原发性转移性结直肠癌患者Ⅰ/Ⅱ期联合癌胚抗原衍生HLA-A2限制性CAP-1肽和伊立替康、5-氟尿嘧啶和白细胞介素的化学免疫治疗

尽管隐血筛查取得了进展(1)、结肠镜检查(2)，手术(三)、放射治疗和佐剂(4–6)化疗、结直肠癌仍是工业化国家男性癌症相关死亡率的第二大原因，女性癌症相关死亡率第三大原因。通过添加拓扑异构酶-I抑制剂和基于铂的细胞毒药物，姑息性化疗方案得到了改进。目前，大多数新诊断的转移性结直肠癌患者使用伊立替康或奥沙利铂联合大剂量5-氟尿嘧啶（5-FU）和亚叶酸钙治疗(7, 8). 然而，即使经过治疗，Unio Internationale Contra Cancrum IV期患者的平均总生存时间为15至20个月(9, 10).

在这种情况下，免疫治疗为化疗提供了一种潜在的补充方法，特别是在残留疾病最少和之前化疗有限的情况下，这些可能会对免疫反应性产生不利影响。由于疫苗接种策略的反应速度比细胞毒性化疗慢，因此高肿瘤负担可能会通过限制生存时间以及阻碍免疫系统和降低血液恶性肿瘤中报告的特异性T细胞功能来干扰疫苗接种策略(11). 然而，疫苗接种方法需要选择多种因素，如表位、抗原源（肽、肽库、蛋白质、载体、裂解肿瘤细胞和整个肿瘤细胞）、抗原呈递（树突状细胞、转染肿瘤细胞和CD40激活的B细胞）、佐剂、，给药途径（皮下注射、静脉注射、皮内注射）和疫苗接种计划。

本研究旨在回答肿瘤免疫领域的两个关键问题。由于许多转移性结直肠癌患者目前正在接受伊立替康/高剂量5-FU/亚叶酸钙化疗，本研究的第一个目的是确定伊立替康/高剂量5-FU/亚叶酸钙化学治疗时的同步免疫是否会产生可测量的免疫反应。通过这种方法，我们能够对既往化疗有限且表现良好的患者进行免疫接种。我们用病毒召回抗原监测化疗对细胞免疫系统的影响。作为免疫治疗靶点，我们选择了CAP-1，它是免疫显性MHCⅠ类HLA-A2限制性的癌胚抗原（CEA）的九聚体表位，CEA是一种180kDa蛋白，在90%以上的大肠肿瘤中表达(12). 用重组CEA疫苗免疫的患者产生了CAP-1特异性CTL株，能够杀死CEA表达的肿瘤细胞在体外(13). CAP-1以前曾成功用于CEA阳性癌症患者，以产生免疫反应(14).

本研究的第二个目的是以随机方式直接比较粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、带有非甲基化CpG基序的细菌DNA序列（CpG-ODN或dSLIM分子）和树突状细胞的免疫效果。最近的研究对GM-CSF、含有CpG-的dSLIM分子、白细胞介素-2（IL-2）和树突状细胞作为疫苗佐剂的相对效力存在争议(15–20). 此外，我们确定了这种联合方案的可行性和毒性。

患者。这是一项针对HLA-A2阳性原发性转移性结直肠癌患者的开放性前瞻性随机I/II期临床试验。该方案得到了机构审查委员会和德国药物管理局的批准。所有患者均签署知情同意书。纳入标准要求年龄在18至75岁之间，HLA-A2阳性，血清CEA升高（>5μg/L）和/或CEA阳性肿瘤，未经治疗的转移性疾病，辅助治疗后无化疗间隔至少6个月，Karnofsky指数>70%，预期寿命至少3个月，骨髓和肝功能充足，HIV和乙型和丙型肝炎阴性，无中枢神经系统转移，无免疫抑制剂药物，妊娠试验阴性。1999年12月至2001年5月，共有70例原发性转移性结直肠癌患者按照纳入标准进行了筛查。排除了53例患者，其中21例HLA-A2阴性，15例已接受转移性疾病的预治疗，1例年龄大于75岁，2例血清CEA正常，3名患者拒绝知情同意，2名患者患有肾功能损害，3名患者肿瘤进展迅速，需要立即化疗，2名没有可测量的病变，3名Karnofsky评分较低，1名患者组织学改变（非腺体）。17名患者符合条件并参与了该研究。他们的中位年龄为60岁（范围：32-75岁）；男性8例，女性9例；13例诊断为结肠癌，4例诊断为直肠癌。平均血清CEA水平为266±453μg/L。

研究设计。所有患者都接受了完整的临床检查，包括胸部和腹部/骨盆的CT扫描、心电图、超声心动图、肺功能测试以及实验室检查。在基线检查时和化疗免疫治疗三个周期后，患者进行了白细胞分离，以获得用于诊断和治疗目的的外周血单核细胞。根据WHO标准对毒性进行持续记录和分级。患者随机接受CAP-1、GM-CSF和IL-2或CAP-1、dSLIM和IL-1或CAP-1，以及IL-2单独治疗。此外，患者被随机分为接种或不接种CAP-1脉冲自体树突状细胞作为主要疫苗。在第一个化疗周期前2周和1周接种两次疫苗。交替进行三个周期，在无化疗间隔期间接种两次疫苗，暂停一周。第三个周期后，患者每周接种疫苗，直到病情进展。研究设计如所示图1.

化疗。患者服用80 mg/m²伊立替康，2000 mg/m²高剂量5-FU，500 mg/m²如前所述，服用亚叶酸三个周期（每六周服用一次）(21, 22)如果在治疗期间没有发生进展性疾病。

疫苗生产和管理。双干环免疫调节剂（dSLIM-30L1）是含有非甲基化CpG基序的共价闭合哑铃形DNA分子，由5′-CCTAGGGTTACCACCTCATTGGAAAACGTTCCGGGCGTTCAGGTGGTAAC-3′寡核苷酸（ODN）在类似于所述良好制造规范的条件下产生(20, 23). CAP-1肽（YLSGANLNL）也是在良好的生产实践条件下合成的。临床级molgramostim（GM-CSF）购自诺华制药股份有限公司（德国纽伦堡）。临床级白细胞介素（IL-2）购自Chiron GmbH（德国马尔堡）。疫苗制剂在无菌条件下混合，并在−80°C下冷冻。在给药前不久，疫苗在室温下解冻，并在上臂的改变部位进行皮下注射。根据随机化，第一种疫苗的平均含量为1×10⁷CAP-1–脉冲树突状细胞或50μg CAP-1与250μg dSLIM，或50μgCAP-1与50μg GM-CSF，或仅50μg CAP-1。第二次接种和所有后续接种均含有50μg CAP-1和1×10⁶IU IL-2和250μg dSLIM、50μg GM-CSF或无佐剂。

树突状细胞的生成和成熟。根据制造商的指南，使用CliniMACS设备（Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，德国）通过免疫磁性富集技术从白细胞分离材料中分离出CD14阳性细胞。纯化后的CD14细胞（纯度>97%）在含有谷氨酰胺I（德国卡尔斯鲁厄生命科技公司）的无血清CellGenix培养基（德国弗莱堡CellGenix）中培养，并加入800单位/mL GM-CSF和500单位/mL IL-4（德国威斯巴登R&D Systems GmbH）。在第3天和第6天，添加50%含有细胞因子的新鲜培养基。第6天通过Ficoll离心分离细胞，将其从死亡细胞中清除。第7天，将细胞转移到含有谷氨酰胺I、800单位/mL GM-CSF、500单位/mL IL-4、1μg/mL前列腺素E2（Sigma-Aldrich，Deisenhofen，德国）、20 ng/mL肿瘤坏死因子（Sigma Aldrich）、1000单位/mL IL-6（研发系统）和10μg/mL抗CD40抗体（BD Biosciences，德国汉堡）的培养基中。在第10天采集、清洗成熟的树突状细胞，并通过流式细胞仪进行表征。将树突状细胞与50μg CAP-1肽在500μL 0.9%NaCl中在37°C下孵育2小时。然后，清洗树突状细胞，并将其重新悬浮在1mL 0.9%NaCl溶液中进行皮下注射。

临床反应评估。患者在每一周期的化学免疫治疗后重新开始治疗，并通过累及部位的计算机断层扫描和广泛的实验室检查评估完全治疗后的反应。每月监测患者血清CEA水平，以评估化疗结束后和每周接种疫苗时免疫治疗的临床疗效。完全缓解（CR）定义为所有肿瘤征象消失，部分缓解（PR）定义为全部病灶直径缩小至少30%，进展性疾病定义为直径增加至少20%或出现新病灶。如果不符合PR或进展性疾病标准，则为稳定疾病。

免疫评估。最先进的免疫评估(24)包括对所有样本进行MHC I类四聚体分析和细胞内细胞因子分析。根据Dana-Farber癌症研究所免疫评估实验室标准操作程序进行检测，该操作程序是通过深入研究和测试制定的。对所有涉及的试剂和机器进行日常质量评估和质量控制。在进行分析之前，通过Ficoll离心分离白细胞分离外周血单个核细胞，并在液氮中冷冻。如果是进行性疾病，在最后一次治疗后从患者身上抽取50毫升血液，而不是进行白细胞分离。通过流式细胞术对细胞进行单核细胞、T细胞和B细胞标记物（CD14、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD45、CD45RA和CD45R0）的表型评估。多肽在体外使用从新英格兰肽（马萨诸塞州加德纳）购买。

流式细胞术。在五色流式细胞仪（佛罗里达州迈阿密Beckman-Coulter FC500）上进行无补偿数字采集。使用FlowJo for Macintosh软件4.3版（Treestar、Ashland、OR）对数据进行补偿和分析。

MHC I类四聚体分析。如前所述，生物素化HLA-A2单体与不同肽和β2-微球蛋白联合合成(25). 单体用链霉亲和素藻红蛋白（Molecular Probes，Eugene，OR）进行多聚。外周血单个核细胞，2×10⁶至4×10⁶用2μg四聚体和抗CD27 FITC、抗CD45RA ECD、抗CD8 PC7、抗CD4 PC5、抗CD14 PC5和抗CD19 PC5（所有抗体均来自Beckman-Coulter）染色。使用CAP-1四聚体定量疫苗特异性CD8+T细胞。人T细胞淋巴营养病毒Ⅰ型TAX（LLFGYPVYV）四聚体作为阴性对照。为了评估回忆抗原特异性记忆CTL，用巨细胞病毒（CMV）pp65（NLVPMVATV）和EBV BMLF-1（GLCTLVAML）四聚体对外周血单个核细胞进行染色。细胞在淋巴细胞群CD4/CD14/CD19阴性细胞（如前所述的“bin gate”；参考文献。24)和CD8。根据对12名HLA-A2阳性健康志愿者外周血单个核细胞染色的定义，CAP-1特异性CTL的检测限为0.02%。

IFN-γ细胞内细胞因子测定。解冻后的外周血单个核细胞在37°C和5%CO下培养1小时，以10μg/mL CAP-1肽、10μg/mL HIV RT-POL（ILKEPVHGV）作为阴性对照，或2μg/mL葡萄球菌肠毒素B作为阳性对照。为了阻止细胞因子的分泌，添加了10μg/mL布雷费尔丁A（西格玛，密苏里州圣路易斯）。细胞在37°C和5%CO下培养5小时₂然后，在室温下用上述CAP-1四聚体对细胞染色20分钟，然后固定并渗透。为了检测细胞内细胞因子，细胞在室温下用抗IFN-γFITC（BD Biosciences）、抗CD69 ECD、抗CD4/14/19和抗CD8 PC7（Beckman-Coulter）染色20分钟，并用流式细胞术进行分析。

体外肽刺激T细胞。为了扩增CAP-1特异性T细胞，将解冻的外周血单核细胞与1μg/mL的CAP-1肽在96孔板（2×10⁶细胞/mL），在37°C和5%CO条件下，加入20 IU/mL IL-2（Chiron Corp.，Emeryville，CA）₂持续8天。在第4天刷新IL-2（20 IU/mL）。通过上述四聚体染色和细胞内细胞因子分析进一步对细胞进行表型和功能分析。

生成CAP-1特异性T细胞系。用患者和健康献血者外周血单个核细胞产生的CD40激活的B细胞刺激自体CD8+T细胞(26). 在第0天在10ng/mL IL-7（Endogen，Inc.，Woburn，MA）和第1天和第4天在20IU/mL IL-2存在下，在24孔板中的T细胞培养基中培养CTL。每周用照射过的1μg/mL CAP-1脉冲CD40活化的B细胞重新刺激T细胞。用CAP-1四聚体反复测试细胞的特异性CTL。如前所述，使用铕释放试验进行功能分析(27).

统计。所有统计测试均使用统计软件SPSS V11.0 for Windows（SPSS，Inc.，芝加哥，IL）进行。学生的t吨该测试用于计算治疗前后CAP-1特异性CD8+细胞频率的差异。同样的试验分别用于一个和三个化疗周期前后回忆抗原CD8+细胞频率的变化。采用Kaplan-Meier分析计算进展时间和总生存率。采用对数秩检验计算治疗组之间的生存差异。可能性(P（P）值）小于0.05（低于5%）被视为具有统计学意义。

17名患者（13名结肠癌和4名直肠癌）被纳入本试验。12名患者接受了计划的三个周期的化学免疫治疗，2名患者只接受了一个周期（6次伊立替康/5-FU/亚叶酸），3名患者在第一个周期结束前因疾病进展而停药。17名患者中有2名随机接受CAP-1、GM-CSF和IL-2治疗；6名患者接受CAP-1、dSLIM和IL-2治疗；5名患者仅接受CAP-1和IL-2治疗。在首次接种期间，向四名患者接种CAP-1脉冲树突状细胞，其中三名患者在连续接种中接受了CAP-1、dSLIM和IL-2，另一名患者随机接受CAP-1、GM-CSF和IL-2。17名患者接受治疗后，该研究中止，因为很明显，这两种佐剂在诱导高CAP-1特异性免疫反应方面都没有优势，并且已经获得足够的数据来分析该研究的其他目标。

化疗总体耐受性良好。没有因血液计数、恶心/呕吐或疼痛而延迟治疗。世卫组织3级腹泻发生在4例不需要住院治疗的病例中。接种疫苗在6例注射部位引起轻微的局部反应（肿胀、硬化或红斑）。一名患者报告出现短暂寒战，体温轻微升高（38°C），几小时内症状消失。

对组合模式的临床反应。17例患者中有5例（29%）达到CR（1例肝转移切除治愈，2例腹膜转移疾病），1例（6%）达到PR，5例（29.%）患者病情稳定，总有效率为35%（CR+PR）。6名（36%）患者出现进展性疾病，其中5名在第一个周期，1名在第三个周期结束时。

在没有任何佐剂的情况下接受治疗的五名患者中，一名患者实现了CR，一名病情稳定，三名患者病情进展（有效率1/5；20%）。在接受CAP-1脉冲树突状细胞治疗的四名患者中，一名患者获得CR，一名病情稳定，两名患者病情进展。由13名未接种树突状细胞疫苗的患者组成的组显示出四种CR、一种PR、四种稳定疾病和四种进行性疾病。在有三名患者的GM-CSF组中，发生了一例PR和两例进行性疾病。dSLIM疫苗(n个=9）显示四种CR，四种稳定疾病，只有一种进行性疾病（有效率4/9；44%）有效率。接受dSLIM患者的比较(n个= 9; 有效率44.4%）(n个= 8; 有效率25%）表明对dSLIM治疗有良好的反应，尽管这些数字太小而无法进行统计分析。

在中位观察时间为29个月（范围：22-34个月）后，17名患者中有11名因疾病死亡，5名患者复发。一名患者仍无疾病。他患有IV期癌症，血清CEA升高，并在开始治疗前进行了两个肝转移瘤的根治性切除。复发/进展患者的中位进展时间为8个月（范围：1-15个月），中位生存期为17个月（区间：2-34个月）。log-rank检验未发现树突状细胞/非树突状上皮细胞组和佐剂/无佐剂组之间在进展时间或存活时间方面存在任何统计显著性差异（数据未显示）。表1总结患者特征和临床结果。

免疫治疗的临床反应。在这三个周期中，由于疫苗接种和化疗同时进行，因此不可能区分治疗方式的临床效果。化疗结束后，接种疫苗是患者唯一的治疗方法。因此，可以评估免疫治疗的临床反应。在完成三个周期的12名患者中，除一名患者外，所有患者的血清CEA水平均在化疗终止后1个月内升高。血清CEA水平下降的患者接受了治疗性肝转移切除术。他CAP-1特异性CTL显著增加。图2显示了所有可评估患者的血清CEA病程。

肽/MHC I类四聚体。肽/MHCⅠ类四聚体用于检测CAP-1特异性CD8+T细胞，这些细胞在解冻后或一周后进行分析在体外CAP-1刺激可提高敏感性。在基线检查时，在8名患者（47%；CD8+特异性频率：0.045±0.035%）和11名患者（65%）的未刺激样本中观察到CAP-1特异性CD8+细胞在体外刺激（0.110±0.085%）。在4名患者（24%；0.045±0.024%至0.171±0.077%；P（P）> 0.05). 之后在体外CAP-1肽刺激后，8例（48%）患者的特异性CD8+从接种前到接种后显著增加（0.058±0.031%到0.204±0.139%；P（P）= 0.04). 应答者包括四名接受CAP-1/dSLIM/IL-2作为佐剂的患者，一名接受CAP-1/GM-CSF/IL-2治疗的患者，以及三名仅接受CAP-1和IL-2治疗的患者（均为第一周期内的进展性疾病）。八名患者中有两名在第一次疫苗中接种了树突状细胞。图3显示了两名患者接种疫苗治疗后CAP-1特异性CD8+细胞增加的例子。

IFN-γ细胞内细胞因子测定。样品在解冻后处理，并在1周后处理CAP-1肽在体外刺激以提高该分析的灵敏度。基线时，两名患者的T细胞（12%；CD8+特异性频率：0.27±0.03%）对CAP-1肽的IFN-γ分泌增加，三名患者（18%；CD8++频率：0.39±0.19）在体外刺激。在两个未经刺激的患者样本中检测到CAP-1从流行到接种后的免疫应答（12%；从0.00到0.03±0.003；P（P）>0.05）和四个受刺激患者样本（24%；0.00±0.00至0.27±0.15；P（P）= 0.05). 在应答者中，有两名患者接种了CAP-1/dSLIM/IL-2，一名患者接种CAP-1/GM-CSF/IL-2（完成三个周期），另一名患者注射了CAP-1/IL-2（未完成）。一名患者在第一批疫苗中接种了树突状细胞。四聚体分析结果与IFN-γ细胞内细胞因子分析结果无相关性。表2总结免疫学结果。

化疗对T细胞的影响。通过CD3+/CD4+和CD3+/CD8+频率以及治疗前后对病毒召回抗原的反应，评估伊立替康/大剂量5-FU/亚叶酸三个周期对细胞免疫的细胞毒作用。此外，对因进展性疾病仅接受一个周期治疗的患者的外周血单个核细胞进行评估。12名患者完成了所有三个周期。他们的平均CD4+和CD8+细胞频率不受化疗的影响（基线时：45±14%和26±13%；治疗完成后：43±14%和26±11%）。五名仅接受一个或更少周期化疗的患者显示出相似的平均频率（基线时CD4+和CD8+分别为41±18%和21±5%；接种疫苗后分别为43±19%和23±16%）。在基线检查和治疗后评估所有患者的CMV pp65和EBV BMLF-1特异性CD8+细胞频率。除一名患者外，所有患者对召回抗原都有可检测到的CD8+反应。基线时平均召回抗原CD8+频率为0.64±0.70%，与12名健康献血者（0.61±0.89%）相似。接受三个周期治疗的患者(n个=12）显示召回抗原CD8+频率平均从0.65±0.68%下降到0.47±0.51%，具有统计学意义(P（P）= 0.017). 如果基线值设置为100%，则召回抗原特异性CD8+细胞平均减少14%。相比之下，五名接受一个周期（6周）或更少疗程治疗的患者的回忆抗原CD8+从0.62±0.73%增加到1.81±2.14%。如果基线频率设置为100%，则平均增加310%。由于数量较少，这些结果在统计上并不显著。每组四名患者的召回抗原四聚体结果如所示图4.

生成CAP-1特异性T细胞系。在七个不同的供体（患者和健康对照）中，用CD40激活的B细胞多次刺激后，无法生成CAP-1特异性T细胞系（>1%特异性）。在六名患者中，有三名患者的最高频率为0.5%的特异性CD8+细胞。然而，当CAP-1被异源肽CAP1-6D取代时，肽刺激在一名健康供体中产生了一种特定的T细胞系(图5).

对于原发性转移性结直肠癌患者，基于疫苗的免疫治疗与伊立替康/大剂量5-FU/亚叶酸联合化疗是一种可行的联合方案。副作用耐受性良好，可按计划进行治疗。

联合方案的临床总有效率为35%。只有一名患者在化疗结束后CEA水平持续下降，这表明在其他患者的第三个周期后，疫苗接种策略没有临床效果。然而，不能排除在联合治疗的前5个月内接种疫苗会产生暂时影响。

众所周知，在化疗期间，健康人对病毒疫苗的免疫反应低于预期(28). 因此，本试验的一个重要目的是确定伊立替康/大剂量5-FU/亚叶酸钙化疗方案是否对记忆CTL储备产生不利影响。我们的数据清楚地表明，伊立替康/高剂量5-FU/亚叶酸三个周期可将EBV或CMV特异性CTL的相对数量平均减少14%，而不会影响CD8+细胞的绝对计数。化疗可能会消除抗原特异性记忆CTL，这些CTL的恢复速度不如其他CD8+亚群快。一个有趣的观察结果是伊立替康/高剂量5-FU/亚叶酸钙的0.5到1个周期增加回忆抗原特异性CTL频率，尽管由于患者人数较少，这在统计学上并不显著。我们推测，短时间服用伊立替康/高剂量5-FU/亚叶酸钙化疗可阻断调节免疫机制，如CD4+/CD25+T细胞，从而增加抗原特异性反应。最近在小鼠身上的观察结果支持了这一点，小鼠接受了化疗调节疫苗的治疗(29). 环磷酰胺和阿霉素可以通过消除CD4+/CD25+T细胞对CTL的抑制来增强肿瘤特异性CTL反应。

我们的四聚体结果表明，CEA对大多数患者来说不是新抗原。Nagorsen等人(30)据报道，三分之一的HLA-A2阳性结直肠癌患者通过IFNγELIspot对CAP-1肽表现出T细胞反应。尽管这些细胞可以通过高度敏感的方法检测出来，但它们对肿瘤控制仍然无效。近50%的患者对疫苗接种表现出免疫反应（CAP-1特异性CTL增加）。术后24%的患者的T细胞中观察到IFNγ分泌在体外刺激，这低于四聚体分析的结果。这可能是由于无功能T细胞或干扰素γ细胞内细胞因子测定的敏感性较低所致，此前已有报道(24, 31).

我们没有发现佐剂之间（CAP-1/GM-CSF/IL-2与CAP-1/dSLIM/IL-2与CAP-1/IL-2）或使用有或没有树突状细胞的初级疫苗之间的免疫反应有任何显著差异。因此，我们在17名登记患者后停止了试验。尽管我们的试验的免疫反应看起来令人信服（50%的患者CAP-1四聚体阳性CTL增加），但临床疗效并不令人信服。不幸的是，在许多肿瘤疫苗接种研究中都观察到了这一点(14, 29, 32). 在我们和其他的I/II期研究中，我们正在尝试免疫一个已经“感染”的宿主，该宿主被数十亿破坏性肿瘤细胞的指数增长所淹没。这与针对现有传染病的疫苗不起作用。为了打破T细胞对肿瘤的无知，有必要阐明有关最佳疫苗制备、时间和时间表、剂量和佐剂的问题。我们推测，如果我们不能达到与抗病毒抗原相比的肿瘤抗原特异性CTL频率，我们将不会在肿瘤患者中获得一致的临床反应。可能需要增加肽和/或佐剂的剂量。然而，GM-CSF作为佐剂的作用仍然存在争议(15, 16, 18)，具有非甲基化CpG基序的DNA分子（CpG-ODN或dSLIM）是临床前免疫学研究的潜在候选分子(17, 19, 20, 33, 34). 这是首批在癌症患者中使用CpG ODN/dSLIM作为佐剂的研究之一。基于二磷酸酯的dSLIM耐受性良好，在250μg剂量下不会引起任何系统性副作用。

CAP-1以前曾用于其他疫苗接种试验。在第一阶段的研究中，Morse等人(14)用CAP-1脉冲的树突状细胞为21名HLA-A2和CEA阳性癌症患者接种疫苗。患者分为三个剂量递增组（1×10⁷, 3 × 10⁷、和1×10⁸树突状细胞，静脉注射）每周或每两周一次，最多免疫四次。未观察到重大毒性。两名患者出现临床反应（一名轻微疾病和一名稳定疾病）；其他人都患有进行性疾病。免疫反应通过皮肤延迟型超敏反应测量进行测量。两名患者对CEA有新的延迟型超敏反应。五名患者在治疗前表现出CEA延迟型超敏反应，证实了我们的结果，即CEA在许多癌症患者中不是新抗原。

我们开始试验后，合成了CAP1-6D，它是CAP-1的一种异源肽，据报道可将CTL的致敏性提高100到1000倍(35, 36). Fong等人(37)在全身给予Flt3配体后分离外周树突状细胞，用CAP1-6D脉冲细胞，并将疫苗给予12名血清CEA异常的结肠癌和非小细胞肺癌患者。两名患者的肿瘤消退，一名患者出现了混合反应。通过四聚体分析评估，7名患者出现CAP1-6D特异性CTL。与反应较弱的患者相比，患者的特定CTL频率超过1%。这可能是由于CAP1-6D的效力更高。

综上所述，化学免疫疗法是一种可行且安全的联合治疗方法，具有临床和免疫学疗效。这两种佐剂都没有提供优越的CTL免疫应答，尽管数量太少，无法进行统计分析。此外，与单独的肽/佐剂相比，在初级疫苗中使用肽脉冲树突细胞并不能增强对CAP-1的免疫力。伊立替康/大剂量5-FU/亚叶酸化疗仅轻微影响抗原特异性CTL。此外，我们的数据表明，有限的化疗可以增强特异性CTL反应，并提高未来疫苗接种策略的效力。

我们感谢Nicole Severing在处理白血病分离材料和HLA分型方面的大力支持，感谢医学博士Wanyong Zeng的技术支持，以及医学博士Thomas Zander的富有成果的讨论。