LDH-A和谷氨酰胺酶抑制作用的评价在体内通过超极化¹³肿瘤的C-丙酮酸磁共振波谱

许多癌细胞的特点是葡萄糖摄取率高，乳酸生成量高。癌基因和抑癌基因与癌症代谢的致癌改变和糖代谢增加直接相关(1–3). 葡萄糖代谢由葡萄糖转运蛋白和己糖激酶启动，导致葡萄糖通过细胞内磷酸化被捕获。6-碳葡萄糖分子进一步分解为3-碳丙酮酸，通过转氨作用转化为丙氨酸，并通过丙酮酸脱氢酶转化为乙酰-CoA，以在三羧酸（TCA）循环中氧化，或通过乳酸脱氢酶-A（LDH-A）转化为乳酸。糖酵解增加有许多相关的后遗症，包括酸的产生和葡萄糖衍生的碳转移到合成代谢过程。除糖酵解外，谷氨酰胺水解（谷氨酰胺酶将谷氨酰胺转化为谷氨酸，在TCA循环中进行氧化）为生长细胞提供了主要的氮和碳源。谷氨酰胺骨架对天冬氨酸和其他氨基酸的生产也至关重要。

四聚体LDH-A酶在动力学上有利于丙酮酸转化为乳酸，这是Warburg效应的标志，因此是一个有吸引力的治疗靶点。人类癌症中记录的高水平LDH-a突出了其作为靶点的吸引力(4). 我们最近观察到，用一种小的药物样分子FX11抑制LDH-A可以抑制淋巴瘤和胰腺肿瘤的生长，但需要注意的是，可能存在非靶向效应体内(5). 我们进一步证明，谷氨酰胺酶的变构抑制剂双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-二硫唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）也可以延缓淋巴瘤异种移植物的生长(6). 因此，癌症代谢作为一个成熟的领域，有望成为新的治疗药物。目前，临床上检测代谢的能力主要局限于¹⁸肿瘤葡萄糖摄取的F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层成像(7). 尤其是，¹⁸谷氨酰胺代谢的F-标记示踪剂正在开发中(8). 尽管PET成像具有很高的灵敏度，但它无法动态测量代谢转化，因此通常仅限于静态测量组织积聚。

¹³核磁共振波谱（MRS）长期以来一直用于静态代谢过程的研究体内(9). 最近，随着动态核极化（DNP）技术的出现，¹³C-MRS和成像可以测量代谢转化的动力学体内(10). DNP（“超极化”）会增加¹³C-MRS灵敏度为10000倍或更高，允许检测¹³实时C标记化合物及其下游代谢产物体内(10–12). 在DNP中，电子自旋的大极化被转移到核自旋，增强了后续核磁共振（NMR）光谱和成像的信号强度。超极化通量交换¹³丙酮酸盐和乳酸盐之间的C标记由以下因素的组合决定：肿瘤灌注、丙酮酸盐的膜转运、内源性乳酸盐浓度和LDH活性(13–14). DNP的主要缺点是自旋常数弛豫时间短（T₁)这会导致极化衰减。值得注意的是，T₁第页，共[1]页-¹³C] 丙酮酸大约30到40秒体内，这足以测量代谢相互转化。信号的可观察时间是T1的5倍，这意味着注射后约2至3分钟内可以看到丙酮酸信号。核磁共振信号的几个数量级增强，结合长T₁弛豫时间使其成为超极化示踪剂的一种有前途的技术，在医学成像中具有潜在的应用。

在本研究中，我们报告说¹³C MRS可以评估丙酮酸对乳酸的代谢转化，从而评估体内LDH-a抑制剂（FX11）在癌症治疗中的疗效。我们监测了超极化[1的动态转换-¹³C] -丙酮酸对乳酸的转化，检测肿瘤对FX11治疗的反应，目的是抑制LDH-A。用BPTES抑制谷氨酰胺酶，也可以抑制肿瘤生长，不影响丙酮酸转化为乳酸，与二甲基亚砜（DMSO）载体对照治疗的肿瘤相当。然而，BPTES确实减少了[1-¹³C] -丙酮酸盐转化为丙氨酸，这在这些动态扫描中也可以观察到。FX11对丙酮酸到丙氨酸的转化没有显著影响。我们的研究首次确立了超极化[1-¹³C] -丙酮酸，以区分肿瘤对LDH-A和谷氨酰胺酶抑制的反应，与载体对照组相比。

所有动物实验均按照美国国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（马里兰州贝塞斯达）进行，并得到南佛罗里达大学（佛罗里达州坦帕）动物护理与使用机构委员会的批准，该委员会负责管理莫菲特癌症中心（佛罗里达州坦帕）的动物护理和应用。为了生成异种移植模型，2.0×10⁷如前所述，将P493人淋巴瘤B细胞皮下注射到男性严重联合免疫缺陷小鼠（马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所）中(5). 当肿瘤体积达到约700毫米时^三（在3-4周内），每天通过腹腔注射给小鼠注射2%（v/v）二甲基亚砜或42μg FX11（2.1 mg/kg体重）和200μg（10 mg/kg重量）BPTES，以监测治疗反应。肿瘤体积的计算公式如下：[长度（mm）×宽度（mm）x宽度（mm”）×0.52]。

为小鼠做准备¹³C-MRS研究显示，通过手术植入颈静脉导管以促进注射。MRS实验使用颈静脉而非尾静脉，因为颈静脉可容纳更大的注射量（与0.2 mL相比高达0.5 mL），同一动物的尾静脉多次注射与高失败率相关。颈静脉插管允许在一周内多次注射用于治疗反应研究。肿瘤接受FX11或BPTES治疗7天，而对照组接受DMSO治疗。¹³C-MRS的收购持续了一周，每24小时进行一次。

在磁共振成像（MRI）/MRS研究中，在塑料麻醉室中用异氟烷诱导小鼠进行清除。一旦失去意识，他们被放置在MRI线圈内的老鼠专用支架中，配备有老鼠专用的鼻锥吸入剂麻醉和清除系统，用于成像。该系统还包括一个呼吸监测垫、一个直肠内光纤温度监测探头和一个加热垫，用于将核心体温维持在37°C。

实验使用30μL[1-¹³C] -标记丙酮酸（剑桥同位素实验室；http://www.isotope.com)含15 mmol/L三烷基自由基OX63（GE Healthcare），Gd²⁺-dotarem（Guerbet；http://www.guerbet-us.com)在1.4 K和3.35 T场强下，使用牛津仪器DNP偏振器（HyperSense）在94.082 GHz微波下超极化1小时。在通过颈静脉导管注射到小鼠体内之前，极化底物在37°C下迅速溶解在Tris/ETDA和NaOH中，在生理pH下产生80 mmol/L丙酮酸¹³C-MRS扫描，在12至15秒的时间内注射350μL超极化丙酮酸。注射后立即进行100μL生理盐水冲洗，以清除管道中的丙酮酸溶液。

全部¹³C谱是用一块7T，31cm的水平孔磁铁（安捷伦）和一块35mm的双调谐磁铁获得的¹H（H）-¹³C卷线圈（M2M；http://www.m2mimaging.com). 通过T获取解剖参考图像以确定异种移植瘤的位置和大小₂-加权FSE（快速自旋回波）多层（T_对=4秒，TE=60 ms，回波序列长度=8，矩阵128×128，层厚=1 mm，15层）。体内在注射丙酮酸之前立即开始数据采集，重复时间为（T_对)在150秒的时间内从以斜角取向的6mm厚的肿瘤切片中获取1秒和9°的翻转角和单个瞬态光谱，以获取来自肿瘤的信号。

报告的数值为平均值±标准偏差。使用2个样本评估对照组和治疗组之间的统计显著性t吨假设方差不相等的检验。使用配对2样本评估显著差异t吨方法测试。统计显著性在P（P）<0.05级。

超极化[1的转化-¹³C] 用MRS监测丙酮酸对乳酸的反应，以评估人类P493 B细胞淋巴瘤异种移植物对LDH-A抑制剂FX11或谷氨酰胺酶抑制剂BPTES的反应。建立肿瘤异种移植物，通过腹腔注射DMSO载体或药物治疗动物。图1A和B显示相关代谢途径和¹³丙酮酸超极化注射后，分别从肿瘤上6 mm厚的切片上获得C-MR谱。它显示了丙酮酸的显著峰值（171 ppm）、LDH转化为乳酸（183 ppm）以及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（GPT）转化为丙氨酸（176 ppm）。丙酮酸水合物（179 ppm）在溶液中以非酶方式形成，并与脱水丙酮酸平衡。图1C显示了DMSO处理小鼠（对照组）在100秒的总采集时间内从6mm肿瘤切片中采集的连续动态光谱，说明肿瘤中丙酮酸转化为乳酸的能力较强。FX11治疗6天后，肿瘤中丙酮酸到乳酸的转化通量显著降低(图1D). 由于T，信号整体衰减₁超极化基底的弛豫。图2A和B记录DMSO处理和FX11处理小鼠4天内乳酸和丙酮酸（Lac/Pyr）峰值强度随时间的变化。在FX11治疗的肿瘤中，乳酸流量明显减少。本研究将肿瘤乳酸和丙酮酸的流量比作为药物治疗反应的标志。Lac/Pyr通量比是根据动态扫描代谢谱的曲线下面积（被视为“无模型”方法）计算的。比较FX11治疗肿瘤和DMSO治疗肿瘤在不同治疗日的Lac/Pyr通量比值，以评估治疗反应。在DMSO处理的动物中，Lac/Pyr比率随着时间的推移而增加，而在FX11处理组中则逐渐降低(P（P）<0.01），确认FX11药物反应(图2C). 我们还计算了转化率常数(k个_第页=丙酮酸-乳酸和k个_L（左）=乳酸-丙酮酸），使用双位点交换模型(14). 速率常数之比(k个_第页/k个_L（左）)FX11治疗减少，DMSO治疗肿瘤增加（表1）。在治疗时间窗内使用T₂-加权核磁共振成像。尽管在所有组中都有轻微的肿瘤生长(图2D)，各组间肿瘤体积无显著差异。

测试超极化的特异性[1-¹³C] -丙酮酸在LDH-A抑制评估中的作用体内，我们使用了谷氨酰胺酶抑制剂BPTES，之前已经观察到它可以减少P493肿瘤异种移植物的生长(6). BPTES不影响体内如图所示，将丙酮酸到乳酸的转化率以及Lac/Pyr比率与DMSO处理的对照进行比较图2C.BPTES抑制肿瘤细胞中谷氨酰胺转化为谷氨酸(15). 因为生成的谷氨酸是GPT将丙酮酸转氨为丙氨酸的底物(图1A)，我们试图确定超极化[1-¹³C] -丙酮酸盐转化为丙氨酸可能会因BPTES而减少。在这方面，与对照组相比，经BPTES治疗的动物丙酮酸到丙氨酸的转化率降低(图3A-D).图4A说明了重要性(P（P）<0.001）在重复实验中，BPTES降低丙氨酸-丙酮酸（Ala/Pyr）通量比。然而，Ala/Pyr通量比并不显著(P（P）=0.112）减少FX11(图4B). 这些数据代表了丙酮酸-丙氨酸转换通量比的首次使用，并记录了BPTES的影响体内.

对癌症代谢的兴趣重新抬头，增加了针对癌症特定代谢途径的期望。随着测量肿瘤代谢的新工具的出现，分子代谢成像技术取得了进展就地因此，我们试图证明超极化[1-¹³C] -丙酮酸盐MRS可作为淋巴瘤肿瘤异种移植物中LDH和/或谷氨酰胺酶抑制治疗反应的成像生物标志物。尤其是，¹³C-MRS成像不涉及电离辐射，因为它是一种多光谱模式，所以它能够同时检测各种底物的代谢通量(16). 超极化的转换¹³C-标记丙酮酸转化为乳酸或丙氨酸为直接评估LDH和间接评估谷氨酰胺酶活性提供了一种无创方法体内在同一收购中。

在这项研究中，我们记录到P493淋巴瘤异种移植物显示高水平的天然¹³C-丙酮酸到乳酸的转化，与先前对小鼠淋巴瘤异种移植和其他肿瘤模型的研究结果一致(14, 17–19). LDH-A抑制剂FX11（而非谷氨酰胺酶抑制剂BPTES）降低了¹³丙酮酸转化为乳酸，表明¹³丙酮酸到乳酸的转化可以作为LDH-a抑制的生物标志物。然而，这可能是一个普遍的反应性生物标志物，因为小鼠淋巴瘤对依托泊甙的反应也观察到丙酮酸-乳酸转换降低，显然是通过不同的机制(14). 据报道，足叶乙甙可诱导细胞凋亡和坏死，导致PARP介导的辅酶NADH库耗竭，从而降低通过LDH的表观丙酮酸-乳酸流量(14). MR波谱中的稳态乳酸水平在肉瘤（RIF-1）和乳腺癌小鼠模型（EMT6；参考文献。20). 在目前的研究中，FX11反应的特异性被证实为BPTES对丙酮酸-乳酸转化缺乏影响。然而，虽然我们的研究显示FX11与BPTES对Lac/Pyr通量比有选择性的改变，但这些其他研究对导致治疗后乳酸生成改变的其他机制提出了警告。虽然观察到BPTES不影响丙酮酸转化为乳酸，但观察到它会降低丙酮酸向丙氨酸的转化，如图3A-D可能是通过剥夺谷氨酸池。本文件首次记录了Ala/Pyr通量比用于监测谷氨酰胺酶抑制的潜在用途体内试验。

超极化的当前使用¹³C-丙酮酸盐MR在肿瘤异种移植研究中的应用体内已经证明，这种技术能够在疾病的整个过程中连续检测活动物及其对不同疗法的反应。这项工作显示了超极化的潜力¹³C-MRS跟踪代谢途径流量体内，非侵入性，特别是监测和了解代谢靶向癌症疗法，这些疗法可能在未来几年出现在临床上。

这项研究记录了LDH-A抑制剂治疗淋巴瘤的代谢后果，可以通过监测丙酮酸到乳酸的转化减少来检测体内使用超极化¹³C-MRS。它还首次记录了丙酮酸-丙氨酸转换作为谷氨酰胺酶抑制的药效学标记物的使用。我们的结果表明，使用¹³超极化丙酮酸C-MRS是一种很有前途的技术，可以潜在地检测靶向细胞信号和代谢的各种新兴疗法的分子效应，从而提供一种无辐射的方法来纵向评估肿瘤反应。

没有披露潜在的利益冲突。

概念和设计：P.Dutta、A.Le、C.V.Dang、R.J.Gillies

方法开发：P.Dutta、G.V.Martinez、C.V.Dang、R.J.Gillies

数据采集（提供的动物、采集和管理的患者、提供的设施等）：P.Dutta、A.Le、G.V.Martinez

数据分析和解释（例如统计分析、生物统计学、计算分析）：P.Dutta、A.Le、G.V.Martinez、C.V.Dang、R.J.Gillies

撰写、审查和/或修订手稿：P.Dutta、A.Le、T.Tsukamoto、G.V.Martinez、C.V.Dang、R.J.Gillies

行政、技术或物质支持（即报告或组织数据、构建数据库）：A.Le、T.Tsukamoto、R.J.Gillies

研究监督：R.J.吉利斯

提供本研究所需的研究化学品FX11：D.L.范德贾格特

这项工作得到了Wayne Huizinga Trust、R01 CA077575（R.J.Gillies）、R01 CA 057341、白血病和淋巴瘤学会转化研究拨款636311、R21 NS074151（T.Tsukamoto）和Sol Goldman胰腺癌研究基金80028595、Lustgarten基金90049125和R21CA169757（A.Le）的支持。C.V.Dang得到了娱乐业基金会项目“挺身而出抗癌梦想团队转化拨款”的支持。