一次化疗后接种疫苗（6名患者在两次化疗后，3名患者在三次化疗后）。所有患者之前均接受过铂治疗(表1).

DC由外周血单个核细胞前体产生，然后感染含有野生型p53（ADVEXIN；Ad-p53）的腺病毒构建物。Ad-p53感染后细胞表型的典型示例如图1患者计划每隔2周接受三次皮下注射疫苗。如果患者病情稳定或好转，他们会每月接种三次或更多剂量的疫苗。试验的第一阶段部分的最初目标是将疫苗剂量从5×10增加到5×10⁶至5×10⁷第53页⁺数据中心。然而，发电量>5×10⁶第53页⁺每剂量的DC难以实现。因此，由于可行性，p53的剂量⁺DC未升级到5×10以上⁶细胞。平均7.7×10⁷总直流电和8.6×10⁶第53页⁺每个剂量产生DC(表2). 注射的p53数量⁺DC限制为5×10⁶即使生成了更多的细胞。

对疫苗的抗原特异性细胞免疫反应。使用含有野生型p53或对照病毒的金丝雀痘病毒（ALVAC）刺激IFN-γELISPOT试验，评估p53特异性免疫应答。使用含有全长p53基因的ALVAC可以评估p53特异性反应，而不考虑患者的HLA单倍型。如果免疫后（第三次免疫后2-3周）p53特异性反应比免疫前p53特异反应高出2 SD以上，且至少比控制ALVAC反应高2 SD，则认为疫苗接种反应显著。具有代表性的ELISPOT数据如所示图2A使用HLA-A2提供的p53衍生肽或对照肽，在12名HLA-A2阳性患者中进一步评估免疫应答。示例性结果如所示图2B在这些HLA-A2阳性患者中，也可以评估抗原特异性CD8⁺使用四聚体染色的T细胞（数据未显示）。

在25名使用ALVAC-p53的患者中，有13名（52%）和12名使用p53衍生肽的患者中有7名（58.3%）发现了轻微但显著的p53特异性T细胞接种反应(图2C和D). 由于技术原因，三名对p53衍生肽疫苗接种有显著反应的患者未进行ALVAC-p53检测。总的来说，28名受试患者中有16名（57.1%；称为p53应答者）对免疫有统计学意义的p53特异性应答。当两种检测方法都用于检测同一患者的外周血单个核细胞时，与p53衍生肽相比，ALVAC-p53的反应率没有显著差异(P（P）>然而，四聚体染色的频率较低。11名受试患者中只有3名（27.2%）的四聚体染色显著增加。对疫苗有免疫应答的患者与对疫苗无应答的患者p53特异性免疫的流行水平相似（数据未显示）。

我们分析了每种疫苗注射的DC数量与免疫产生的p53特异性免疫反应之间的可能联系。平均而言，14名患者接受了最大剂量（5×10⁶第53页⁺每种疫苗的DC），2名患者接受了4×10以上⁶细胞，5名患者接受了3个以上但4×10以下的治疗⁶细胞，6例患者接受大于2但小于3×10⁶细胞，2例患者接受小于2×10⁶第53页⁺DC。未发现注射DC的数量与p53特异性免疫反应之间的相关性。

疫苗的细胞和体液免疫反应之间的联系。22名受试患者中有10名（45%）在免疫前检测到抗p53抗体水平，只有3名患者免疫后抗p53血清水平显著升高。有趣的是，这三名患者的抗体水平都可以检测到。在免疫前检测到抗p53抗体水平的10名患者中，有4名（40%）对疫苗接种产生了p53特异性T细胞阳性反应，这与不存在抗p53血清水平的患者的反应率没有统计学差异（数据未显示）。

抗腺病毒抗体可能在限制腺病毒基癌症疫苗的有效性方面发挥关键作用。我们使用患者血清的系列稀释液，通过ELISA测定抗腺病毒IgG和IgM抗体。大多数患者在免疫前检测到抗腺病毒IgG抗体水平。经过三轮腺病毒p53 DC免疫后，28名受试患者中有16名（57.1%）的抗腺病毒抗体滴度增加。14名患者出现中度增加（>2倍和<8倍），2名患者出现显著增加（>8倍）。抗腺病毒抗体显著增加的两名患者并没有对免疫产生p53特异性细胞反应。在14例抗腺病毒抗体滴度中度升高的患者中，有12例（85.7%）观察到p53特异性细胞免疫应答，而在13例患者中，只有5例（38.5%）抗体滴度没有明显升高(P（P）= 0.018;图2E). 在这些患者中检测到的抗腺病毒抗体具有中和活性，中和滴度中位数为1:1600。

接种疫苗的免疫反应与T细胞功能、DC活性和未成熟髓细胞存在的流行水平相关。p53特异性T细胞反应的产生不仅取决于抗原刺激的质量，还取决于宿主（尤其是DC）中T细胞和抗原呈递细胞的功能活性。为了确定宿主免疫系统的先存状态是否影响疫苗接种的结果，在接种疫苗之前，用破伤风类毒素或植物血凝素刺激患者分离的单核细胞，并通过摄取^三H-胸腺嘧啶。20名受试患者中有9名（45%）的破伤风类毒素反应低于正常样本的下限（刺激指数<15），19名受试者中有9人（47.3%）的植物血凝素反应低于控制范围（刺激指数<25）。然而，T细胞对破伤风类毒素或植物血凝素反应降低的患者对疫苗产生p53特异性免疫的速度与T细胞反应正常的患者相似(P（P）> 0.1; 数据未显示）。

最近的研究表明CD4⁺CD25型⁺调节性T细胞（T_规则)可能在下调抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用（参考文献。20). 作为T的初始评估_规则人口，CD25^高的在CD3的总人口中计数细胞⁺CD4细胞⁺T细胞。接种前或完成接种后2至3周，健康受试者组和SCLC患者组之间的这些细胞比例没有差异(图3A). 此外，在接种前后患者血液中这些细胞的存在与p53特异性T细胞对接种的反应之间没有统计学意义上的联系(图3B).

还研究了接种前DC的数量和功能活性与疫苗接种后的抗原特异性反应之间的可能关联。尽管DC的中位比例在统计上没有显著下降（Lin⁻人类白细胞抗原-DR⁺)也不是他们的成熟CD83⁺与正常受试者相比，SCLC患者的DC水平降低（低于对照组的最小值；图3C). 与这些细胞水平正常的患者相比，总DC人群水平降低的患者对疫苗接种产生p53特异性细胞免疫反应的能力没有显著降低(图3D). 相反，CD83水平降低的患者中p53特异性反应的发生率有降低的趋势⁺到期跟单信用证。CD83水平控制的六分之五患者⁺接种疫苗前，DC对疫苗产生p53特异性免疫反应，而这些细胞水平降低的12名患者中只有5名对疫苗产生反应(P（P）= 0.15;图3D). SCLC患者DC的HLA-DR表达显著低于健康人(图3E). 此外，在异基因混合白细胞反应中，DC的功能显著下降(图3F). 该病例中p53特异性免疫应答的分析与疫苗接种无关，因为很少有患者显示这些变量的控制水平。

因为未成熟的髓细胞与肿瘤宿主的免疫抑制状态有关(21, 22)检查SCLC患者是否存在这些细胞。SCLC患者的Lin水平升高⁻人类白细胞抗原-DR⁻CD33型⁺接种疫苗前的未成熟髓细胞(P（P）= 0.01). 接种疫苗后，它们的出现进一步增加(P（P）= 0.002;图3G). 接种前未成熟髓细胞水平正常的所有6名患者对接种产生p53特异性免疫反应（100%），而在12名未成熟髓样细胞水平升高的患者中只有4名患者（25.0%；P（P）= 0.012;图3H). 因此，与未成熟髓细胞水平正常的患者相比，未成熟髓样细胞增多的患者似乎不太可能对疫苗产生反应。

疫苗接种的临床反应及其与抗原特异性免疫反应的关系。与接种疫苗相关的不良事件很少发生，而且大多是轻微的。只有两名患者在接种疫苗后出现2级不良事件（一名为疲劳，一名为关节痛），并且从未因出现任何不良事件而停止接种疫苗。不良事件的发生与之前接种的疫苗数量无关。

在29名接受疫苗治疗的患者中，1名患者获得部分缓解，7名患者病情稳定，21名患者病情进展。初步诊断后，部分缓解的患者立即接受了四个周期的顺铂和足叶乙甙联合胸部放射治疗。在最后一次服用顺铂2个月后，她出现了一些正电子发射断层扫描阳性的腹膜后淋巴结肿大。当时她接种了三种疫苗，两周后再次接种。实体瘤测量的总体反应评估标准显示，她所有可测量病灶的大小减少了60%(图4A). 这名患者，以及七分之五的接种疫苗后病情稳定的患者，最终在2至6个月后病情进展。在接种疫苗后病情进展的27名患者中，有23名患者接受了额外的化疗（4名患者拒绝）。此时，对21名患者进行了临床随访。其中，有13例对铂耐药（在接受含铂方案后90天内进展）。14名患者接受紫杉醇治疗，3名患者接受卡铂/CPT-11治疗，2名患者接受CDDP/CPT-11.，1名患者接受卡铂/VP-16治疗，1名接受表阿霉素治疗。先前发表的铂耐药ES小细胞肺癌患者对二线化疗的客观有效率为2%至5%，对于50%以上患者患有耐药疾病的研究（如我们的患者群体；6%至16%；参考文献。23). 然而，在接受二线化疗的21名患者中，我们观察到61.9%的患者有客观的临床反应（部分反应+完全反应）(表3). 只有4名患者（19%）在二线化疗后出现进展。13名接受疫苗治疗的铂耐药患者在接受疫苗治疗后病情进展时接受了各种化疗方案，有效率为61.5%(表3). 这些铂耐药性患者的中位生存率(n个=13）从第一次接种疫苗开始为9.3个月，较低的95%置信区间为7.1个月。从第一次接种疫苗开始，所有29名患者的平均总生存期为11.8个月，较低的95%置信区间为7.9个月(图4B). 29名患者中有11名（38.1%）在接种第一种疫苗后1年存活。

迄今为止，已有28名接受治疗的患者可进行免疫反应评估。一名患者因血样丢失而退出免疫反应分析。我们评估了p53特异性T细胞免疫反应与二线化疗临床反应之间的关系。如上所述，在接种结束后2至3周，即二线化疗开始前，检测免疫反应。免疫反应阳性的12名患者中有9名（75%）对二线化疗产生了完全或部分反应，而10名患者中只有3名（30.0%）没有检测到免疫反应(P（P）= 0.08;图4C). 与免疫接种无反应的患者相比，免疫接种有阳性反应的患者总体生存期（中位数12.1个月）略有改善（中位数9.6个月）。

大多数患者在接种结束后3-4周开始二线化疗。为了追踪这些患者的特异性免疫应答状态，我们在最后一次接种疫苗2个月后评估了p53特异性免疫反应。在大多数患者中，p53特异性免疫反应显著降低(图4D和E). 这种减少与化疗引起的显著淋巴细胞减少无关(图4F).

本研究的目的是开发一种疫苗，以改善ES SCLC的临床结局。我们和其他人已经在临床前实验中确定p53可能是癌症免疫治疗的良好靶点(7–9, 14, 24–29). 在一些使用p53肽或含有野生型的病毒载体的临床试验中第53页基因，在一些患者中产生特异性免疫反应的报道。然而，尚未观察到客观的临床反应(11, 30, 31). 我们假设，使用最有效的抗原提呈细胞DC（通过野生型p53转导）可能会诱导更有效的p53特异性免疫反应，从而转化为临床反应。腺病毒不仅是将基因传递到树突状细胞的良好工具（参考文献综述）。17, 18)而且还通过上调MHCⅡ类和DC上的共刺激分子、产生白细胞介素-12和其他促炎细胞因子以及增强功能潜能来诱导这些细胞的活化(14–16, 32, 33). 因此，腺病毒提供了结合Ag递送和DC激活的独特能力，并可能为基于DC的癌症免疫治疗提供额外的益处。

接种疫苗导致超过一半的治疗患者（57.1%）产生p53特异性T细胞反应。这些数据表明，尽管我们做出了努力，但从免疫学角度来看，该疫苗仅对一半患者有效。有几个因素可能导致次优免疫反应：T细胞功能缺陷、调节性T细胞诱导的T细胞抑制、宿主DC无法维持抗原特异性免疫反应、存在免疫抑制的DC或巨噬细胞、，未成熟髓细胞抑制抗原特异性免疫反应、诱导抗腺病毒免疫反应等。在一项研究中，不可能评估所有可能的机制。我们的分析表明，抑制T细胞的整体反应性和T细胞的累积_规则与未能产生p53特异性免疫反应无关。我们的数据并不一定表明T缺乏参与_规则SCLC中。T型_规则可能从外周血迁移到肿瘤部位。此外，由于所有患者在分析前8周都接受了以铂为基础的化疗，因此化疗可能已经消除了一些这些细胞，就像之前报道的环磷酰胺一样(34). 目前正在进行调查以解决这一问题。

我们的数据显示，成熟CD83的存在减少与⁺接种疫苗前患者外周血中的DC和对疫苗缺乏免疫反应。这些数据可能指出宿主DC在抗原特异性免疫反应的发展中的重要作用。几乎所有参与试验的患者的DC功能水平都显著降低，这表明在接种疫苗之前改善DC功能可能是提高疫苗疗效的必要条件。

ES SCLC患者的未成熟髓样细胞水平增加，这些细胞与肿瘤相关抗原特异性免疫抑制有关(21, 22, 35). 重要的是，100%的未成熟髓系细胞普惠西林水平正常的患者对疫苗接种产生p53特异性反应，而未成熟髓细胞普惠西碱水平升高的患者只有25%(P（P）= 0.012). 这些差异表明，未成熟髓细胞数量的增加可能会对疫苗的抗原特异性反应产生负面影响。接种疫苗后，未成熟髓细胞的存在进一步增加，只有两名患者的这些细胞水平正常（两人对接种都产生了阳性反应）。未成熟髓细胞的增加可能是由于大多数患者在评估时都患有进展性疾病，因此，去除未成熟髓样细胞可能有助于增强癌症疫苗的效果。

抗腺病毒抗体反应的诱导被认为是该载体用于基因治疗的主要限制因素之一。然而，我们的结果表明，抗腺病毒抗体滴度的适度增加与p53疫苗特异性反应有关。由于腺病毒和p53衍生抗原均出现在同一DC上，因此抗腺病毒免疫评估可能与DC的功能活性相关。这些数据与动物模型中获得的结果一致，动物模型显示，用不同腺病毒构建物转导的树突状细胞免疫小鼠后，抗腺病毒反应有限，不影响抗原特异性CTL活性(14, 36).

尽管一半以上的患者诱导了p53抗原特异性免疫，但只有一名患者在疫苗治疗后出现了客观的临床反应。尽管这种客观反应表明疫苗可能具有直接的抗肿瘤作用，但这种反应的频率并不令人满意。重要的是，它与之前的临床试验中描述的反应类似(三). 然而，在二线化疗患者治疗后，观察到了意想不到的结果。大多数接种疫苗的患者对随后的化疗有客观的临床反应（完全反应或部分反应）。鉴于这组患者的历史反应率非常低；这些数据表明疫苗接种引起的疾病的临床结果有所改善。ES SCLC患者预后不良（参考文献。16)中位生存期为7-11个月。尽管一线化疗在40%至70%的时间内产生肿瘤反应，但二线化疗的反应率要低得多。在接受铂化合物（铂耐药）治疗后90天内发生进展性疾病的患者预后特别差，单药化疗的有效率为3.7%至6.4%，相应的中位生存期为3至6.9个月(37–39). 一项试验显示，紫杉醇、顺铂和异环磷酰胺联合治疗患者的有效率为70%。虽然没有单独报告铂耐药患者的中位生存期，但所有接受治疗的患者（20例铂耐药患者和13例铂敏感患者）的中位存活期为7个月(40).

需要指出的是，之前报道的耐铂患者二线化疗的历史反应率（<8%）与我们研究中观察到的反应率（>60%）之间的巨大差异可能部分是由于在选择患者时引入的偏见造成的。需要进行进一步研究，以在对照临床试验中严格评估该治疗方案。重要的是，疫苗接种的临床反应与免疫反应相关。只有30%对疫苗接种没有p53特异性反应的患者对二线化疗有临床反应，而75%的p53细胞免疫应答者在疫苗接种后对化疗有客观的临床反应(P（P）= 0.08). 自第一次接种疫苗以来，所有患者的总生存期中位数为11.8个月，95%置信区间的下限为7.8个月。此外，38%的患者在第一次注射疫苗后1年内仍然存活。在大多数II期临床试验中，接受二线化疗的患者的中位生存期为～6个月，其中<20%的患者生存期超过1年(39). 这些数据支持接种疫苗可能对接受化疗的SCLC患者有益的假设。这些数据与最近在用致癌物激活剂细胞色素P450 1B1（CYP1B1）免疫的癌症患者中进行的意外观察结果一致。17名接种疫苗的患者中大多数进展顺利，11名没有对CYP1B1产生免疫力的患者中，除1名患者外，其余患者进展顺利，对抢救治疗无效。五名对CYP1B1产生免疫力的患者需要对进展性转移性疾病进行抢救治疗，并对下一个治疗方案表现出明显的反应，其中大多数持续时间超过1年(41). 在最近的另一项I期研究中，脑胶质瘤患者也获得了类似的结果(42).

化疗可能会减弱抗原特异性T细胞反应，因为开始化疗后p53免疫性显著降低。然而，显然这一时间框架足以产生积极的临床结果。似乎诱导抗p53细胞免疫与随后的化疗协同作用，以提供有效的全身抗肿瘤活性。有许多可能的机制可以解释观察到的效果。化疗可能下调肿瘤产生的免疫抑制因子的作用，这些免疫抑制因子阻止CTL杀伤肿瘤细胞，它可以上调肿瘤细胞中的p53，使其更容易被CTL识别，它可以通过上调穿孔素或颗粒酶的表达水平来激活CTL，或者颗粒酶的促凋亡作用与化疗可能在分子水平上协同作用。我们目前正在调查这些可能性。

近年来积累的临床前数据表明，癌症免疫治疗和化疗的结合可能会带来显著的益处(43). 在这里，我们提供了直接的临床证据来支持这一新兴的癌症免疫治疗范式。癌症疫苗可能不是作为一种单一的方式，而是与其他治疗方法，特别是化疗，紧密结合，才是最有效的。这一概念可能对新疫苗战略的进一步发展具有广泛的影响。