分子靶类预测体外响应配置文件

针对癌症治疗的靶向治疗的不断发展和使用反映了人们对关键致癌途径以及这些途径的靶向扰动如何对应临床反应的认识不断加深。预测靶向治疗疗效的困难可能是由于对通路解除调控的因果机制（例如激活突变和扩增）的全球知识有限。肿瘤治疗的临床前转化研究侧重于确定哪些肿瘤类型和基因型最有可能从治疗中获益。治疗选定的患者群体可能有助于最大限度地发挥治疗的潜力。临床前肿瘤反应谱（即那些具有最大疗效的肿瘤细胞）成功过渡到随后的临床发展，现在已经确立。现在，许多特定的分子标记物被用于识别最有可能在临床环境中受益的患者。例如，在体外，伊马替尼通过激活的BCR-ABL基因融合选择性杀伤细胞(1)而拉帕替尼优先抑制ERBB2过度表达细胞的增殖(2). 两者都取得了商业上的成功，使携带这些基因畸变的肿瘤患者受益。虽然抑制激活的致癌途径（通常通过突变/扩增）被认为是大多数新型癌症治疗的主要作用机制，但不同靶点的化合物选择性的多样性掩盖了化合物靶点活性与癌细胞疗效之间的逻辑联系。例如在体外对38种独特激酶抑制剂的激酶抑制谱的评估表明，即使是同一分子靶“类”的激酶抑制剂，其选择性也存在很大差异(三). 在临床反应的背景下，单个分子抑制多激酶的后果是复杂的，并且了解得很少。此外，对与主要治疗靶点无关的多种激酶的抑制可能揭示肿瘤之间细胞反应模式的意外关系。这可能是由于存在比以前认为更多的致癌途径，这是每个肿瘤独特的基因组图谱的结果。例如，对乳腺癌和结肠癌的体细胞突变进行全面扫描表明，每个肿瘤平均有90个核苷酸变化，其中约10%被预测与功能相关(4). 所有功能显著的躯体畸变都可能在一定程度上影响治疗反应。

尽管每个肿瘤中基因损伤的特定“特征”可能导致对治疗药物的独特但可预测的细胞反应谱，但迄今为止，很少有人研究不同治疗药物之间的癌细胞反应模式。有一些迹象表明，可能存在可预测的模式。JFCR39肿瘤细胞系小组对130种不同化学物质的反应发现，大多数化合物通过共同的作用机制分离(5). NCI-60肿瘤细胞系集的早期分析确定了拓扑异构酶抑制剂和阿霉素之间增殖反应的相关模式(6). 确定负面关系对于在癌症治疗中实施药物基因组学同样重要。对5-氟尿嘧啶有反应的特定乳腺肿瘤对阿霉素和多西他赛耐药(7). 高通量筛选一组来源不同的肿瘤衍生细胞系是研究一组癌症治疗药物之间细胞疗效关系的系统。在此，我们对肿瘤细胞系对几种常见靶点的反应性进行了荟萃分析，包括(一)信号转导途径抑制剂(b)有丝分裂抑制剂，以及(c（c）)抗血管生成（补充表S1）。总体而言，反应曲线高度预测了复合治疗靶点类别。在信号通路抑制剂的情况下，反应模式对应于其靶向的致癌级联。此外，本研究探讨了个体治疗的相对特异性（例如，激酶抑制缺乏特异性）如何影响反应谱。最后，单个肿瘤类型和特定基因型（例如，具有特定突变的基因型）似乎都会影响对不同治疗靶类化合物的反应程度。

共从多家供应商购买了311种独特的癌细胞系（美国类型培养物收集；国家癌症研究所发展治疗计划；德国生物材料资源中心；欧洲动物细胞培养物收集）并生长到供应商推荐的标准培养基（补充表S2）。通常，这包括添加最终浓度为10%的胎牛血清、2 mmol/L谷氨酸和1 mmol/L-丙酮酸钠的RPMI 1640。细胞系小组的编制是为了有效地代表常见的肿瘤类型（例如，乳腺癌、肺癌和结肠癌）以及那些可能与药物开发相关的肿瘤类型。这受到某些肿瘤类型（例如前列腺癌）细胞系可用性的限制。

代表多种癌症治疗药物的19种化合物由葛兰素史克药物化学部合成或商业化获得（补充表S1）。这包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/雷帕霉素（mTOR）途径哺乳动物靶点的多种复合抑制剂(n个=5），胰岛素样生长因子-I受体（IGF-IR；n个=4），以及针对有丝分裂的(n个= 5). 此外，化合物面板中还包括几种受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂。最后，从McDermott及其同事提供的资源中下载了另外12种化合物的数据(8). 使用31个复合集进行二级聚类分析。两组共有的细胞系按名称匹配。

第一阶段。共有289个细胞系被接种到384孔的微孔板中，密度为300到3600不等（低密度和高密度），具体取决于细胞增殖速度。每个细胞系的每个密度重复三次。接种后，细胞在37°C和5%CO中培养₂24小时。通过Labcyte Echo550液体处理器将悬浮在二甲基亚砜中的总共12种化合物（补充表S1，A组）添加到细胞中，得到最终浓度为10μmol/L、3.1640μmol/L、1.0010μmol/L、316.9 nmol/L、100.3 nmol/L、31.7 nmol/L、10 nmol/L.、3.2 nmol/L:1 nmol/L/、0.3 nmol/L-0。在给药时分析一组二甲基亚砜对照物，以生成时间0数据点。对于吨=0个样品，抽吸培养基，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色，并使用InCell1000高含量分析仪测量荧光强度。剩余细胞在37°C和5%CO中培养₂72小时后，抽吸培养基，用DAPI染色细胞，并用InCell1000高含量分析仪定量。

第二阶段。使用CellTiter-Glo发光细胞活性测定试剂盒（Promega Corp.），通过测量与细胞密度对应的ATP水平，评估七种其他化合物（补充表S1，B组）对细胞活性的影响。根据对第一阶段研究中生长速率和生存能力的观察结果，选择了包含第二阶段的细胞系，该细胞系主要是第一阶段细胞系的子集。此外，在第一阶段表现出相同反应特征的遗传背景相似的细胞系（见下文）被排除在第二阶段筛查之外。与第一阶段一样，将细胞系分成三份，以两种密度接种到384孔微量滴定板中，每个密度代表该细胞系的2倍差异。如上所述，将每种化合物的10个浓度范围添加到每种培养物中。在37°C下培养72小时后，添加100μL CellTiter-Glo试剂，并使用多标签计数器（Wallac）测量发光。

将化合物处理的细胞的发光与24个DMSO处理的对照孔的平均值进行比较，对于所有一式三份的孔，在每种浓度的化合物的每种细胞密度下。在Microsoft Excel的XLfit模型205中使用百分比强度值来计算gIC₅₀低播种密度和高播种密度的值（四参数逻辑拟合；模型细节可在补充材料和方法中找到）。具体来说，增长窗口的中点（gIC₅₀)添加化合物时介于细胞数量的一半(吨=0）和用二甲基亚砜处理72小时后对照细胞的生长。gIC₅₀value是衡量癌细胞增殖抑制程度的指标。手动检查每个细胞系的每个播种密度的曲线，以检查数据质量和曲线拟合的适当性。在起始数据较差的情况下，曲线和随后的gIC₅₀数值被排除在进一步分析之外。当第页²拟合曲线值<0.75。从所有后续分析中删除质量较差的数据。

使用Affymetrix 500 K“SNP芯片”（Affymetix，Inc.）计算每个细胞系的DNA拷贝数变化。使用Mini-DNeasy试剂盒（Qiagen，Inc.）从每个品系提取DNA并纯化。用限制性内切酶消化两份等分样品（每份250 ng标准普尔或史蒂（新英格兰生物实验室）。随后将消化后的DNA连接到适配器上，并使用铂Pfx DNA聚合酶（Invitrogen）进行PCR扩增，得到约250至2000 bp的产物。对于每种酶消化物，在四个100μL的等分样品中进行PCR，汇集、纯化、定量、标准化为40μg/45μL，并用DNase I进行片段化，以获得约25至200 bp的大小范围。将片段化产物标记、变性并与Affymetrix 500 K芯片杂交。杂交完成后，使用Affymetrix流体站对每个分析进行清洗和染色。使用基因芯片扫描仪3000获取图像数据。按照Greshock及其同事的描述计算DNA拷贝数的全基因组估计值(9). 一组淋巴母细胞系(n个=20）用于校准所有癌细胞系的二倍体。此外，为了确保每个细胞系的唯一遗传身份，使用BRLMM算法计算SNP芯片基因型(10)并在所有细胞系之间进行比较。将每个细胞系的遗传指纹（即每个基因型）与集合中的所有其他细胞系进行比较。每次比较都会产生一个“百分比一致性”，表示每个细胞系的遗传相似性，其中潜在值的范围为0%到100%。同一性>80%的细胞系被认为具有类似的遗传起源。此外，将该细胞株集的基因型谱与Wellcome Trust Sanger Institute’s Cancer Genome Project发表的基因型图谱进行了比较(11). 具有类似遗传特征的细胞系见补充表S2。有关基因型比较的详细信息，请参阅补充材料和方法。

通过使用一式三份的Affymetrix U133 Plus2基因芯片对转录物丰度进行量化。简单地说，细胞系一式三份，在Trizol（Invitrogen Life Technologies Co.）中进行裂解。用氯仿捕获裂解液并使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）纯化。使用SuperScript双链cDNA合成试剂盒（Invitrogen）从5μg总RNA制备cDNA，并使用Enzo BioArray高产RNA转录标签试剂盒（Enzo Biochem，Inc.）进行扩增。最后，根据制造商的协议，将样品分割并与HG-U133 Plus2基因芯片杂交、染色和扫描。通过使用Affymetrix Microarray Analysis Suite 5.0中的mas5算法将所有探针信号强度归一化为150，估算转录物丰度。基因表达和SNP芯片数据都是公开的(12).

对于每种化合物，gIC₅₀s首先标准化为该化合物的总中位数，并转化为对数₁₀比例尺。这产生了一个缩放的增殖评分，这是一种与效力无关的比较反应谱的方法。所有随后的聚类分析都使用皮尔逊距离作为度量标准，并基于节点之间的平均距离[使用de Hoon和同事提供的代码(13)]. 使用Phylodendron软件包绘制树木(14).

尽管所有化合物至少在细胞系小组的一个子集中引发了一定程度的生长抑制，但整个化合物组的反应曲线是不同的（补充表S2；gIC摘要₅₀中的值表1). 例如，BEZ-235表现出较强的诱导增殖抑制能力，其中96%（188/196）的品系具有gIC₅₀s<500 nmol/L。相比之下，很少有细胞株对帕佐帕尼表现出这样的反应水平（263例中的9例；3%）。总的来说，抗有丝分裂化合物组在化合物类别中诱导了相对较高的生长抑制。在每种情况下，总中值（Q₂; 第50百分位）<150 nmol/L。此外，抗有丝分裂剂表现出与其他化合物不同的反应谱，其中高反应性的大多数细胞系强烈偏离少数反应性较低的细胞系。例如，平均gIC₅₀对于所有线<Q_三PLK1抑制剂GSK461364的（75%）为7.6 nmol/L，而那些>Q_三为258 nmol/L(图1A和C). 相比之下，尽管动态范围类似于GSK461364，但双ERBB1/2 RTK抑制剂拉帕替尼的反应线很少，平均gIC₅₀对于<Q的₁为1888 nmol/L，只有5.2%（267人中的13人）有gIC₅₀<150 nmol/L的s(图1B). 这表明抑制有丝分裂在减缓细胞增殖方面更加有效在体外肿瘤模型。相反，与其他类别相比，PI3K/AKT/mTOR途径的抑制剂表现出更多样的效力，其中Q_三范围从<150 nmol/L（BEZ-235）到>10000 nmol/L.（毒死蜱）。这种巨大的差异可能是独特的靶向策略（即，在路径中的位置）和该路径抑制剂之间的差异效力的结果。

相似靶类化合物通过其中位数增殖抑制分数的层次聚类进行关联(图2). 换句话说，特定的化合物靶类可以预测哪些特定细胞系对药物浓度的增加最敏感。相似靶类化合物之间的总体相关性程度在一定程度上可能是每个细胞系对不同致癌途径激活的生长和生存依赖性的不同水平的表现。这一事实表明，由于相似的细胞株亚群表现出高度的剂量依赖性反应，共同分子靶类化合物聚集在一起。例如，IGF-IR的所有四种抑制剂因强相关而聚集在一起在体外轮廓[平均皮尔逊距离为0.34（±0.10；n个=6）与总平均距离0.88（±0.19；n个= 145);图2，集群A]。相反，尽管五种靶向PI3K/AKT/mTOR通路的药物中有四种确实聚集在一起(图2与IGF-IR抑制剂相比，它们的相关性要弱得多（平均距离=0.63±0.15；n个= 10). 这可能反映了这组化合物靶向这一途径的方法更加多样化，或者这些靶点（PI3K/AKT/mTOR）都有稍微独特的信号转导结果。AKT和mTOR的选择性抑制剂直接靶向PI3K下游的通路。本研究中的两种泛异型PI3K抑制剂BEZ-235和GSK1059615对mTOR激酶有显著的直接抑制作用，这使得它们的反应谱与其他途径抑制剂的关系更加复杂。这些抑制剂之间的相关性不是由结构相似性驱动的。例如，该抑制剂组中两个相关性更强的成员，AKT抑制剂GSK690693和PI3K抑制剂GSK1059615（皮尔逊距离=0.54），在结构上是不同的（补充表S3）。有丝分裂抑制化合物（PLK/AURK/CENPE/微管蛋白）也密切相关，其中C簇的五个成员中的五个(图2)属于这一类。两两比较的平均皮尔逊距离为0.56（±0.11；n个= 10). 这些化合物的特定有丝分裂靶点在很大程度上是独特的，它们的聚集与先前的观察一致，即靶向的生物过程（本例中为有丝分裂）可以驱动细胞反应的相似性(15). 少数增殖不受抗有丝分裂药物治疗影响的细胞系有助于定义这种复合簇。例如，这些线的高相关性>Q_三有助于GSK461364和紫杉醇之间的相关性(图1C)，经χ检验具有统计学显著性关系²按四分位数（γ=0.34，P（P）= 0.002;图1D; 裁判。16). 有利于高细胞增殖率的培养基条件可能会对那些靶向有丝分裂的化合物产生人为的高反应率(17).

聚类分析还表明了不属于这些主要类别之一的化合物的反应谱之间的逻辑关系。例如，与PI3K/AKT/mTOR簇最接近的成员是拉帕替尼，它是通过PI3K发出信号的ERBB1/2 RTK的抑制剂。ERBB1/2的基因组畸变与细胞对拉帕替尼的反应相关(2)，可以激活PI3K信号传导。相反，通过突变直接激活PI3KPIK3CA公司对另一种ERBB2上游抑制剂曲妥珠单抗产生耐药性(18). 换言之，对PI3K/AKT抑制有反应的部分（但不是全部）细胞系对ERBB1/2 RTK上游抑制没有反应。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外信号调节激酶（ERK）激酶（MEK）抑制剂GSK1120212的聚集与那些靶向PI3K/AKT/mTOR通路和拉帕替尼的化合物是分开的。这种关系可能是由于激活的RAS/RAF在那些对MEK抑制反应更灵敏的细胞中具有高度重要性(19).

根据McDermott及其同事提出的12种化合物的额外增殖抑制数据，对初始研究中的19种化合物进行重新分类(8)进一步说明治疗靶点选择性可以预测细胞系反应谱(图3). 例如，含有ERBB1抑制剂厄洛替尼和ERBB1/2抑制剂HKI-272的淋巴结与组织学多样性细胞系中的其他RTK抑制剂拉帕替尼（簇D）聚集在一起(n个= 117). 此外，针对极光激酶（AURK）的唯一附加有丝分裂抑制剂MK0457与其他五种有丝分裂抑制物聚集在一起。同样，c-MET抑制剂PHA665752与GSK1363089（foretinib）聚集，而RAF抑制剂AZ628与MEK抑制剂GSK1120212聚集。尽管这些结果表明，主要靶点是总细胞系反应谱的主要驱动因素，但对其他靶点的有效抑制和选择性程度在这些关系中起着作用。已知四种化合物中只有两种能有效抑制血管内皮生长因子（VEGF）成分（帕佐帕尼、福雷替尼、舒尼替尼和索拉非尼）聚集在一起(图3，集群E）。舒尼替尼是血管内皮生长因子受体（VEGFR）和血小板衍生生长因子受体的有效抑制剂(20)，与帕佐帕尼簇合。索拉非尼是VEGFR、RAF和许多其他激酶的有效抑制剂(21)，不与VEGFR的其他抑制剂聚集。这并不奇怪，因为对这三种肿瘤血管抑制因子的直接比较表明，每种抑制剂都能有效抑制一组已知参与肿瘤发生和发展的独特激酶(22). 抑制这些额外的激酶可能会驱动增殖反应，因为细胞株在二维细胞培养中不能作为肿瘤血管系统的忠实模型。就索拉非尼而言，该化合物特有的激酶的抑制（与福雷替尼和舒尼替尼相比）在决定细胞反应方面更为关键在体外此外，尽管舒尼替尼和索拉非尼在细胞因子难治性肾癌二线治疗中表现出相当的疗效(23)目前尚不清楚同样的患者是否会从每种治疗中受益。

簇群之间的关系也显示了细胞系反应的合理模式，这些模式与靶细胞没有直接关系，而是与细胞信号的级联有关。例如，除了SRC抑制剂AZD0530外，RTK的抑制剂ERBB1/2也选择性抑制表皮生长因子受体（EGFR）激活细胞的生长(8)]，与PI3K/AKT/mTOR抑制剂簇合。虽然已经证实，这些化合物（ERBB1/2）抑制的RTK调节许多人类癌症中的PI3K/AKT/mTOR，但PI3K/AKT/mTOR活性与RTK抑制的临床反应之间的关系是复杂的，只有部分了解。例如，激活PIK3CA公司基因赋予EGFR抑制抗性(24)同时与直接靶向PI3K的化合物的敏感性相关(25).

观察到的化合物类别聚类关联与之前的药物基因组研究一致，表明细胞对治疗药物的反应取决于基因型和细胞来源(8). 当考虑19种化合物（至少由15种细胞系代表的组织类型）原始组中乳腺、结肠、肺和造血起源细胞的反应数据时，PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂显示出更高的抑制乳腺细胞生长的选择性(图4). 在这个细胞系小组中显示出很少生长抑制的副膦是唯一的例外。这类化合物有望选择性抑制乳腺癌细胞的生长，因为这一途径经常被以下基因突变激活PIK3CA公司(26)对促进乳腺癌细胞生长具有重要意义(27). 因此，乳腺癌可能是这类新兴疗法的良好临床靶点。同样，与其他肿瘤类型相比，四种IGF-IR抑制剂中的四种表现出对结肠癌细胞系的一致选择性。与其他肿瘤类型相比，IGF-IR在结肠癌细胞中的优先抑制效果与在结肠癌中经常观察到的IGF-IR表达一致，而其他肿瘤类型中IGF-IR并不促进肿瘤发生(28).

雌激素受体（ER）的过度表达可刺激约70%乳腺癌的细胞分裂和DNA复制，可作为诊断和治疗的病理标志。乳腺癌管腔A亚型与其他分子亚型的区别主要通过ER的过度表达和ERBB2号机组(29). 这些标记物对乳腺癌的预后和生存有深远的影响(18)与细胞对达沙替尼等治疗药物的反应相关(30)和拉帕替尼(2). 因此，ER过度表达的乳腺癌细胞株与ER低表达的细胞株分离也就不足为奇了(P（P）=0.010，费希尔精确试验；图5). 考虑到Sorlie及其同事定义的分子分类，这种关系更加紧密(29)其中，七分之六（86%）和九分之九（100%）的基底和管腔亚型细胞系与其各自的原发肿瘤亚型聚集在一起(P（P）= 0.0009). 值得注意的是，管腔细胞优先对AKT抑制剂GSK690693和PI3K抑制剂GSK1069615作出反应，而MEK抑制剂GSK1120212选择性抑制基底部乳腺癌的增殖。这一结果并不奇怪，因为PI3K激活可以介导对MEK抑制的抵抗(31). 尽管总体而言，这表明在乳腺癌中靶向这些通路的临床路径存在很大差异，但MAPK和PI3K的共同抑制可能对基础亚型尤其有效(32). 中的突变PIK3CA公司和PTEN公司似乎与复合簇没有关联(P（P）>0.05），表明这些变化对ER和ERBB2号机组在确定哪些细胞系对这组不同的化合物反应更灵敏时。同样，当分析肿瘤类型时KRAS公司突变（结肠癌和胰腺癌），这些细胞系含有突变KRAS公司倾向于聚集在一起(P（P）=0.14，Fisher精确检验；补充图S1）。在区分港口时，这一趋势更加深刻KRAS公司野生型突变PIK3CA公司(P（P）=0.008，Fisher精确测试）。独特的敏感性曲线KRAS公司-突变细胞系是一个预期结果，因为该基因的突变与临床反应模式相关，例如对EGFR抑制剂的耐药性(33). 事实上，并非所有KRAS公司-突变肿瘤聚集在一起也与之前的观察结果一致，即与KRAS公司可以驱动细胞对治疗的反应，例如协同作用的关联LKB1/KRAS公司MEK抑制反应更灵敏的突变(34).

这项研究表明，尽管癌症治疗药物的激酶选择性可能有很大差异(三)，这些治疗的主要靶点在以剂量依赖的方式确定抑制细胞增殖方面起着主要作用在体外靶向共同致癌途径的多种抑制剂之间的浓度-反应谱相似性强调了抑制该特定途径是一种关键的细胞反应机制。此外，不同治疗靶类（例如PI3K/AKT/mTOR与IGF-IR）的独特但一致的特征暗示了这些化合物的不同临床策略。大量肿瘤衍生细胞系显示出对具有特定肿瘤类型的分子靶类的反应亲和力（乳腺癌和结肠癌细胞分别使用PI3K/AKT/mTOR和IGF-IR抑制剂的情况也是如此）。此外，不同类别间的细胞反应谱显示出基因型特异性，例如腔/基底部乳腺癌细胞在不同靶类化合物间的聚集。这些结果还表明，细胞培养在药物反应方面是原发性肿瘤的一个非常可靠的模型，特别是对于那些靶向信号转导途径的化合物。相反，超生理生长条件可能会阻碍某些复合靶类药物反应的准确建模，例如那些旨在抑制有丝分裂的靶类药物。这一概念在未来癌症药物开发中可能变得越来越重要，因为靶类扩大到包括那些选择性阻碍肿瘤代谢的靶类，因为特定的细胞培养条件可以极大地影响代谢活动(35). 总的来说，在组织学和遗传变异的细胞系人群中高通量筛选癌症治疗药物可以模拟临床反应曲线，并确定可能从特定治疗方案中受益最大的肿瘤类型和基因型。

所有作者都是葛兰素史克公司的股东。

我们感谢Adam Butler、Jon Teague和Mike Stratton（Wellcome Trust Sanger Institute）在细胞系基因型匹配和突变数据管理方面的帮助。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，必须在此标记此物品广告根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。